微生物接種劑及延遲密封對玉米秸稈青貯品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性的影響

■左颯颯 牛東澤 鄭明利 江 迪 徐春城

(中國農(nóng)業(yè)大學工學院，北京100083)

根據(jù)農(nóng)業(yè)部種植業(yè)管理司的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，我國2014年的玉米產(chǎn)量為21 565萬噸[1]，按照玉米籽粒與秸稈1∶1.2的比例推算，2014年我國玉米秸稈的產(chǎn)量為25 878萬噸。玉米秸稈是反芻動物重要的粗飼料資源，然而，在我國每年約1/4的秸稈被直接焚燒[2]，既浪費資源，又污染環(huán)境。玉米秸稈由于可溶性碳水化合物含量低，木質(zhì)纖維素含量高，消化性差等營養(yǎng)缺陷，導致其飼料利用率較低。因此，通過現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生物技術和發(fā)酵工程技術手段改善玉米秸稈營養(yǎng)價值、提高秸稈利用效率逐漸成為研究熱點[3-5]。

生物接種劑主要包括微生物制劑和酶制劑。添加微生物制劑的目的是依靠以乳酸菌為主的有益菌，迅速將青綠飼料中的可溶性碳水化合物（WSC）轉化為有機酸（主要為乳酸），使青貯飼料的pH值迅速下降，抑制其他好氧微生物對青綠飼料營養(yǎng)成分的分解作用，從而使青綠飼料得以保存[6]。而添加纖維素酶制劑則使飼料中的纖維素在纖維素酶的作用下，部分被酶解轉化為WSC，作為乳酸菌（LAB）的發(fā)酵底物[7]，從而提高青貯的發(fā)酵品質(zhì)。青貯飼料開封后，由于好氧細菌、酵母、霉菌的活動，導致飼料發(fā)生好氧變質(zhì)，其主要表現(xiàn)為溫度、pH值上升以及真菌菌斑的出現(xiàn)等[8]。通常情況下，當開封后青貯飼料的溫度高于環(huán)境溫度2℃視為變質(zhì)，并且從開封到溫度上升2℃所用的時間長短來衡量青貯飼料有氧穩(wěn)定性的好壞[9]。

本試驗旨在通過向新鮮玉米秸稈中添加具有分解纖維素能力的霉菌，在延遲密封的過程中，將玉米秸稈中的部分纖維素降解為可溶性糖，為乳酸菌提供發(fā)酵底物，加速乳酸菌發(fā)酵進程，以期提高玉米秸稈的青貯品質(zhì)。并通過開封后有機酸、pH值以及溫度的檢測，評價微生物接種劑和延遲密封對青貯玉米秸稈有氧穩(wěn)定性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 玉米秸稈

試驗原料取自江西省修水縣中國農(nóng)業(yè)大學修水教授工作站，完熟期新鮮玉米秸稈。

1.1.2 微生物接種劑

試驗所用乳酸菌為本實驗室分離純化的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum KM005155）。所用霉菌為黑曲霉（Aspergillus nigerCGMCC 3.1858）和里氏木霉（Trichoderma reeseiCGMCC 3.3711），購于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2 試驗設計

采用隨機區(qū)組設計，設對照組（CK）和乳酸菌組（LAB）、黑曲霉+乳酸菌組（As+LAB）、里氏木霉+乳酸菌組（Tr+LAB）以及黑曲霉+里氏木霉+乳酸菌組（As+Tr+LAB）添加組，共5組，每組3個重復。微生物接種劑按照原料鮮重的50 ml/kg添加，對照組添加同等量的蒸餾水，接種后，分別延遲0、24、48 h后抽真空密封。于貯藏第56 d開封，進行發(fā)酵品質(zhì)及化學成分分析以及有氧穩(wěn)定性試驗。

1.3 試驗方法

1.3.1 微生物接種劑的制備

將保藏乳酸菌菌種活化后轉接一環(huán)于MRS液體培養(yǎng)基中，置于37℃、120 r/min搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，活菌數(shù)達到1×109cfu/ml。黑曲霉和里氏木霉則以孢子懸浮液的形式進行接種，其制備方法為：將保藏菌株轉接一環(huán)于PDA培養(yǎng)基上，放入28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d。每個培養(yǎng)皿中加入20 ml無菌水，用涂布棒輕輕刮掉孢子，四層無菌紗布過濾到滅菌的三角瓶內(nèi)，加入滅菌的玻璃珠分散孢子后，適當稀釋，經(jīng)血球計數(shù)板計數(shù)，使孢子數(shù)目處于107cfu/ml，4℃條件下保藏備用。

1.3.2 青貯飼料的調(diào)制

將收獲的新鮮玉米秸稈切碎至1～2 cm，根據(jù)1.2節(jié)的試驗設計添加不同的微生物接種劑充分混勻后，裝入200×150 mm的青貯專用聚乙烯袋，每袋約200 g，分別于0、24、48 h后，抽真空密封，室溫條件下(18～25 ℃)避光貯藏。

1.3.3 青貯飼料的有氧穩(wěn)定性試驗

將開封后的青貯玉米秸稈每袋各取出100 g，充分混勻后放入保溫材料桶中，將溫度傳感器插入樣品中心進行溫度監(jiān)測，溫度數(shù)據(jù)的采集使用data Taker DT85采集裝置（澳大利亞 Datataker）進行測定，采集時間設置為1 h；定期混勻取樣分析（根據(jù)具體變質(zhì)情況確定取樣時間）；當樣品溫度高于環(huán)境溫度2℃時視為樣品變質(zhì)，在變質(zhì)時取樣進行分析。

1.3.4 測定項目和分析方法

青貯袋開封后，將青貯料取出并充分混勻。取10 g樣品裝入滅菌的聚乙烯袋，于超凈工作臺內(nèi)加入90 ml滅菌去離子水，用無菌均質(zhì)器處理1 min，浸提3 h后，再通過4層紗布及定性濾紙過濾，得到青貯飼料浸提液，用于pH值測定及微生物的稀釋平板菌落計數(shù)。剩余青貯飼料樣品于65℃鼓風干燥48 h后，測定干物質(zhì)（DM），粉碎過1 mm篩備用。pH值用pH計（Mettler To?ledo-S20,Switzerland）測定；微生物組成采用平板計數(shù)法進行測定[10]；粗蛋白質(zhì)（CP）采用凱氏定氮法進行測定[11]；中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）采用范式纖維法進行測定[12]；NH3-N采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定[13]；可溶性碳水化合物（WSC）采用蒽酮硫酸法進行測定[14]；有機酸采用高效液相色譜法進行測定[15]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 21.0的 two-way anova分析微生物接種劑及延遲密封以及二者的交互作用對玉米秸稈青貯微生物組成、發(fā)酵品質(zhì)、化學成分及開封后發(fā)生有氧變質(zhì)時的發(fā)酵品質(zhì)和化學成分的影響；多重比較采用Duncan's方法，顯著水平設置為P＜0.05。

2 試驗結果

2.1 玉米秸稈的原料特性(見表1)

表1 青貯玉米秸稈原料化學組成(%)

玉米秸稈的化學組成如表1所示。新鮮玉米秸稈的DM含量為25.28%；而WSC含量較低，僅為5.83%DM。

2.2 玉米秸稈青貯的微生物組成（見表2）

如表2所示，微生物接種劑對玉米秸稈青貯的乳酸菌和好氧細菌的數(shù)量無顯著影響（P＞0.05），但顯著增加了酵母菌數(shù)量（P＜0.05）；延遲密封對青貯微生物群落影響顯著（P＜0.05），隨著延遲密封時間的增長，乳酸菌數(shù)量顯著上升，酵母菌數(shù)量顯著下降（P＜0.05）。所有處理組中均未檢測到霉菌及腸細菌。

表2 微生物接種劑和延遲密封對玉米秸稈青貯微生物組成的影響(log10cfu/g FM)

2.3 玉米秸稈青貯發(fā)酵品質(zhì)（見表3）

表3 微生物接種劑和延遲密封對玉米秸稈青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

所有試驗組的發(fā)酵品質(zhì)良好，表現(xiàn)在pH值低于3.8，氨態(tài)氮占總氮的比值低于10%（見表3）。與CK組相比，添加微生物接種劑對pH值影響不顯著（P＞0.05），但對有機酸和氨態(tài)氮含量的影響顯著(P＜0.05)。其中添加Tr組的乳酸含量高于其他處理組；Tr+LAB組的乙酸含量則低于除CK組外的其他組；添加As+Tr+LAB組的丙酸和丁酸含量最低。延遲密封時間對pH值影響顯著(P＜0.05)，隨著密封時間的延遲，pH值顯著上升。微生物接種劑和延遲密封時間對青貯飼料中氨態(tài)氮含量影響均顯著（P＜0.05），其中Tr+LAB組的氨態(tài)氮含量高于其他微生物接種組，而As+Tr+LAB組的氨態(tài)氮含量與CK組無顯著差異；另外，隨著延遲密封時間的增長，氨態(tài)氮含量也顯著上升（P＜0.05）。

2.4 玉米秸稈青貯的化學成分(見表4)

表4 微生物添加劑和延遲密封對玉米秸稈青貯化學成分的影響

由表4可知，經(jīng)過56 d發(fā)酵后的玉米秸稈隨著延遲密封時間的增長，DM含量顯著下降（P＜0.05），NDF、ADF、CP含量顯著上升（P＜0.05）；對于微生物接種劑，除了As+Tr+LAB組的NDF含量顯著下降外，其他組各成分均無顯著影響。

2.5 玉米秸稈有氧狀態(tài)下的發(fā)酵品質(zhì)和化學成分(見表5)

發(fā)酵56 d的玉米秸稈開封后，處理組和CK組在延遲0 h和延遲48 h密封條件下開封后均在144 h發(fā)生變質(zhì)，而延遲24 h密封條件下的各組開封后均在160 h發(fā)生有氧變質(zhì)。變質(zhì)時的品質(zhì)和化學成分如表5所示。經(jīng)過24 h延遲密封后的玉米秸稈在160 h發(fā)生變質(zhì)時的pH值最低，保留的乳酸含量最高；NDF、ADF含量最低，CP含量最高。

3 討論

3.1 玉米秸稈的原料特性

玉米秸稈是收獲玉米后的副產(chǎn)品，水分含量75%左右，秸稈中的主要成分是木質(zhì)纖維素，由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，是反芻動物良好的粗飼料來源。本試驗的玉米秸稈中，CP含量7.41%DM，約為風干玉米秸稈的2倍[1]，約為全株玉米青貯的85%；WSC含量5.83%DM，約為全株玉米青貯的35%；NDF（57.64%DM）和ADF（31.48%DM）含量均高于全株玉米青貯[3]。

表5 青貯玉米秸稈在有氧條件下的發(fā)酵品質(zhì)和化學成分分析

乳酸菌作為乳酸發(fā)酵的啟動菌，在青貯過程中起著主導作用。一般情況下，當原料表面附著乳酸菌數(shù)量達到或超過105cfu/g FM時，才能確保青貯的順利進行[16]。制作青貯飼料時，要使乳酸菌能夠快速生長繁殖，青貯原料應具有適宜的DM含量、一定的WSC含量及較低的緩沖能[17]。本試驗中的玉米秸稈中WSC含量僅有5.83%DM，為了提高其發(fā)酵品質(zhì)，添加了乳酸菌和能產(chǎn)生纖維素分解酶的曲霉、木霉等真菌。Sun等[18]研究了纖維素酶和乳酸菌對玉米秸稈不同部位青貯的影響，得出纖維素酶能夠提高乳酸含量，降低DM、NDF及CP損失。本試驗接種乳酸菌以及黑曲霉和里氏木霉，獲得了同樣的效果。

3.2 微生物接種劑及延遲密封對玉米秸稈青貯微生物群落的影響

添加微生物接種劑對乳酸菌的數(shù)量沒有顯著影響，這可能與玉米秸稈原料本身附著的乳酸菌有關。經(jīng)過56 d貯藏，酵母菌的數(shù)量顯著降低，但添加霉菌促進了酵母菌的生長。隨著延遲密封時間的增長，乳酸菌數(shù)量顯著上升，酵母菌數(shù)量顯著下降，表明霉菌分泌的纖維素酶起了一定的作用，導致纖維素降解為能夠被乳酸菌吸收利用的WSC，從而促進了乳酸菌的生長繁殖[19]。

3.3 微生物接種劑和延遲密封對玉米秸稈青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

添加微生物接種劑后玉米秸稈青貯pH值在3.63～3.68之間，和CK組的3.58相比沒有顯著差異（P＞0.05），這可能與本試驗所用的玉米秸稈原料水分適宜等條件有關。添加有Tr組的乳酸含量高于其他處理組，表明里氏木霉分泌的纖維素酶將纖維素分解后促使乳酸菌發(fā)酵，提高了乳酸含量；Tr+LAB組的乙酸含量則低于除CK組外的其他組；添加As+Tr+LAB組的丙酸和丁酸含量則最低，說明不同的微生物接種劑對有機酸各成分的影響不同，但總體來看As+Tr+LAB組能有效改善玉米秸稈的青貯品質(zhì)。

本試驗中，延遲密封對玉米秸稈的青貯品質(zhì)沒有改善作用，但隨著延遲時間的增長，乳酸菌數(shù)量顯著上升，酵母菌數(shù)量顯著下降，這可能對開封后的有氧穩(wěn)定性有一定的促進作用。

3.4 微生物接種劑和延遲密封對玉米秸稈青貯營養(yǎng)成分的影響

添加有里氏木霉組的DM損失顯著高于CK組，和LAB組、As+Tr+LAB組差異不顯著，說明微生物接種劑會造成青貯原料的干物質(zhì)損失，但即使在不考慮干物質(zhì)損失的情況下，As+Tr+LAB組的NDF、ADF含量也顯著低于CK組，表明As+Tr+LAB組合降解了部分纖維素，將其分解后促使乳酸菌發(fā)酵提高了乳酸含量。隨著延遲密封時間的增長，NDF、ADF和CP含量顯著上升，且延遲48 h密封的CP、NDF及ADF含量略高于CK組，這可能是由于隨著密封時間的延遲，酵母、霉菌等好氧微生物對原料中可溶性碳水化合物和纖維素的利用造成的基質(zhì)損失，導致其他組分在干樣中的相對含量升高。

3.5 微生物接種劑和延遲密封對玉米秸稈青貯有氧穩(wěn)定性的影響

添加微生物接種劑不會改變玉米秸稈青貯的有氧穩(wěn)定性，表現(xiàn)在添加微生物接種劑與CK組同時變質(zhì)，但延遲24 h后密封發(fā)酵的玉米秸稈比延遲0 h和48 h密封后的玉米秸稈有氧穩(wěn)定性更好，這可能與延遲24 h霉菌在一定程度上的萌發(fā)抑制了酵母的大量繁殖有關。

4 結論

復合接種黑曲霉、里氏木霉和乳酸菌可以顯著提高玉米秸稈的青貯發(fā)酵品質(zhì)；延遲密封能夠顯著改變玉米秸稈青貯的微生物群落，且延遲24 h密封有利于玉米秸稈青貯的有氧穩(wěn)定性，但對玉米秸稈青貯品質(zhì)的提高沒有促進作用。