小尾寒羊KAP6.4基因PCR-SSCP分析

■楊佳棟 魏鳳菊 劉月琴 張英杰

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定 071001；2.巴音郭楞職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，新疆庫(kù)爾勒 841000；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071001）

角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白(Keratin associated proteins，KAPs)是組成動(dòng)物毛發(fā)主要結(jié)構(gòu)的成分之一。根據(jù)氨基酸組成，KAPs可分為3個(gè)亞家族:高硫KAPs（KAP1.n、KAP2.n、KAP3.n）、超高硫 KAPs（KAP4.n、KAP5.n、KAP10.n）和高甘氨酸/酪氨酸KAPs（KAP6.n、KAP7.n、KAP8.n），各亞家族均為多基因編碼。KAPs對(duì)毛發(fā)的品質(zhì)有重要的影響作用。國(guó)內(nèi)外的大量研究證實(shí)了KAPs基因與產(chǎn)毛性狀的相關(guān)性。其中高甘氨酸/酪氨酸KAPs與羊毛的特性有較大的關(guān)系；在高甘氨酸/酪氨酸KAPs亞家族中，KAP6.n和KAP8.n與羊毛產(chǎn)量及毛纖維直徑具有明顯的相關(guān)性，推測(cè)它們可能是控制羊毛直徑的主效基因。KAP6.n成員是絨毛重要的基質(zhì)蛋白。研究表明，KAP6.n成員與羊毛性狀有密切關(guān)系，如果這些基因發(fā)生突變，可能會(huì)影響自身表達(dá)，同時(shí)其編碼的蛋白質(zhì)也可能影響到羊毛的特性。不同品種的羊，高甘氨酸/酪氨酸KAPs表達(dá)有很大差異，這種蛋白差異對(duì)羊毛品質(zhì)具有決定性作用。在KAP6.n成員中，已有大量的研究報(bào)道，如不同羊品種中KAP6.1、KAP6.2、KAP6.3均呈現(xiàn)多態(tài)性。KAP6.1可作為優(yōu)質(zhì)細(xì)毛羊羊毛細(xì)度以及遼寧絨山羊產(chǎn)絨量性狀的顯著性標(biāo)記。KAP6.2基因在陜北絨山羊中有24 bp堿基缺失，被看作是造成陜北絨山羊產(chǎn)絨量高的原因。吳玉江等研究證明，KAP6.3可能是影響西藏絨山羊生產(chǎn)性能的主效基因。目前關(guān)于KAP6.4基因的研究還鮮有研究，它與毛發(fā)結(jié)構(gòu)的關(guān)系也知之甚少。

小尾寒羊(Small-tail Han Sheep,Ovis aries)是國(guó)家定的名畜良種，是我國(guó)肉裘兼用型綿羊品種，是發(fā)展畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)重要的畜種。小尾寒羊本身具有多胎高產(chǎn)的特點(diǎn)，其毛色潔白如玉，光澤柔和，花彎扭結(jié)緊密，可作為裘用，同時(shí)也可用于不同要求的精紡和粗紡加工。目前對(duì)于小尾寒羊這個(gè)地方品種毛發(fā)性狀相關(guān)基因的研究較少。本研究以小尾寒羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)材料，利用PCR-SSCP技術(shù)，通過(guò)克隆KAP6.4基因編碼區(qū)序列，尋找突變位點(diǎn)，分析基因的多態(tài)性，以期為深入研究KAPs基因與產(chǎn)毛性狀的關(guān)系提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)選用河北省唐縣華宇肉羊養(yǎng)殖有限公司的46只小尾寒羊。采集羊血液，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.1 引物

根據(jù)NCBI公布的綿羊(Ovis aries)KAP6.4基因序列設(shè)計(jì)引物，PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為297 bp，序列如下：KAP6.4F:5′-AACAACCTCA ACAACCAACACC-3′；KAP6.4R:5′-GATG AGAGTCTTCCG TGGCAT-3′。

1.1.2 試劑與儀器

Taq聚合酶、dNTP、DNA marker、膠回收試劑盒、pMD18-T Vector均為大連寶生物（TaKaRa）工程有限公司產(chǎn)品；質(zhì)?；厥赵噭┖小NA提取試劑盒為全式金生物技術(shù)（TransGene Biotech）公司產(chǎn)品。PCR儀(IBA)；電泳儀(北京君意儀器廠)；凝膠成像系統(tǒng)(BIORAD)。

1.2 方法

基因組DNA的提?。夯蚪MDNA提取參照全式金DNA提取方案進(jìn)行。

PCR擴(kuò)增：反應(yīng)體系50 μl，其中模板DNA 5 μl，上下游引物各 5 μl，Taq 酶 0.25 μl，dNTP 5 μl，10×Taq Buffer 5 μl，ddH2O 24.75 μl。反應(yīng)條件為94 ℃5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃5 min；4℃保持。擴(kuò)增片段大小為297 bp，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.3 SSCP分析

5 μl PCR產(chǎn)物加入5 μl上樣緩沖液混合。樣品在12%非變性聚丙烯酰胺凝膠中4℃條件下160 V電泳6 h。電泳結(jié)束后，按照生工銀染試劑盒方法進(jìn)行銀染顯色，凝膠成像系統(tǒng)照相，進(jìn)行單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）分析。

1.4 PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增與測(cè)序

將PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)，用膠回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化回收，連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a菌株，通過(guò)PCR選擇陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切驗(yàn)證正確后，樣品送上海生工生物工程股份有限公司北京分公司測(cè)序。

1.5 序列分析

測(cè)序結(jié)果用DNAMAN 6.0、ClustalX和Blast進(jìn)行序列比對(duì)分析，確定突變位置，分析突變類型。

2 結(jié)果

2.1 KAP6.4基因PCR擴(kuò)增

以血液提取的DNA為模板，擴(kuò)增KAP6.4基因部分編碼區(qū)片斷，PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在262 bp出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，與預(yù)期片段大小一致(圖1)，說(shuō)明成功擴(kuò)增小尾寒羊KAP6.4基因。

圖1 PCR擴(kuò)增KAP6.4基因

2.2 PAGE結(jié)果（見(jiàn)圖2）

圖2 小尾寒羊KAP6.4 SSCP檢測(cè)

從PAGE電泳可見(jiàn)，14%PAGE能夠區(qū)分KAP6.4基因的不同基因型，圖2顯示，小尾寒羊KAP6.4基因?yàn)?種不同長(zhǎng)度的基因片段組成，存在2種基因型，根據(jù)基因片斷大小將不同基因型分別命名為AA型、AB型。

2.3 KAP6.4基因序列分析（見(jiàn)圖3）

通過(guò)對(duì)2種KAP6.4基因型個(gè)體PCR產(chǎn)物克隆、陽(yáng)性克隆的基因測(cè)序，證實(shí)已正確克隆KAP6.4基因。測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAMAN軟件分析表明：該基因與Genebank登錄的序列相比，AA型沒(méi)有發(fā)生突變。AB型最大的差異是存在編碼區(qū)128位增添了36 bp的核苷酸，這一結(jié)果正解釋了PAGE電泳中較大的條帶是由于核苷酸增多導(dǎo)致（見(jiàn)圖2）。如圖3a所示，2種KAP6.4基因型個(gè)體的序列比對(duì)圖，可見(jiàn)AB型還出現(xiàn)了以下7處核苷酸突變：51(T-C)，52(G-A)，135(C-T)，158(A-G)，162(C-A)，163(T-A)，177(T-C)。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，其中51(T-C)、135(C-T)、162(C-T)、177(T-C)4處屬于簡(jiǎn)并突變，并未造成氨基酸的變異；3處氨基酸突變分別為：G18S、Y54C、C56S，如圖3b。

圖3 小尾寒羊KAP6.4序列比對(duì)圖

2.4 基因型頻率與基因頻率分析

根據(jù)以上的SSCP結(jié)果，計(jì)算小尾寒羊KAP6.4基因2種基因型的等位基因型頻率，其中，AA基因型個(gè)體最多，達(dá)到35只，基因型頻率為0.778；AB基因型個(gè)體數(shù)為10只，基因型頻率為0.222，其中A等位基因頻率為0.889，B等位基因頻率為0.111。以上結(jié)果說(shuō)明，小尾寒羊群體中KAP6.4基因以AA型為主。

3 討論

關(guān)于高甘氨酸/酪氨酸成員的研究中，KAP6.n，KAP7.n和KAP8.n的報(bào)道較多。其中，關(guān)于KAP6.n的研究居多，且比較深入。KAP6.n亞家族成員在羊毛皮質(zhì)層垂直分布，這些成員都定位在羊的1號(hào)染色體上。目前對(duì)高甘氨酶酸/酪氨酸KAP6.n的大量研究主要集中在多態(tài)性檢測(cè)，目的是為進(jìn)一步篩選毛、絨用候選基因打下基礎(chǔ)。大量研究闡釋了羊KAPs基因的多態(tài)性與產(chǎn)毛性狀之間存在關(guān)聯(lián)，如KAP6.1可作為優(yōu)質(zhì)細(xì)毛羊羊毛細(xì)度的顯著性標(biāo)記，KAP6.n和羊毛直徑有關(guān)。本研究通過(guò)對(duì)小尾寒羊KAP6.4基因進(jìn)行的多態(tài)性分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小尾寒羊KAP6.4基因?yàn)锳A、AB兩種基因型，這為將來(lái)進(jìn)進(jìn)一步深入探討KAP6.4基因與羊毛性狀之間的關(guān)系提供了有價(jià)值的信息。

小尾寒羊生產(chǎn)裘皮和羔皮歷史悠久，后來(lái)由于市場(chǎng)行情變動(dòng)，導(dǎo)致小尾寒羊主要向肉用方向選育。然而21世紀(jì)裘皮市場(chǎng)的繁榮，加上小尾寒羊本身多胎高產(chǎn)的特點(diǎn)，加強(qiáng)裘皮類型品系的選育可為市場(chǎng)需求注入活力。關(guān)于KAP6.n基因遺傳多樣性與遺傳育種關(guān)系的研究，為羊優(yōu)良品系選育提供了理論支持；目前，我國(guó)在絨毛用羊分子育種方面的研究還相對(duì)較少，這是將來(lái)我國(guó)羊育種應(yīng)該加強(qiáng)的方向。研究顯示，外源性IGF-I(胰島素樣生長(zhǎng)因子-I)對(duì)綿羊KAP3.2與KAP6.1的表達(dá)有顯著的促進(jìn)作用，KAP6.n與絨毛性狀關(guān)系密不可分，這啟示我們可以通過(guò)施加外源物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)毛發(fā)性狀的調(diào)控。值得一提的是，KAPs除了與絨質(zhì)量顯著有關(guān)外，一些成員還與羊的體重有關(guān)。小尾寒羊是肉裘兼用型品種，從分子水平對(duì)KAPs家族成員開(kāi)展深入研究，對(duì)小尾寒羊的遺傳育種會(huì)有重大的推動(dòng)作用。

4 結(jié)論

本研究經(jīng)過(guò)對(duì)小尾寒羊KAP6.4基因AA、AB兩種基因型分析，表明AA基因型個(gè)體最多，基因型頻率為0.778，證實(shí)在小尾寒羊群體中KAP6.4基因以AA基因型為主；AB基因型存在7個(gè)位點(diǎn)核苷酸突變，同時(shí)增添36 bp核苷酸。以上研究結(jié)果表明KAP6.4基因在小尾寒羊中存在基因多態(tài)性。

（參考文獻(xiàn)18篇，刊略，需者可函索）