過瘤胃膽堿的性能評定

■李 高 張永根 丁 雪 王曉帆 張立陽 薛世崇

（東北農業(yè)大學動物科學技術學院，黑龍江哈爾濱 150030）

近年來，隨著飼料工業(yè)和乳業(yè)生產水平的不斷發(fā)展，集約化養(yǎng)殖條件下的奶牛生產性能得到極大的改善[1]。但隨著奶牛產奶潛力的開發(fā)，也出現了一些問題。就目前最常見的脂肪肝疾病而言，調查發(fā)現有高達50%的高產奶牛在圍產期間都會受此病影響，導致健康、生產和繁殖能力下降，其對奶牛養(yǎng)殖帶來了極大的損失[2]。研究發(fā)現，膽堿能夠有效的減少脂肪在肝臟的沉積，然而因為反芻動物自身的特點，添加在日糧中的膽堿幾乎都被瘤胃微生物所降解[3]，而且膽堿的堿性以及帶有魚腥異味限制了其大量添加。研究者通過試驗選取18只泌乳中期奶牛，當膽堿飼喂量由18 g/d增加至282 g/d時，飼料采食量由18.4 kg/d減少至16.7 kg/d，表明高水平膽堿可降低飼料采食量[4]。為了不影響奶牛的采食量以及預防膽堿在瘤胃中的降解以及改善異味，需要對膽堿進行過瘤胃保護研究，以期達到過瘤胃的目的。

研究證實，肝臟甘油三酯（TAG）沉積會降低肝臟尿素生成速率，影響糖異生、激素清除和響應能力。而研究發(fā)現膽堿是形成極低密度脂蛋白（VLDL）的重要物質，在飼料中添加膽堿能夠增加體內VLDL的數量，提高對甘油三酯的轉運能力，減少非酯化脂肪酸（NEFA）在肝臟的沉積，達到預防脂肪肝的目的[5]。通過飼料與奶牛自身合成的膽堿已經不能滿足高產奶牛的營養(yǎng)需要，因此有必要額外的添加膽堿，補充膽堿在奶牛體內的缺乏[6]。目前市面上有很多過瘤胃膽堿產品，但其質量良莠不齊，而且價格昂貴，鑒于這種情況，在國內有必要開展過瘤胃技術研究，形成擁有自主知識產權的，質量優(yōu)良，價格相對較低的過瘤胃保護膽堿產品,應用于國內牛場，促進奶業(yè)的進一步發(fā)展。在過瘤胃膽堿的質量評定方面還沒有統(tǒng)一的標準。對市面上不同的過瘤胃膽堿產品沒有權威的評估，導致養(yǎng)殖戶的選擇困難。本研究旨在對新研發(fā)過瘤胃膽堿產品進行質量評定，且評價日糧添加瘤胃保護膽堿（RPC）預防或減輕奶牛脂肪肝的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

東北農業(yè)大學實驗基地提供的安裝有瘤胃瘺管的奶牛。按奶牛營養(yǎng)需要配制飼糧。試驗奶牛每日分別于07：00和17：00等量飼喂，基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.2 試驗材料

C1：威爾潞威公司新研發(fā)膽堿產品。

1.3 過瘤胃膽堿在瘤胃內保護率測定

1.3.1 半體內法測定過瘤胃膽堿在瘤胃保護率

本試驗采用尼龍袋法，尼龍袋采用8 cm×12 cm規(guī)格，試驗按照降解時間分為9個處理，分別為0、2、4、8、12、16、24、36、48 h，以未經瘤胃處理的為對照組0 h，每個處理3個重復，每個重復每個時間點3個平行樣品袋，每袋樣品為5 g。裝好樣品后的尼龍袋在40℃烘箱中烘干48 h至恒重，稱重備用。試驗時將尼龍袋同時放入牛瘤胃腹囊部，分別在瘤胃中消化2、4、8、12、16、24、36、48 h后分別取出相應的尼龍袋，在清水中緩緩沖洗5～10 min，直到水流清凈為止，然后在40℃烘箱中烘干48 h至恒重，稱重，計算過瘤胃膽堿樣品在瘤胃中的保護率。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平（風干基礎）

1.3.2 體外法測定過瘤胃膽堿在瘤胃保護率

基礎緩沖溶液，A液：CaCl2·2H2O 16.12 g，MnCl2·4H2O 10.0 g，CoCl2·6H2O 1.0 g，FeCl3·6H2O 0.8 g溶解，并定容至1 000 ml。B液：Na2HPO4（無水）5.7 g，KH3PO4（無水）6.2 g，MgSO4·7H2O 0.6 g溶解，并定容至1 000 ml。C液：NH4HCO34.0 g，NaHCO335.0 g溶解，并定容至1 000 ml。D液：100 mg刃天青加入100 ml蒸餾水充分溶解。E液：1 mol/l NaOH 4.0 ml，Na2S·9H2O 672 mg，蒸餾水95 ml，充分溶解。

2 L緩沖液的配制方法：800 ml蒸餾水+0.2 ml A液+480 ml B液+480 ml C液+2 ml D液，此時混合液為紅色，通入CO2并預熱到39℃，混合液變成無色，再加入80 ml還原液，繼續(xù)通入CO2至無色。

瘤胃液：早晨飼喂前通過瘤胃瘺管取瘤胃液，經四層紗布過濾。

試驗按照降解時間分為9個處理，分別為0、2、4、8、12、16、24、36、48 h，以未經瘤胃處理的為對照組0 h，每個處理3個重復，每個重復每個時間點3個平行樣品袋，稱取膽堿樣品2 g左右，分別放入24個生理鹽水瓶（250 ml），向每個瓶子分裝60 ml緩沖液和30 ml瘤胃液，搖動混合，向溶液充CO2，使溶液和試管內空間全部充滿CO2，然后蓋上帶有放氣閥門的橡皮塞，將其置于水浴搖床培養(yǎng)（39℃），設置好搖床頻率，分別于各個時間點各取出3個瓶子，去上清液，剩余物在清水中緩緩沖洗5～10 min，至水澄清，測剩余物中膽堿含量，從而測定過瘤胃膽堿樣品在瘤胃中的保護率。

1.4 過瘤胃膽堿在小腸中的降解率測定

1.4.1 體外法測定過瘤胃膽堿在小腸中的降解率

緩沖液：NaH2PO49.30 g、NaHCO39.80 g、NaCl 0.47 g、KCl 0.57 g、CaCl2·H2O 0.08 g、MgSO4·7H2O 0.12 g，將以上成分加入1 000 ml蒸餾水充分溶解即成。

酸性胃蛋白酶：準確稱取胃蛋白酶（1∶10 000）1.0 g，溶解于1 000 ml的0.1 mol/l鹽酸中。

胰酶液：稱取6.8 g KH2PO4，溶解于750 ml蒸餾水中，用NaOH溶液調pH值至7～8，用蒸餾水定容于1 L容量瓶中得0.5 mol/l KH2PO4，取3 g胰蛋白酶與50 mg百里香酚溶解于1 L以上溶液，充分溶解1 h。

1.0 mol/l NaOH溶液。

飼料殘渣制備：取適量飼料原樣大約10 g于瘤胃尼龍袋內，每4個袋子固定于一根繩上，在早晨投入奶牛瘤胃中，16 h后取出，沖洗至清澈后，于40℃烘48 h至恒重。

測定方法為體外離體酶法（兩步法）：①加入60 ml酸性胃蛋白酶溶液到24個裝有2 g過瘤胃膽堿樣品的培養(yǎng)瓶中，將其置于水浴搖床培養(yǎng)（39℃），培養(yǎng)1 h；②每個瓶子加入1.5 ml 1mol/l氫氧化鈉，并加入80 ml胰酶液培養(yǎng)，分別在2、4、8、12、16、24、36、48 h取出三個瓶子，在清水中緩緩沖洗5～10 min，直到水流清凈為止，然后在40℃烘箱中烘干48 h至恒重，稱重，測定過瘤胃膽堿樣品在小腸中的降解率。

1.4.2 移動尼龍袋法測定過瘤胃膽堿在小腸中的降解率

選擇孔徑10～40μm的尼龍布，制成3 cm×6 cm的移動尼龍袋。稱取1.4.1中制備的飼料殘渣2～3 g，裝入做好的尼龍袋中，熱封儀封口。每頭牛準備6個尼龍袋。將移動尼龍袋浸泡于含0.004 mol/l的HCl溶液中，25℃培養(yǎng)1 h，然后在0.01%胃蛋白酶的鹽酸溶液中40℃振蕩培養(yǎng)2 h。處理后的移動尼龍袋經十二指腸瘺管每30 min投放1次，每次投袋2個。自投袋后12 h開始，每隔2 h定時檢查一次，及時從糞便中回收移動尼龍袋。清理尼龍袋上的糞便，細流沖洗，直至尼龍袋中流出的水清澈無味為止，然后在40℃烘箱中烘干48 h至恒重，稱重，計算過瘤胃膽堿樣品在小腸中的降解率。

1.5 血液生化指標測定

選取6頭干奶期奶牛，按體重（BW）、體況評分（BCS）配對，并隨機分成對照組和試驗組每組各3頭。試驗分預飼期和試驗期兩個階段，預飼期為6 d，試驗期為14 d。試驗預飼期間，所有奶牛飼喂1.4 kg/d精料并自由采食飼草，在預飼第6 d采食后4～5 h，進行尾部靜脈采血10 ml，加入抗凝劑，冷藏保存，進行血液指標分析。從第7 d開始進行誘導脂肪肝期，奶牛飼喂1.4 kg/d精料，限制飼草采食量，同時試驗組添加20 g/（d·頭）過瘤胃膽堿產品C1，對照組不添加，此時奶牛采食的能量大約為維持所需總能量的30%。從試驗期第11 d開始每天在奶牛采食后4～5 h進行尾靜脈采血[7]，每次采血10 ml，進行血液指標分析。預飼期第6 d結果作為校正處理。采集血液的管中加入肝素鈉抗凝。采樣后立即離心15 min，離心速度3 500 r/min，取全部上清液分成2份，收集血漿，-20 ℃保存[8]。

①血漿葡萄糖濃度的測定：用葡萄糖氧化酶/過氧化酶法，通過葡萄糖氧化酶（GOD）氧化，產生葡萄糖酸和過氧化氫。過氧化氫又通過氧化物酶（POD）作用，分解出氧，能夠與無色的4-氨基安替比林和酚偶聯(lián)氧化，合成紅色的醌亞胺[9]。醌亞胺在500 nm處有最大吸收峰，其吸光度與濃度成正比，可以通過測定標準管的吸光度計算樣品中葡萄糖的濃度[10]。

②非酯化脂肪酸（NEFA）含量測定：用試劑盒比色法，非酯化脂肪酸（NEFA）能與銅離子結合形成能溶于氯仿的脂肪酸銅鹽中，其量與非酯化脂肪酸含量成正比。通過測定銅離子的量來計算非酯化脂肪酸的含量[11]。

③ β-羥基丁酸（β-HBA）含量測定：β-羥基丁酸的濃度與pH值8.5時煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）在340 nm波長下的吸光度上升速率成正比，因此可以通過測定NADH在340 nm波長下的吸光度上升速率來計算β-羥基丁酸的含量[12]。

1.6 數據統(tǒng)計分析

數據用Excel2010進行初步整理，然后采用SPSS 13.0軟件對數據進行方差分析過程（ANOVA）進行分析，均值的多重比較采用Duncan's法進行多重比較，結果以“平均值±標準誤”表示。

1.7 結果計算

裝袋樣品逃逸率（%）=降解重（g）/料重（g）×100；

降解重（g）=袋重（g）+料重（g）-降解后重（g）；

干重損失（%）=[樣品校正處理前重量（g）-樣品處理后重量（g）]/樣品校正處理前重量（g）×100；

瘤胃保護率（%）=樣品過瘤胃后重量（g）/樣品校正過瘤胃前重量（g）×100；

小腸降解率（%）=[1-樣品小腸降解后重量（g）/樣品校正小腸降解前重量（g）]×100。

2 結果與分析

2.1 過瘤胃膽堿（C1）的性能評定

2.1.1 過瘤胃膽堿在瘤胃中的保護率測定（見表2）

表2 體外法與半體內法測過瘤胃膽堿瘤胃保護率（%）

由表2可以看出，用體外法與半體內法所測結果雖然在數值上有較大差異但是在趨勢上一致，都是隨著培養(yǎng)時間的增大，在瘤胃的保護率有逐漸減小的趨勢。通過多重比較發(fā)現在2、8、24、36、48 h時間點兩種方法所測結果差異顯著（P＜0.05），而在4、12、16 h時候所測結果表現差異不顯著（P＞0.05）。在培養(yǎng)48 h時候體外法測得保護率在80%以上，用半體內（尼龍袋）法測得結果在70%以上，雖然結果有差異但能夠說明新研發(fā)的C1產品在瘤胃內基本能夠得到有效的保護。

2.1.2 過瘤胃膽堿在小腸中的降解率測定（見表3、表4）

表3 體外法測過瘤胃膽堿小腸降解率（%）

表4 半體內移動尼龍袋法測過瘤胃膽堿小腸降解率（%）

半體內移動尼龍袋法以3頭奶牛分為A、B、C3組做為平行組，每個平行6個重復，所得A、B、C3組值分別為各組6個重復的平均值。從表3和表4可以看出，用移動尼龍袋法得出的3組結果與體外小腸法測得的4 h時候降解率相似，在4 h時候體外法測定小腸降解率為87.22%，移動尼龍袋測得各組降解率平均值為88.04%，兩種方法測得結果看出在4 h時候產品C1的小腸釋放率在85%以上，通過上面兩種方法所測的結果可以看出，此過瘤胃膽堿產品在小腸環(huán)境中能夠迅速的釋放。由此可以說明C1產品在小腸內沒有發(fā)生過保護現象。

表5 試驗第11～14 d血液中三種指標測定

2.2 過瘤胃膽堿對奶牛血液指標的影響

試驗中當P≤0.05時具有統(tǒng)計學意義，P≤0.15時具有統(tǒng)計學趨勢。從表5可以看出，奶牛采食過瘤胃膽堿（RPC）后血液NEFA濃度顯著下降（P＜0.05），RPC對血漿β-HBA濃度沒有影響（P＞0.05），飼喂RPC對血糖濃度有增加的趨勢（P＜0.15）。

3 討論

3.1 新研發(fā)C1產品性能評定

試驗采用體外法與半體內法相結合檢測新研發(fā)膽堿是否能夠滿足對過瘤胃產品基本性能的要求，試驗測定了新研發(fā)C1產品在瘤胃內的保護率及小腸的降解率，這兩個指標也是最便捷的反映過瘤胃產品性能的指標。據報道，通過這兩個指標測定了某過瘤胃膽堿產品的瘤胃保護率以及小腸降解率，試驗結果表明這種過瘤胃膽堿產品的瘤胃保護率達到85%以上，小腸降解率達到95%以上。此研發(fā)的過瘤胃膽堿產品的瘤胃保護率與小腸降解率較以上產品還有差距，有待進一步改進，但通過研究發(fā)現此研發(fā)的過瘤胃膽堿產品的瘤胃保護率能夠達到70%以上，小腸降解率在85%以上，也能夠達到過瘤胃產品的基本要求，即在奶牛生理消化期間產品在瘤胃內基本穩(wěn)定不被降解，大部分能夠通過瘤胃。在小腸內也能夠在短時間迅速釋放。

有研究表明[13]，采用移動尼龍袋法測定飼料在小腸的降解情況，首先需要將飼料樣品在瘤胃內預培養(yǎng)16 h，因為普遍認為16 h這個時間能反映到達小腸前瘤胃代謝的狀況。因此本試驗也采用16 h的瘤胃非降解飼料殘渣作為小腸消化率的測定。試驗采用體外法與移動尼龍袋法兩種方法測定小腸降解率，從測得結果來看，這兩種方法都能夠較準確的測定膽堿的小腸降解率，但移動尼龍袋法不能顯示出各個時間點的降解率。有研究指出[14]，用三步法與體內法測定蛋白質的小腸消化率，兩種方法數值間的相關性是很高的（R2=0.91）。所以，在測定過瘤胃膽堿的小腸消化率時使用三步法是可行的，而其所測得的結果也是可靠的。

3.2 過瘤胃膽堿對血糖含量的影響

王俊峰等（2004）[15]研究發(fā)現，血液中葡萄糖含量反映了機體對糖的消化、吸收、代謝的過程，它能夠體現機體的能量代謝水平，反芻動物90%的血糖來自于肝糖異生。奶牛體內葡萄糖主要用于維持組織器官的需要以及泌乳需要，奶牛產后產奶量上升很快，因此對葡萄糖的需要量逐漸增多，奶牛在這個階段很容易發(fā)生能量負平衡。Goselink等（2012）[16]研究發(fā)現，在日糧中添加經過過瘤胃保護的氯化膽堿可以提高奶牛的血糖含量，能夠維持高產期血糖平衡。Hartwell等（2001）[17]報道飼喂過瘤胃保護氯化膽堿對血糖含量無顯著影響。徐國忠等（2005）[18]通過對圍產期奶牛添加RPC后發(fā)現，RPC有增加血糖和降低非酯化脂肪酸的趨勢，但差異不顯著（P＞0.05），這些試驗結果顯示了過瘤胃膽堿能夠穩(wěn)定奶牛血糖水平，提高抵抗能量負平衡的能力。本次試驗表明飼喂RPC有增加血糖濃度的趨勢，由于采樣期間限飼兩組采食量相近，血糖濃度的改變與能量攝入無關。由此可以看出血糖濃度的改變與攝入的RPC有關。

3.3 過瘤胃膽堿對β-羥基丁酸含量的影響

過瘤膽堿對奶牛血漿β-羥基丁酸的影響，β-羥基丁酸是酮體中含量最多的成分，是判斷奶牛酮病的一個重要指標。Pinotti等（2001）[14]發(fā)現，日糧中添加膽堿具有降低奶牛血漿β-羥基丁酸水平的趨勢。有研究結果顯示，在產后的35 d內，奶牛飼喂10 g/d的過瘤胃膽堿，血漿內β-羥基丁酸含量低于未添加過瘤胃膽堿的對照組。Hartwell等（2001）[17]研究也指出 RPC對產犢時血漿β-羥基丁酸無影響。本次試驗測得RPC對血漿β-羥基丁酸濃度沒有影響，表明過瘤胃膽堿產品對肝臟生酮作用沒有影響。

3.4 過瘤胃膽堿對非酯化脂肪酸（NEFA）含量的影響

圍產期的高產奶牛機體通常處于能量負平衡狀態(tài)，脂肪動員是圍產期奶牛能量負平衡的必然結果。脂肪的分解一方面能夠降低糖異生所引起的能量欠缺，另一方面由于脂肪分解產生的大量非酯化脂肪酸（NEFA）進入血液及肝臟，使得血液中的NEFA濃度升高，由此可引發(fā)脂肪肝和酮病。NEFA與奶牛體內能量代謝相關，是脂肪分解的產物，所以是反映體內脂肪代謝程度的可靠指標。研究表明，過瘤胃膽堿能降低奶牛圍產期能量負平衡時期的血液中NEFA含量。Hartwell等（2001）[17]報道，奶牛飼喂 6 g/d 過瘤胃膽堿可降低血清內的非酯化脂肪酸含量，每頭飼喂12 g/d的過瘤胃膽堿的奶牛在分娩時能保持較低的非酯化脂肪酸濃度。有前人在圍產期奶牛添加過瘤胃膽堿結果顯示，奶牛肝臟內糖原比對照組增加，而非酯化脂肪酸、β-羥基丁酸無顯著差異。有一些研究發(fā)現，在奶牛飼料中添加過瘤胃膽堿，奶牛血清中NEFA濃度與對照組無顯著差異[19]。研究采用RPC產品代替皺胃灌注方式，結果表明RPC產品的添加對血清中NEFA濃度無影響，還有研究表明，添加RPC28 d后肥育薩福羊血液中NEFA濃度顯著升高（P＜0.05）。前人研究結果大多表明，產前28 d或21 d補充RPC可降低圍產期奶牛血漿NEFA濃度[20]。但這些研究同時也發(fā)現飼喂RPC的奶牛干物質采食量和能量攝入量提高，這可能是NEFA下降的原因[21]。本試驗限飼階段，奶牛攝入的能量僅為妊娠和維持所需總能的30%，奶牛采食RPC后血漿NEFA濃度下降（P＜0.05）。添加RPC后血漿NEFA濃度下降，表明膽堿對脂肪組織動員或血液NEFA清除具有一定作用，改善了奶牛的能量負平衡。

4 結論

①新研發(fā)過瘤胃膽堿產品C1能夠達到在過瘤胃產品的基本要求。

②對能量負平衡時期奶牛補充過瘤胃膽堿產品C1可以降低能夠引起脂肪肝的非酯化脂肪酸含量，但對能夠引起酮病的β-羥基丁酸含量沒有顯著影響。對奶牛能量代謝有改善的趨勢。