金銀花與山銀花對(duì)致敏大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞的影響

金銀花與山銀花對(duì)致敏大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞的影響

李芳1,2，劉冰潔1,2，劉婧慧3，周軍1,2，畢宇安1,2，王振中1,2，蕭偉1,2*

(1.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 中藥制藥過(guò)程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 連云港 222001；

2.江蘇省企業(yè)院士工作站，江蘇 連云港 222001；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

摘要：目的免疫豚鼠獲取抗血清，觀察金銀花與山銀花中間體等對(duì)豚鼠的致敏性及其對(duì)大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)增殖的影響。方法金銀花和山銀花各中間體等免疫豚鼠并觀察豚鼠致敏情況，收集致敏后豚鼠血清，將其與大鼠PBMC細(xì)胞共孵育24 h，建立致敏細(xì)胞模型。金銀花與山銀花各中間體等與致敏細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，CCK-8法檢測(cè)大鼠PBMC的增殖情況。結(jié)果金銀花中間體1、2發(fā)生豚鼠過(guò)敏反應(yīng)；山銀花中間體1、2發(fā)生豚鼠類過(guò)敏和過(guò)敏反應(yīng)；金銀花與山銀花中間體等均抑制體外培養(yǎng)的大鼠PBMC的增殖，但兩者相比金銀花抑制率偏低。結(jié)論參照熱毒寧注射液?jiǎn)挝赌M藥物的制備工藝，金銀花對(duì)豚鼠的致敏性、對(duì)大鼠PBMC的抑制率低于山銀花。

關(guān)鍵詞：金銀花；山銀花；外周血單個(gè)核細(xì)胞

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.01.017

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1003-5699(2015)01-0057-04

基金項(xiàng)目:科技部重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目(2013ZX09402203)。

作者簡(jiǎn)介:李芳(1980-)，女，碩士，從事藥理學(xué)及注射劑安全性評(píng)價(jià)研究。

收稿日期:(責(zé)任編輯：張瑞彬2014-08-15)

*通信作者:蕭偉，電話-(0518)85521956，電子信箱-wzhzh-nj@tom.com

Impact of Lonicera japonica and Lonicera confusa on PBMC of sensitized rat

LI Fang1,2,LIU Bingjie1,2,LIU Jinghui3,ZHOU Jun1,2,BI Yu’an1,2,WANG Zhenzhong1,2,XIAO Wei1,2*

(1.Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co.,Ltd.,State Key Laboratory of New Pharmaceutical Process for

Traditional Chinese Medicine,Lianyungang 222001,Jiangsu Province,China;

2.Enterprises Academician Workstations in Jiangsu Province,Lianyungang 222001,Jiangsu Province,China;

3.Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

Abstract：ObjectiveTo observe the sensitization of the guinea pig and multiplication of the rat PBMC after getting immunized guinea pig antiserum with the intermediates of Lonicera japonica and Lonicera confus.MethodsAfter observing the allergic reaction of the guinea pigs which were sensitized with the intermediates of Lonicera japonica and Lonicera confusa,the blood serum was collected,then the PBMC of rat was cultured with the blood serum for 24 hours and the cell sensitization model was built.The multiplication of the rat PBMC was detected by CCK-8 technique after the intermediates of Lonicera japonica and Lonicera confusa were cultured with the sensitized cell for 24 hours.ResultsThe one and two intermediates of Lonicera japonica were discovered allergy;The one and two intermediates of Lonicera confusa occurred anaphylactoid reaction and allergy in guinea pig;The intermediates of Lonicera japonica and Lonicera confusa both inhibited the proliferation of the rat PBMC.However,the inhibition rate of the intermediates of Lonicera japonica was lower compared with that of Lonicera confusa.ConclusionThe sensitization of Lonicera japonica in guinea pigs and inhibition ratio of rat PBMC were lower than those of Lonicera confuse with reference to the drug preparation technology of single simulation of Reduning Injection.

Keywords:Lonicera japonica;Lonicera confusa;PBMC

近年來(lái)，中藥注射劑研究取得良好進(jìn)展，品種增多，療效更廣[1-3]。目前已上市的呼吸系統(tǒng)藥物如雙黃連注射液、清開(kāi)靈注射液中，金銀花藥材出現(xiàn)頻率最高。金銀花作為常用中藥, 《中國(guó)藥典》1963年版首次收載[4],山銀花被2005年版藥典首次收載，其植物來(lái)源有3種[5]。2005年版藥典將金銀花與山銀花分列后，其檢驗(yàn)項(xiàng)目并不能將兩種藥材完全區(qū)分開(kāi)[6]。目前市場(chǎng)上將山銀花作為正品金銀花銷售的現(xiàn)象也很普遍，不良廠商采用山銀花冒充金銀花入藥以獲得高額利潤(rùn)[7-8]。在實(shí)際應(yīng)用中，存在著金銀花與山銀花藥材混用的現(xiàn)象。因此，考察金銀花與山銀花的安全性顯得尤為重要[9]。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1動(dòng)物豚鼠，體質(zhì)量(300±20)g，雌雄各半，南京安立默科技有限公司提供，合格證號(hào)為SCXK(蘇)2010-0002。飼養(yǎng)室溫度為(23±2)℃，相對(duì)濕度在40%～70%，2次/d飼喂蔬菜，自由飲食飲水。Wistar大鼠，揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，合格證號(hào)為SCXK(蘇)2012-0004。飼養(yǎng)室溫度為(23±2)℃，相對(duì)濕度在40%～70%，自由飲食飲水。

1.2試劑本實(shí)驗(yàn)中的藥材金銀花和山銀花均經(jīng)康緣集團(tuán)康濟(jì)大藥房主管中藥師吳舟鑒定為符合藥典規(guī)定的金銀花與山銀花。金銀花中間體1(水提液)、金銀花中間體2(醇沉液)、金銀花中間體3(過(guò)膜前中間體)、金銀花制劑(注射液),江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司提供，批號(hào)均為130906,規(guī)格為10 mL/支。山銀花中間體1(水提液1)、山銀花中間體2(醇沉液)、山銀花中間體3(過(guò)膜前中間體)、山銀花制劑(注射液)，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司提供,批號(hào)均為140101，規(guī)格為10 mL/支。0.9%NaCl注射液，辰欣藥業(yè)股份有限公司提供，批號(hào)為1301158101，規(guī)格為100 mL：0.9 g。10%雞蛋清溶液：將5 mL蛋清以0.9%Nacl注射液10倍稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配。DMEM高糖培養(yǎng)基，gibco公司提供，批號(hào)為8113384，規(guī)格為500 mL/瓶。胎牛血清，gibco公司提供，批號(hào)為1122050，規(guī)格為500 mL/瓶。淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll-PaqueTMPREMIUM 1.084)，GE公司提供，批號(hào)為10070319，規(guī)格為100 mL/瓶。CCK-8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒，貝博生物提供，批號(hào)為BB130041，規(guī)格為5000T。

1.3耗材與儀器設(shè)備96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，CORNING公司提供。infinite M200 PRO酶標(biāo)儀，購(gòu)自TECAN公司。CO2培養(yǎng)箱，購(gòu)自Thermo公司。C1028自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀,購(gòu)自invitrogen公司。CKX41SF倒置顯微鏡,購(gòu)自O(shè)LYMPUS公司。LD4-2A臺(tái)式低速離心機(jī)，購(gòu)自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司。SW-OJ-2FD超凈工作臺(tái)，購(gòu)自蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。BXM-30R高壓蒸汽滅菌器，購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療器械。

2實(shí)驗(yàn)方法[10-11]

2.1豚鼠致敏將30只雌雄各半的豚鼠稱重、標(biāo)號(hào)，隨機(jī)分組，每組3只，共10組,即陽(yáng)性對(duì)照組(10%蛋清)、陰性對(duì)照組(0.9%氯化鈉)、金銀花中間體1(水提液)組、金銀花中間體2(醇沉液)組、金銀花中間體3(過(guò)膜前中間體)組、金銀花制劑(注射液)組、山銀花中間體1(水提液1)組、山銀花中間體2(醇沉液)組、山銀花中間體3(過(guò)膜前中間體)組、山銀花制劑(注射液)組。給藥方式如下：按組別依次腹腔注射10%蛋清、0.9%NaCl、金銀花中間體及制劑1.25 g生藥/kg和山銀花中間體及制劑1.46 g生藥/kg，以無(wú)菌方式進(jìn)行操作，每隔1 d腹腔注射上述10種藥液，注射體積為0.5 mL/只，注射3次。致敏過(guò)程觀察豚鼠反應(yīng)。

2.2抗血清制備末次注射14 d后，豚鼠麻醉后以真空采血肝素抗凝管腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心10 min后，吸取抗血清，按組別分別進(jìn)行混合。將血清置56 ℃水浴中滅活30 min，0.22 μm過(guò)濾后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3大鼠PBMC細(xì)胞分離培養(yǎng)[12-13]大鼠麻醉后，心臟取血4 mL至肝素管抗凝，用0.9%NaCl注射液將血液1∶1稀釋，混勻；另取一離心管，先加入4 mL淋巴細(xì)胞分離液，再將稀釋后的大鼠血液吸4 mL輕輕地疊加在分離液上面，離心機(jī)2 000 r/min離心15 min。離心完后將PBMC轉(zhuǎn)移到新試管中，滴加5 mL 0.9%NaCl注射液，輕洗細(xì)胞，離心機(jī)1 500 r/min離心5 min，洗2次。將細(xì)胞數(shù)量調(diào)整為1×106個(gè)/mL接種于96孔培養(yǎng)板,每孔100 μL。設(shè)9組，分別為:陰性對(duì)照組、金銀花中間體1組、金銀花中間體2組、金銀花中間體3組、金銀花制劑組、山銀花中間體1組、山銀花中間體2組、山銀花中間體3組、山銀花制劑組，每組5個(gè)復(fù)孔。

2.4藥物對(duì)PBMC刺激性檢測(cè)細(xì)胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜后，棄上清，陰性對(duì)照組加入100 μL不含血清的DMEM，治療組每孔分別加入90 μL不含血清的DMEM和相應(yīng)組別的10 μL抗血清。37 ℃放置24 h，陰性對(duì)照組繼續(xù)加入100 μL無(wú)血清的DMEM，金銀花各組分別加入100 μL以無(wú)血清的DMEM稀釋的濃度分別為3.8 mg/mL的各組中間體與制劑，山銀花各組分別加入100 μL以不含血清的DMEM稀釋質(zhì)量濃度為4.4 mg/mL的各組制劑，孵育24 h，每孔加入20 μLCCK-8，作用4 h后，使用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光度。按照公式計(jì)算細(xì)胞抑制率=[1-(藥物組OD值/對(duì)照組OD值)]×100%。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1豚鼠致敏后類過(guò)敏及過(guò)敏反應(yīng)觀察陽(yáng)性組、陰性組、金銀花中間體3組、金銀花制劑組、山銀花中間體3組、山銀花制劑組致敏時(shí)未發(fā)現(xiàn)豚鼠類過(guò)敏或過(guò)敏現(xiàn)象；山銀花中間體1組、山銀花中間體2組發(fā)生類過(guò)敏反應(yīng),且山銀花中間體2組豚鼠因類過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生死亡；金銀花中間體1組、金銀花中間體2組、山銀花中間體1組、山銀花中間體2組致敏時(shí)均發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)。見(jiàn)表1。

表1　致敏豚鼠類過(guò)敏及過(guò)敏反應(yīng)癥狀( n=3)

3.2金銀花與山銀花各制劑對(duì)致敏大鼠PBMC的影響見(jiàn)表2。

組 別A450抑制率/%陰性對(duì)照組1.42±0.05—金銀花中間體1(水提液)1.17±0.0317.4金銀花中間體2(醇沉液)1.13±0.0220.5金銀花中間體3(過(guò)膜前中間體)1.25±0.0211.7金銀花制劑(注射液)1.27±0.0310.9山銀花中間體1(水提液)1.12±0.0421.2山銀花中間體2(醇沉液)1.10±0.0422.8山銀花中間體3(過(guò)膜前中間體)1.24±0.0512.5山銀花制劑(注射液)1.25±0.0312.2

結(jié)果表明，陰性對(duì)照組對(duì)體外培養(yǎng)PBMC的增殖未見(jiàn)抑制作用，而金銀花與山銀花各組對(duì)體外培養(yǎng)PBMC的增殖有不同程度的抑制作用。金銀花中間體3、金銀花制劑組抑制率明顯低于金銀花中間體1、金銀花中間體2組;山銀花中間體3、山銀花制劑組抑制率顯著低于山銀花中間體1、山銀花中間體2組。雖然金銀花與山銀花各組均對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠PBMC的增殖有抑制作用，但在相同工藝下金銀花制劑的抑制率偏低。

4討論

急性過(guò)敏反應(yīng)中的主要類型是Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，致敏原刺激機(jī)體產(chǎn)生IgE抗體,當(dāng)機(jī)體再次接觸相同致敏原時(shí)，吸附在肥大細(xì)胞等表面的IgE抗體與相應(yīng)的致敏原結(jié)合,引起肥大細(xì)胞脫顆粒釋放出組胺等過(guò)敏介質(zhì)。然而，許多藥物既不是抗原也不是半抗原，這些藥物進(jìn)入人體內(nèi)，不經(jīng)過(guò)潛伏期，迅速發(fā)生與Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)相同的臨床表現(xiàn)，稱之為類過(guò)敏反應(yīng)。類過(guò)敏反應(yīng)引發(fā)的肥大細(xì)胞脫顆粒無(wú)需IgE介導(dǎo)，也無(wú)致敏過(guò)程,首次接觸致敏原即可引發(fā)類過(guò)敏癥狀[14-15]。根據(jù)制備工藝，本實(shí)驗(yàn)中的金銀花和山銀花在過(guò)膜前的制劑極有可能含有大分子物質(zhì)，因此存在一定的致敏性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)金銀花和山銀花共8個(gè)中間體及制劑對(duì)豚鼠進(jìn)行致敏試驗(yàn)，觀察其對(duì)豚鼠的致敏性,并制備相應(yīng)的抗血清。由于金銀花中間體1、金銀花中間體2只發(fā)生過(guò)敏反應(yīng),而山銀花中間體1、山銀花中間體2既有類過(guò)敏反應(yīng)也有過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生，故而山銀花與金銀花相比安全性低。外周血單個(gè)核細(xì)胞包含淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞,龔超群等[16]在激光共聚焦顯微觀察實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)PBMC細(xì)胞多數(shù)為T(mén)淋巴細(xì)胞。有研究[17]表明：在過(guò)敏性疾病，如紫癜的發(fā)生發(fā)展中有細(xì)胞免疫功能的減弱,T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少和T淋巴細(xì)胞的抑制功能降低等現(xiàn)象。由于CCK-8法是用于測(cè)定細(xì)胞增殖或毒性實(shí)驗(yàn)中活細(xì)胞數(shù)目的一種高靈敏度、無(wú)放射性的比色檢測(cè)法，故本實(shí)驗(yàn)分離大鼠PBMC細(xì)胞后，以CCK-8細(xì)胞增殖和毒性檢測(cè)試劑盒觀察其對(duì)金銀花和山銀花中間體與制劑的敏感性。根據(jù)結(jié)果可知，金銀花與山銀花各組相應(yīng)的抗血清及制劑刺激后，金銀花和山銀花各組中間體與制劑活細(xì)胞數(shù)量與陰性組相比都減少，表明金銀花和山銀花有可能通過(guò)釋放某些抑制性因子進(jìn)而對(duì)PBMC細(xì)胞的活化和增殖產(chǎn)生抑制作用。但以相同的生產(chǎn)工藝制備的中間體和制劑，金銀花對(duì)PBMC細(xì)胞的增殖抑制作用比山銀花要低。綜上所述，從豚鼠的致敏反應(yīng)觀察和對(duì)大鼠PBMC的刺激性試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，參照熱毒寧注射液?jiǎn)挝赌M藥物的制備工藝，金銀花的安全性要高于山銀花。

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