p H值對大瀧六線魚（Hexagrammos otakii）主要消化酶活性的影響

■陳飛暴 寧司濱 姜晨

（大連海洋大學水產(chǎn)與生命學院，遼寧大連 116023）

隨著現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和水產(chǎn)飼料工業(yè)的發(fā)展，人們對魚類的營養(yǎng)需要及其飼料配方進行了許多研究。同時，魚類飼料與消化酶之間的關系也引起了魚類生物學家的關注。魚類消化酶活性的高低直接關系到魚類對飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用，從而影響到魚類的生長和發(fā)育。

鑒于大瀧六線魚具有重要的經(jīng)濟價值和廣闊的開發(fā)前景，而目前對其消化酶活性方面的研究較少，特別是酸堿度對消化酶活性的影響還未見報道。本文設置了10個pH值梯度，以研究不同pH值對大瀧六線魚不同組織（胃、盲囊、前腸、后腸、肝胰臟）的主要消化酶（蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶）的影響，為大瀧六線魚人工餌料中添加促進胃液分泌的添加劑的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用的大瀧六線魚捕自大連海區(qū)，共120尾，大小基本一致，無病無傷，體質(zhì)健康。魚體重120～145 g。取樣前先將試驗魚饑餓24 h，解剖過程在冰盤上進行，取出胃、盲囊、肝胰臟、前腸和后腸并剝除多余脂肪和組織，用精密pH試紙測定各組織的酸堿度。測定結(jié)束后，用去離子水清洗組織內(nèi)容物并用濾紙吸干水分，然后稱重記錄。之后將組織剪碎進行勻漿，再將勻漿液在4℃冰箱內(nèi)靜置1 h，然后用冷凍離心機離心20 min，轉(zhuǎn)速為6 000 r/min，取上清液于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗設計

實驗為測定pH值對大瀧六線魚胃、盲囊、前腸、后腸及肝胰臟的主要消化酶活性（包括蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶）的影響，共設計了10個不同的pH值梯度值，每個pH值設置3個重復。胃蛋白酶pH值設定范圍是2.0～7.4，每兩個pH值差值為0.6；盲囊、前腸、后腸及肝胰臟蛋白酶的pH值設定范圍是6.4～10.0，每兩個pH值差值為0.4。胃淀粉酶pH值設定范圍是2.2～7.6，每兩個pH值差值為0.6；盲囊、前腸、后腸及肝胰臟淀粉酶的pH值設定范圍是5.2～8.8，每兩個pH值差值為0.4。胃脂肪酶pH值設定范圍是2.6～8.0，每兩個pH值差值為0.6；盲囊、前腸、后腸及肝胰臟脂肪酶的pH值設定范圍是6.4～10.0，每兩個pH值差值為0.4。

1.3 實驗方法

蛋白酶活性測定采用福林-酚法。蛋白酶的定義為：在37℃下每分鐘水解酪素產(chǎn)生1μg酪氨酸定義為一個酶活力單位。蛋白酶活力單位=A/15×F；其中A為標準曲線下，樣品測得的光密度所對應的酪氨酸微克數(shù)；F為酶液的最終稀釋倍數(shù)；反應時間15 min。

淀粉酶活性測定采用淀粉-碘顯色法。淀粉酶定義為：在37℃下，30 min內(nèi)，100 ml酶液中的淀粉酶能完全水解淀粉10 mg時稱為一個淀粉酶單位。淀粉酶活力單位/100 ml=（對照管光密度-測定管光密度）/對照管光密度×800。

脂肪酶活性測定采用滴定法，以聚乙烯醇（P.V P.）橄欖油乳化液為反應底物。脂肪酶的定義為：在一定條件下，脂肪酶水解脂肪每分鐘產(chǎn)生1μg分子脂肪酸的酶量定為一個國際單位。脂肪酶活力單位=（A-B）N·f/t，其中A為樣品消耗堿液的體積數(shù)（ml），B為對照組消耗堿液的體積數(shù)（ml），N為每毫升堿液微克分子數(shù)，f為稀釋倍數(shù)，t為作用時間（min）。

蛋白質(zhì)濃度的測定采用考馬司亮藍結(jié)合法，牛血清白蛋白為標準蛋白。

比活力定義為：每毫克（克）酶蛋白含多少酶活力單位。

1.4 實驗數(shù)據(jù)處理及分析

實驗數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進行處理分析，并用Duncan's法進行多重比較，數(shù)據(jù)用“Mean±SE”的形式表示。使用Excel2003軟件進行圖表制作。

2 實驗結(jié)果

2.1 不同pH值對大瀧六線魚蛋白酶比活力的影響（見表1）

表1 不同pH值對大瀧六線魚蛋白酶比活力的影響（U/mg）

大瀧六線魚不同組織的蛋白酶比活力都隨著pH值的增加呈先升高后降低的趨勢。胃蛋白酶在pH值為2.6時活性最強，且顯著高于其它pH值對應的胃蛋白酶活性（P＜0.05）；盲囊蛋白酶在pH值為8.8時活性最強，但與其它pH值對應的盲囊蛋白酶活性相比較并無顯著性差異（P＞0.05）；前腸蛋白酶在pH值為8.4時活性最強，且顯著高于pH為6.4和pH值為10.0時的前腸蛋白酶活性（P＜0.05）；后腸蛋白酶在pH值為8.8時活性最強，但只對pH值為6.4的后腸蛋白酶表現(xiàn)出顯著性差異，對于其它pH值對應的后腸蛋白酶活性并不表現(xiàn)顯著性差異（P＞0.05）；肝胰臟蛋白酶在pH值為7.6時酶比活力最高，與其它pH值條件下對應的肝胰臟蛋白酶活性差異不顯著（P＞0.05）。由此，大瀧六線魚胃、盲囊、前腸、后腸及肝胰臟的蛋白酶比活力最適pH值分別為2.6、8.8、8.4、8.8、7.6。在最適pH值條件下，蛋白酶比活力的排序為：胃＞盲囊＞肝胰臟＞前腸＞后腸。

2.2 不同pH值對大瀧六線魚淀粉酶比活力的影響（見表2）

表2 不同pH值對大瀧六線魚淀粉酶比活力的影響（U/g）

大瀧六線魚各組織的淀粉酶活性均隨pH值的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，這一趨勢與蛋白酶相似。胃淀粉酶在pH值為5.8時活性最強，且顯著高于其他pH值對應的淀粉酶活性（P＜0.05）。盲囊淀粉酶在pH值為7.6時活性最強，且顯著高于除pH值為8.0之外的其它各組的淀粉酶活性（P＜0.05）。前腸淀粉酶在pH值為8.4時活性最強，與其它pH值相對應的前腸淀粉酶活性相比較，呈顯著性差異（P＜0.05）。后腸淀粉酶與前腸淀粉酶相似，都表現(xiàn)在pH值為8.4時活性最強，且顯著高于其它各pH值條件下的后腸淀粉酶活性（P＜0.05）。肝胰臟淀粉酶在pH值為8.0時活性最強，與其它pH值條件下對應的肝胰臟淀粉酶活性相比較，表現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。由此，大瀧六線魚胃、盲囊、前腸、后腸及肝胰臟的淀粉酶活性最適pH值分別為5.8、7.6、8.4、8.4、8.0。在最適pH值條件下，淀粉酶活性的排序為：盲囊＞胃＞前腸＞后腸＞肝胰臟，但各組織之間淀粉酶活性的差異并不顯著。

2.3 不同pH值對大瀧六線魚脂肪酶比活力的影響（見表3）

大瀧六線魚各試驗組織的脂肪酶活性隨pH值的增高均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，這與蛋白酶和脂肪酶的測定結(jié)果相似。胃脂肪酶在pH值為7.4時活性最強，且顯著高于其它各pH值條件下的胃脂肪酶活性（P＜0.05）。盲囊脂肪酶在pH值為8.0時酶活性最強，相比于其他各pH值條件下的盲囊脂肪酶有顯著性差異（P＜0.05）。前腸脂肪酶在pH值為8.4時酶活性最強，且與其它各pH值條件下的前腸脂肪酶活性相比，差異顯著（P＜0.05）。后腸脂肪酶也表現(xiàn)在pH值為8.4時酶活性最強，且顯著高于除pH值為8.0之外的其它各pH值條件下的后腸脂肪酶活性 （P＜0.05）。肝胰臟脂肪酶在pH值為7.6時活性最強，且與pH值在6.8～8.0之間的各組酶比活力差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于其它各pH值梯度下的肝胰臟脂肪酶活性（P＜0.05）。由此，大瀧六線魚胃、盲囊、前腸、后腸及肝胰臟的脂肪酶比活力最適pH值分別為7.4、8.0、8.4、8.4、7.6。在最適pH值條件下，脂肪酶活性排序為：盲囊＞肝胰臟＞前腸＞后腸＞胃。

表3 不同pH值對大瀧六線魚脂肪酶比活力的影響（U/mg）

3 討論

3.1 食性與消化酶

魚類的食性與消化酶之間關系密切。Agrawal等（1975）[1]比較了不同食性魚類的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性的差異，在肉食性、雜食性和草食性魚類中，肉食性魚的蛋白酶和脂肪酶活性相對較高，而草食性魚類的淀粉酶活性較高，雜食性魚類的消化酶活性則介于二者之間。吳婷婷等（1994）[2]在對鱖、鯉、鰱、鯽、青魚和草魚的研究中同樣發(fā)現(xiàn)了這一相關性，蛋白酶的活性在不同食性的魚類中存在差異，在肉食性魚類、雜食性魚類、濾食性魚類和草食性魚類中表現(xiàn)為活性逐漸降低。從實驗結(jié)果來看，在適宜的pH值條件下，大瀧六線魚的淀粉酶活性較弱，脂肪酶活性次之，蛋白酶活性最高。這一結(jié)果恰與其食性相吻合，大瀧六線魚屬近海底棲肉食性魚類，主食魚類、甲殼類和多毛類等底棲動物，這也進一步說明了食性與消化酶之間相一致的觀點。不同食性的魚類之所以表現(xiàn)出不同的消化酶活性，主要是因為消化部位的結(jié)構(gòu)的不同，不同組織結(jié)構(gòu)具有不同的消化機能，從而引起消化酶的活性具有明顯的差異。肉食性魚類多以高蛋白含量的水生動物為食，且腸道較短，需要具有較高的蛋白酶活性才能在有效的時間內(nèi)使食物得到充分消化，而草食性魚類腸道較長，食物在消化道內(nèi)停留時間長，可以彌補蛋白酶活性低的不足，這也是魚類對其生態(tài)環(huán)境的一種適應性表現(xiàn)。

3.2 pH值對消化酶活性的影響

從實驗的結(jié)果看，大瀧六線魚的各組織的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均隨著pH值的增加，表現(xiàn)為先升高再降低。消化酶活性之所以會隨著反應pH值的不同而發(fā)生改變，其一是pH值能使消化酶的活性中心或與之相關基團的解離狀態(tài)發(fā)生改變，從而影響底物與消化酶的結(jié)合，改變消化酶的活性；其二是當pH值超過一定范圍時，會使消化酶的構(gòu)象發(fā)生改變，導致消化酶變性失活（姜令緒等，2007）[3]。

3.2.1 pH值對魚類蛋白酶活性的影響

本研究表明大瀧六線魚胃、盲囊、前腸、后腸和肝胰臟的蛋白酶活性隨著pH值的變化，其活性均發(fā)生變化，并在一定的pH值下達到最大值，即各類消化酶均存在著適宜的pH值，而且不同消化部位的蛋白酶，其適宜的pH值水平不同。在實驗中，胃、盲囊、前腸、后腸和肝胰臟的蛋白酶比活力最適pH值分別為2.6、8.8、8.4、8.8、7.6。在最適pH值條件下，胃和盲囊的蛋白酶比活力明顯高于其他組織，因此可以認為大瀧六線魚的胃和盲囊為消化蛋白質(zhì)的主要部位。

周景祥等（2001）[4]研究指出，有胃硬骨魚類胃蛋白酶的最適pH值在2.0～3.0之間，腸道蛋白酶的最適pH值在6.5～9.5之間，肝胰臟蛋白酶的最適pH值在7.0～8.7；李文雯等（2012）[5]報道星突江鰈胃、腸和肝胰腺蛋白酶活性的最適pH值分別為3.8、8.2和7.8；范鎮(zhèn)明等（2008）[6]研究結(jié)果表明，河鱸胃、腸和肝胰臟的蛋白酶最適pH值分別為2.0、8.0和6.0；區(qū)又君等（2010）[7]研究發(fā)現(xiàn)卵形鯧鲹幼魚的胃蛋白酶最適pH值為2.2，成魚為3.2，幼魚的肝、腸和幽門盲囊的蛋白酶活性最適pH值為7.2，而成魚為8.0；沈文英等（2006）[8]報道澳洲寶石魚腸道、肝胰臟蛋白酶的最適pH值分別為7.0～7.5、7.5，胃蛋白酶的最適pH值為2.0。還有一些關于魚類腸道蛋白酶的最適pH值的報道，如黃鱔的適宜pH 值為 8.0～9.5（楊代勤等，2005）[9]，鮭魚（Salmo salar）為 9.2（W.Uys等，1987）[10]，大菱鲆（ScopHthalmus maximus）為 9.0（Munilla-Moran R 等，1996）[11]，以上的研究結(jié)果與本實驗的檢測結(jié)果較為一致，即胃蛋白酶的最適pH值在酸性范圍，消化道其它部位的蛋白酶最適pH值均在中性至偏堿性范圍。

另有文獻認為，有胃魚類胃蛋白酶在強酸性條件下活性較強，在中性環(huán)境（pH值7.0）則失活（區(qū)又君等，2010；尾崎久雄，1983）[12-13]。本實驗中，當pH值升至7.4時，胃蛋白酶活性接近零，認為基本失活，這與上述觀點一致。可以認為胃進行的蛋白消化是在酸性條件下進行的，在中性至堿性條件下不具備消化蛋白的能力。

3.2.2 pH值對魚類淀粉酶活性的影響

大瀧六線魚消化道各部位淀粉酶活性隨著pH值的升高，呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，胃、盲囊、前腸、后腸及肝胰臟的淀粉酶比活力最適pH值分別為5.8、7.6、8.4、8.4、8.0。其中胃最適pH值偏酸性，其它部位偏堿性。在最適pH值條件下，各組織的淀粉酶的酶比活力差異較小，認為大瀧六線魚各消化器官均具備一定的淀粉消化能力。

關于魚類淀粉酶的最適pH值研究，國內(nèi)外有很多報道。周景祥等（2001）[4]報道了有胃硬骨魚類肝胰臟、腸和胃淀粉酶的最適pH值分別是6.8～7.0、5.0～8.0和5.0～7.0；梅景良等（2004）[14]報道了黑鯛胃、肝胰臟和腸淀粉酶的最適pH值分別是5.0、7.0和7.0；沈文英等（2006）[8]報道了澳洲寶石魚肝胰臟、腸道、胃淀粉酶的最適pH值均為6.2；尾崎久雄（1983）[13]報道了狹鱈（Theragra chalcogramma）幽門盲囊和腸的淀粉酶最適pH值為7.0；李文雯等（2012）[5]報道星突江鰈胃、腸和肝胰腺淀粉酶活性的最適pH值分別為6.6、7.4和7.0；楊代勤等（2005）[9]報道了黃鱔腸道淀粉酶的適宜pH值為7.0～8.0；陳健等（2015）[15]研究結(jié)果表明不同日齡的藍點馬鮫魚淀粉酶最適pH值不同，1日齡仔魚淀粉酶最適pH值為7,7日齡仔魚pH值為7～7.5，15日齡仔魚 pH值為 7.5；楊元昊等（2006）[16]研究表明蘭州鲇的胃、肝胰臟和腸淀粉酶最適pH值分別為5.4、6.6和7.0；另有研究表明斑點叉尾鮰胃、腸和肝胰臟淀粉酶的最適pH值分別為5.5、7.5和6.5（宋威等，2010）[17]。以上各研究結(jié)果表明魚類消化道淀粉酶的最適pH值不盡相同，這可能是由于不同種類、不同消化部位酶活性中心存在差異，致使酶活力表達的最適pH值有所不同。但總的來說淀粉酶活性的最適pH值均控制在弱酸性到中性偏堿性范圍內(nèi)。

3.2.3 pH值對魚類脂肪酶活性的影響

大瀧六線魚消化道各部位脂肪酶活性隨著pH值的升高，均呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，胃、盲囊、前腸、后腸及肝胰臟脂肪酶最適pH值分別為7.4、8.0、8.4、8.4、7.6。在最適pH值條件下，胃的脂肪酶活性最低，但盲囊的脂肪酶活性明顯高于其它組織?？梢哉J為大瀧六線魚的盲囊是進行脂肪消化的最主要場所，其它消化部位起到輔助消化脂肪的作用。范鎮(zhèn)明等（2008）[6]研究結(jié)果表明，河鱸胃、腸和肝胰臟的脂肪酶最適pH值分別為6.0、3.0和4.0；李文雯等（2012）[5]報道星突江鰈胃、腸和肝胰腺脂肪酶活性的最適pH值分別為 7.4、7.8 和 7.8；伍莉等（2002）[18]研究表明黃鱔前、中、后腸和肝胰臟中脂肪酶活力的最適pH值均為7.2，楊代勤等（2005）[9]對黃鱔的研究表明黃鱔脂肪酶的適宜pH值為7.0～7.5，二者相符。以上研究結(jié)果表明，胃脂肪酶最適pH值在偏酸或中性偏堿性范圍內(nèi)；腸等消化部位脂肪酶最適pH值一般在中性偏堿性范圍內(nèi)。實驗結(jié)果表明，大瀧六線魚消化道各部位脂肪酶的最適pH值均在弱堿性范圍，與上述結(jié)論基本一致。

3.3 消化道不同部位消化酶活性差異

在實驗中，大瀧六線魚的消化道各部位的蛋白酶在最適pH值條件下，不同組織的蛋白酶活性的排序為：胃＞盲囊＞肝胰臟＞前腸＞后腸，由此可見，胃的蛋白酶活性最強，因此，可以認為大瀧六線魚的胃是蛋白質(zhì)消化的最初也是最主要的場所，且實驗中檢測到胃液在正常情況下呈酸性，極有利于其蛋白酶活性的發(fā)揮。而緊接著胃的消化部位的盲囊也具有較高的蛋白酶活性，能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)進一步消化，提高魚體消化吸收蛋白質(zhì)的能力。

在各部位淀粉酶的最適pH值條件下，淀粉酶活性排序為：盲囊＞胃＞前腸＞后腸＞肝胰臟，但各組織之間淀粉酶活性差異不顯著（P＞0.05）。認為大瀧六線魚各消化部位均具備一定的淀粉消化能力，但各部位淀粉酶比活力均不高，這是與其食性相適應的表現(xiàn)。

在各部位脂肪酶的最適pH值條件下，脂肪酶活性的排序為：盲囊＞肝胰臟＞前腸＞后腸＞胃，盲囊的脂肪酶活性最強，可以認為盲囊為大瀧六線魚進行脂肪消化的主要部位。Das等（1991）[19]認為，魚類肝胰臟是生成脂肪酶的主要部位,且消化系統(tǒng)的各個部分均存在脂肪酶的活動。在實驗中測得的肝胰臟脂肪酶活性顯著低于盲囊，稍高于腸，可能是由于肝胰臟中的脂肪酶多是以無活性的酶原存在，所以檢測到的脂肪酶活性不太高。從實驗結(jié)果來看，大瀧六線魚幽門盲囊是進行脂肪消化的最主要場所，其它消化部位起到輔助消化脂肪的作用，胃是消化脂肪水平最低的消化部位。

實驗還檢測到盲囊、腸和肝胰臟中消化液均為中性偏弱堿性，且受消化道中食物有無的影響較小。而從實驗結(jié)果來看，大瀧六線魚上述各消化部位主要消化酶的最適pH值也在中性偏堿性范圍內(nèi)，認為大瀧六線魚消化道pH值較有利于各部位消化酶活性的發(fā)揮，有效促進對食物的消化和吸收。

另外，從實驗結(jié)果不難看出，大瀧六線魚消化道的前段對食物的消化起主導作用，尤其是盲囊的消化能力不容忽視。對于蛋白質(zhì)的消化，胃最強，盲囊次之；對于脂肪的消化，盲囊的酶活性顯著高于其它部位；對于淀粉的消化，各部位差異不顯著，但盲囊的淀粉酶活性依然高于其它部位。可見，盲囊是大瀧六線魚消化的中樞部位。