■楊佳棟 魏鳳菊 劉月琴 張英杰
(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,河北保定 071001;2.巴音郭楞職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院,新疆庫(kù)爾勒 841000;3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北保定 071001)
角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白(Keratin associated proteins,KAPs)是組成動(dòng)物毛發(fā)主要結(jié)構(gòu)的成分之一。根據(jù)氨基酸組成,KAPs可分為3個(gè)亞家族:高硫KAPs(KAP1.n、KAP2.n、KAP3.n)、超高硫 KAPs(KAP4.n、KAP5.n、KAP10.n)和高甘氨酸/酪氨酸KAPs(KAP6.n、KAP7.n、KAP8.n),各亞家族均為多基因編碼。KAPs對(duì)毛發(fā)的品質(zhì)有重要的影響作用。國(guó)內(nèi)外的大量研究證實(shí)了KAPs基因與產(chǎn)毛性狀的相關(guān)性。其中高甘氨酸/酪氨酸KAPs與羊毛的特性有較大的關(guān)系;在高甘氨酸/酪氨酸KAPs亞家族中,KAP6.n和KAP8.n與羊毛產(chǎn)量及毛纖維直徑具有明顯的相關(guān)性,推測(cè)它們可能是控制羊毛直徑的主效基因。KAP6.n成員是絨毛重要的基質(zhì)蛋白。研究表明,KAP6.n成員與羊毛性狀有密切關(guān)系,如果這些基因發(fā)生突變,可能會(huì)影響自身表達(dá),同時(shí)其編碼的蛋白質(zhì)也可能影響到羊毛的特性。不同品種的羊,高甘氨酸/酪氨酸KAPs表達(dá)有很大差異,這種蛋白差異對(duì)羊毛品質(zhì)具有決定性作用。在KAP6.n成員中,已有大量的研究報(bào)道,如不同羊品種中KAP6.1、KAP6.2、KAP6.3均呈現(xiàn)多態(tài)性。KAP6.1可作為優(yōu)質(zhì)細(xì)毛羊羊毛細(xì)度以及遼寧絨山羊產(chǎn)絨量性狀的顯著性標(biāo)記。KAP6.2基因在陜北絨山羊中有24 bp堿基缺失,被看作是造成陜北絨山羊產(chǎn)絨量高的原因。吳玉江等研究證明,KAP6.3可能是影響西藏絨山羊生產(chǎn)性能的主效基因。目前關(guān)于KAP6.4基因的研究還鮮有研究,它與毛發(fā)結(jié)構(gòu)的關(guān)系也知之甚少。
小尾寒羊(Small-tail Han Sheep,Ovis aries)是國(guó)家定的名畜良種,是我國(guó)肉裘兼用型綿羊品種,是發(fā)展畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)重要的畜種。小尾寒羊本身具有多胎高產(chǎn)的特點(diǎn),其毛色潔白如玉,光澤柔和,花彎扭結(jié)緊密,可作為裘用,同時(shí)也可用于不同要求的精紡和粗紡加工。目前對(duì)于小尾寒羊這個(gè)地方品種毛發(fā)性狀相關(guān)基因的研究較少。本研究以小尾寒羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)材料,利用PCR-SSCP技術(shù),通過(guò)克隆KAP6.4基因編碼區(qū)序列,尋找突變位點(diǎn),分析基因的多態(tài)性,以期為深入研究KAPs基因與產(chǎn)毛性狀的關(guān)系提供理論支持。
實(shí)驗(yàn)選用河北省唐縣華宇肉羊養(yǎng)殖有限公司的46只小尾寒羊。采集羊血液,-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.1.1 引物
根據(jù)NCBI公布的綿羊(Ovis aries)KAP6.4基因序列設(shè)計(jì)引物,PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成,擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為297 bp,序列如下:KAP6.4F:5′-AACAACCTCA ACAACCAACACC-3′;KAP6.4R:5′-GATG AGAGTCTTCCG TGGCAT-3′。
1.1.2 試劑與儀器
Taq聚合酶、dNTP、DNA marker、膠回收試劑盒、pMD18-T Vector均為大連寶生物(TaKaRa)工程有限公司產(chǎn)品;質(zhì)?;厥赵噭┖小NA提取試劑盒為全式金生物技術(shù)(TransGene Biotech)公司產(chǎn)品。PCR儀(IBA);電泳儀(北京君意儀器廠);凝膠成像系統(tǒng)(BIORAD)。
基因組DNA的提?。夯蚪MDNA提取參照全式金DNA提取方案進(jìn)行。
PCR擴(kuò)增:反應(yīng)體系50 μl,其中模板DNA 5 μl,上下游引物各 5 μl,Taq 酶 0.25 μl,dNTP 5 μl,10×Taq Buffer 5 μl,ddH2O 24.75 μl。反應(yīng)條件為94 ℃5 min;94 ℃ 30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃ 30 s,30個(gè)循環(huán);72℃5 min;4℃保持。擴(kuò)增片段大小為297 bp,經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。
5 μl PCR產(chǎn)物加入5 μl上樣緩沖液混合。樣品在12%非變性聚丙烯酰胺凝膠中4℃條件下160 V電泳6 h。電泳結(jié)束后,按照生工銀染試劑盒方法進(jìn)行銀染顯色,凝膠成像系統(tǒng)照相,進(jìn)行單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析。
將PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè),用膠回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化回收,連接pMD18-T載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a菌株,通過(guò)PCR選擇陽(yáng)性克隆,提取質(zhì)粒,經(jīng)酶切驗(yàn)證正確后,樣品送上海生工生物工程股份有限公司北京分公司測(cè)序。
測(cè)序結(jié)果用DNAMAN 6.0、ClustalX和Blast進(jìn)行序列比對(duì)分析,確定突變位置,分析突變類型。
以血液提取的DNA為模板,擴(kuò)增KAP6.4基因部分編碼區(qū)片斷,PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),在262 bp出現(xiàn)擴(kuò)增條帶,與預(yù)期片段大小一致(圖1),說(shuō)明成功擴(kuò)增小尾寒羊KAP6.4基因。
圖1 PCR擴(kuò)增KAP6.4基因
圖2 小尾寒羊KAP6.4 SSCP檢測(cè)
從PAGE電泳可見(jiàn),14%PAGE能夠區(qū)分KAP6.4基因的不同基因型,圖2顯示,小尾寒羊KAP6.4基因?yàn)?種不同長(zhǎng)度的基因片段組成,存在2種基因型,根據(jù)基因片斷大小將不同基因型分別命名為AA型、AB型。
通過(guò)對(duì)2種KAP6.4基因型個(gè)體PCR產(chǎn)物克隆、陽(yáng)性克隆的基因測(cè)序,證實(shí)已正確克隆KAP6.4基因。測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAMAN軟件分析表明:該基因與Genebank登錄的序列相比,AA型沒(méi)有發(fā)生突變。AB型最大的差異是存在編碼區(qū)128位增添了36 bp的核苷酸,這一結(jié)果正解釋了PAGE電泳中較大的條帶是由于核苷酸增多導(dǎo)致(見(jiàn)圖2)。如圖3a所示,2種KAP6.4基因型個(gè)體的序列比對(duì)圖,可見(jiàn)AB型還出現(xiàn)了以下7處核苷酸突變:51(T-C),52(G-A),135(C-T),158(A-G),162(C-A),163(T-A),177(T-C)。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn),其中51(T-C)、135(C-T)、162(C-T)、177(T-C)4處屬于簡(jiǎn)并突變,并未造成氨基酸的變異;3處氨基酸突變分別為:G18S、Y54C、C56S,如圖3b。
圖3 小尾寒羊KAP6.4序列比對(duì)圖
根據(jù)以上的SSCP結(jié)果,計(jì)算小尾寒羊KAP6.4基因2種基因型的等位基因型頻率,其中,AA基因型個(gè)體最多,達(dá)到35只,基因型頻率為0.778;AB基因型個(gè)體數(shù)為10只,基因型頻率為0.222,其中A等位基因頻率為0.889,B等位基因頻率為0.111。以上結(jié)果說(shuō)明,小尾寒羊群體中KAP6.4基因以AA型為主。
關(guān)于高甘氨酸/酪氨酸成員的研究中,KAP6.n,KAP7.n和KAP8.n的報(bào)道較多。其中,關(guān)于KAP6.n的研究居多,且比較深入。KAP6.n亞家族成員在羊毛皮質(zhì)層垂直分布,這些成員都定位在羊的1號(hào)染色體上。目前對(duì)高甘氨酶酸/酪氨酸KAP6.n的大量研究主要集中在多態(tài)性檢測(cè),目的是為進(jìn)一步篩選毛、絨用候選基因打下基礎(chǔ)。大量研究闡釋了羊KAPs基因的多態(tài)性與產(chǎn)毛性狀之間存在關(guān)聯(lián),如KAP6.1可作為優(yōu)質(zhì)細(xì)毛羊羊毛細(xì)度的顯著性標(biāo)記,KAP6.n和羊毛直徑有關(guān)。本研究通過(guò)對(duì)小尾寒羊KAP6.4基因進(jìn)行的多態(tài)性分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,小尾寒羊KAP6.4基因?yàn)锳A、AB兩種基因型,這為將來(lái)進(jìn)進(jìn)一步深入探討KAP6.4基因與羊毛性狀之間的關(guān)系提供了有價(jià)值的信息。
小尾寒羊生產(chǎn)裘皮和羔皮歷史悠久,后來(lái)由于市場(chǎng)行情變動(dòng),導(dǎo)致小尾寒羊主要向肉用方向選育。然而21世紀(jì)裘皮市場(chǎng)的繁榮,加上小尾寒羊本身多胎高產(chǎn)的特點(diǎn),加強(qiáng)裘皮類型品系的選育可為市場(chǎng)需求注入活力。關(guān)于KAP6.n基因遺傳多樣性與遺傳育種關(guān)系的研究,為羊優(yōu)良品系選育提供了理論支持;目前,我國(guó)在絨毛用羊分子育種方面的研究還相對(duì)較少,這是將來(lái)我國(guó)羊育種應(yīng)該加強(qiáng)的方向。研究顯示,外源性IGF-I(胰島素樣生長(zhǎng)因子-I)對(duì)綿羊KAP3.2與KAP6.1的表達(dá)有顯著的促進(jìn)作用,KAP6.n與絨毛性狀關(guān)系密不可分,這啟示我們可以通過(guò)施加外源物質(zhì),實(shí)現(xiàn)對(duì)毛發(fā)性狀的調(diào)控。值得一提的是,KAPs除了與絨質(zhì)量顯著有關(guān)外,一些成員還與羊的體重有關(guān)。小尾寒羊是肉裘兼用型品種,從分子水平對(duì)KAPs家族成員開(kāi)展深入研究,對(duì)小尾寒羊的遺傳育種會(huì)有重大的推動(dòng)作用。
本研究經(jīng)過(guò)對(duì)小尾寒羊KAP6.4基因AA、AB兩種基因型分析,表明AA基因型個(gè)體最多,基因型頻率為0.778,證實(shí)在小尾寒羊群體中KAP6.4基因以AA基因型為主;AB基因型存在7個(gè)位點(diǎn)核苷酸突變,同時(shí)增添36 bp核苷酸。以上研究結(jié)果表明KAP6.4基因在小尾寒羊中存在基因多態(tài)性。
(參考文獻(xiàn)18篇,刊略,需者可函索)