液態(tài)發(fā)酵凝結(jié)芽孢桿菌制劑的制備工藝及性能評價

■卜小麗 房一粟 劉世操 韓朋偉 吳豐惟 祝愛俠，2

（1.武漢輕工大學(xué)動物營養(yǎng)與飼料安全湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢 430023；2.武漢輕工大學(xué)畜禽飼料工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430023）

近年來，隨著無抗飼料的發(fā)展，凝結(jié)芽孢桿菌已成為飼料添加劑領(lǐng)域的關(guān)注熱點。凝結(jié)芽孢桿菌為兼性厭氧菌，當(dāng)其進入腸道后會消耗游離氧，并在腸道中定植，降低腸道中的氧化還原電勢和pH值，從而達到調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，增加腸道內(nèi)乳酸菌、雙歧桿菌等益生菌的數(shù)量。通過自身代謝產(chǎn)生細菌素抑制并排除致病抗原，刺激抗體以及抗炎細胞因子的分泌，增強共生細菌的免疫應(yīng)答，從而有效增強腸道黏膜免疫，減少腸道疾病的發(fā)生，促進動物健康生長。凝結(jié)芽孢桿菌在臨床上應(yīng)用效果的關(guān)鍵取決于其本身菌種數(shù)，要以凝結(jié)芽孢桿菌死菌（細胞組成部分和代謝產(chǎn)物）狀態(tài)進入腸道，僅可供給腸道一部分養(yǎng)分。而且凝結(jié)芽孢桿菌不同于其它的益生菌，由于菌體在腸道上皮細胞的黏附性較弱，在自然條件下一般很難在腸道中存在，當(dāng)腸道內(nèi)凝結(jié)芽孢桿菌的含量達到一定值后，菌體在腸道內(nèi)的代謝產(chǎn)物所發(fā)揮的益生功效將會占據(jù)主導(dǎo)地位。Zhou等認為，在動物日糧中芽孢桿菌菌種數(shù)達106cfu/g或107cfu/g時效果比較明顯。本研究旨在研究凝結(jié)芽孢桿菌的發(fā)酵條件、發(fā)酵液的濃縮方式、載體吸附等工藝，并對產(chǎn)品進行了模擬胃腸道、耐藥性、耐高溫和貯存期等效果的評價，為工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌種：本實驗室篩選保存的一株已被證明能提高仔豬生長性能的BCRC11592凝結(jié)芽孢桿菌。

種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/l、牛肉浸出粉3 g/l、氯化鈉5 g/l（計數(shù)培養(yǎng)基需要另外添加15 g瓊脂），調(diào)節(jié)pH值為6.5，121℃滅菌20 min后冷卻至室溫。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉5 g/l、小麥麩皮10 g/l、氯化銨7.5 g/l、豆粕粉 7.5 g/l、NaCl 5 g/l、MnSO4·H2O 0.3 g/l、K2HPO4·3H2O 1 g/l，調(diào)節(jié)pH值為6.5，121 ℃滅菌20 min后冷卻至室溫。

稀釋液：蒸餾水121℃滅菌20 min后冷卻至室溫。

主要設(shè)備：OBF-SF-10 L+50 L微生物發(fā)酵罐（上海歐奔生物工程有限公司）、XD-12-500小試膜過濾設(shè)備（合肥信達膜科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 凝結(jié)芽孢桿菌菌液的制備

活化菌株：將保藏的菌種接種于液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h。

菌種純化：將活化后的菌株接于固體平板培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h。

種子液制備：挑取平板中純化培養(yǎng)的單一菌落接種于種子液體培養(yǎng)基中，40℃、140 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

1.2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

發(fā)酵培養(yǎng)基的前處理：發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源富含淀粉，經(jīng)高溫滅菌后容易結(jié)塊堵塞發(fā)酵罐管道，因此在發(fā)酵之前需要對發(fā)酵培養(yǎng)基進行前處理。前處理方式參考麥麩培養(yǎng)基的制作，發(fā)酵培養(yǎng)基∶水（w∶w）為1∶3，煮沸30 min，紗布過濾制得濃縮培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)：250 ml三角瓶分裝35 ml，接種1%的種子液，搖床溫度設(shè)定為40℃，轉(zhuǎn)速為140 r/min，培養(yǎng)24 h，分別測定各瓶菌種數(shù)和芽孢數(shù)。

培養(yǎng)條件單因素試驗：本試驗采用10 L發(fā)酵罐進行試驗，分別單獨控制通氣量和攪拌速度，同時記錄發(fā)酵罐的pH值。

1.2.3 菌劑制備

微濾：采用有機陶瓷膜過濾設(shè)備，將發(fā)酵液倒入料斗中，濃縮至上清液基本不再流出，測定料斗中濃縮液中活菌含量，并計算濃縮倍數(shù)。

吸附：用礦物質(zhì)吸附劑與濃縮液進行混合吸附，選擇最佳吸附比例。

1.2.4 產(chǎn)品評價

①模擬制粒溫度：利用水浴鍋模擬制粒溫度，取0.1 g產(chǎn)品于1.5 ml滅菌離心管中，放置于設(shè)定溫度為85℃的水浴鍋中，作用時間為10 min，測量菌種數(shù)，計算產(chǎn)品菌種的存活率，做3個重復(fù)，評價產(chǎn)品耐熱性。

②模擬胃腸液環(huán)境：即在人工模擬胃液中培養(yǎng)1 h，繼而轉(zhuǎn)移到人工腸液中培養(yǎng)2 h，記錄菌種數(shù)，計算菌體存活率，評價產(chǎn)品耐酸性和耐膽鹽能力。

③藥敏試驗：WS/T 125—1999紙片法抗菌藥物敏感試驗標準，對選取的阿莫西林、氟苯尼考、新霉素進行藥敏試驗，評價產(chǎn)品對常用口服抗生素的敏感性。

④貯存期試驗：將產(chǎn)品以1 g/支獨立包裝，分別放入25℃和35℃培養(yǎng)箱，分別在貯存第7、30、60 d取出兩管樣品測定菌種存活率，評價產(chǎn)品的穩(wěn)定性。

1.3 計數(shù)方法

采用稀釋平板計數(shù)法，芽孢計數(shù)則采用把培養(yǎng)后菌液于80℃水浴10 min后稀釋涂平板計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)基的前期處理對菌種數(shù)量和芽孢數(shù)的影響（見圖1）

圖1 培養(yǎng)基的前期處理對菌種數(shù)和芽孢數(shù)的影響

由圖1可知，培養(yǎng)基蒸煮過濾前后發(fā)酵所得菌種數(shù)和芽孢數(shù)量相差不大，蒸煮過濾后獲得的菌種數(shù)還略有增加。經(jīng)試驗證明，培養(yǎng)基的蒸煮過濾不僅不會影響發(fā)酵效果，還會促進菌體的產(chǎn)生，因此可采用此方法對培養(yǎng)基進行前處理。

2.2 凝結(jié)芽孢桿菌制劑發(fā)酵工藝的研究

2.2.1 發(fā)酵罐的通氣量對菌種數(shù)量和芽孢數(shù)的影響（見表1）

表1 發(fā)酵罐通氣量對菌種數(shù)和芽孢數(shù)的影響

由表1可知，隨通氣量增加，菌種數(shù)和芽孢數(shù)均呈先增加再減少的趨勢。且通氣量為350 L/h時活菌數(shù)顯著低于通氣量為300 L/h活菌數(shù)（P＜0.05），但兩者均可達到109數(shù)量級；與此同時，通氣量為350 L/h的芽孢數(shù)可達109數(shù)量級，是300 L/h時的24倍。綜合考慮，確定發(fā)酵灌的通氣量為350 L/h。

2.2.2 發(fā)酵罐的攪拌速度對活菌數(shù)和芽孢數(shù)的影響（見表2）

表2 攪拌速度對菌種數(shù)和芽孢數(shù)的影響

由表2可知，活菌數(shù)和芽孢數(shù)隨攪拌速度的增加出現(xiàn)先增加后減少的趨勢。225 r/min時的活菌數(shù)顯著高于 150、175、200、250 r/min時的活菌數(shù)（P＜0.05）；200 r/min時的芽孢數(shù)顯著高于150、175、225、250 r/min時的芽孢數(shù)（P＜0.05）。由表2數(shù)據(jù)分析可知，攪拌速度為225 r/min芽孢數(shù)比200 r/min低了一個數(shù)量級；當(dāng)攪拌速度為200 r/min芽孢數(shù)最高，此時活菌數(shù)可達109數(shù)量級。綜合考慮，確定攪拌速度為200 r/min。

2.3 菌劑制備（見表3）

表3 膜分離對發(fā)酵液的濃縮效果

發(fā)酵完成后的菌液采用有機陶瓷膜過濾設(shè)備進行濃縮，其工作條件為：操作壓力0.14～0.16 MPa，溫度37～40℃，濃縮時間40 min。由表3可知，發(fā)酵液經(jīng)過膜分離設(shè)備可濃縮2.86倍，濃縮效果明顯，菌種損失率低。再用礦物質(zhì)吸附劑按1∶1均勻吸附發(fā)酵濃縮液，按此比例不需再干燥處理。產(chǎn)品為粉末狀，無結(jié)塊，按壓無痕跡，與原吸附劑相比產(chǎn)品顏色略黃，有少許發(fā)酵液的味道。

2.4 產(chǎn)品評定

2.4.1 產(chǎn)品對胃腸液耐受性評價（見圖2）

由圖2可知，在經(jīng)過模擬胃消化環(huán)境后，產(chǎn)品的菌種存活率有一定下降，但過胃后菌種存活率仍可以保持在85%以上；0.3%豬膽鹽的模擬腸液環(huán)境也會導(dǎo)致菌種存活率下降。在經(jīng)過胃腸液后，產(chǎn)品最終存活率可以保持在60%以上。

圖2 產(chǎn)品對胃腸液耐受情況

2.4.2 產(chǎn)品對常用口服抗生素的敏感性評價（見圖3）

圖3 產(chǎn)品對常見口服抗生素敏感性評價

由圖3a可見，阿莫西林藥敏試紙幾乎沒有出現(xiàn)明顯抑菌圈，因此產(chǎn)品對阿莫西林（28～36 mm為敏感）不敏感；由圖3b可見，新霉素（≥17 mm即為敏感）藥敏試紙在涂滿產(chǎn)品浸出液的平皿上出現(xiàn)明顯抑菌圈，抑菌圈直徑為29 mm，表明產(chǎn)品對新霉素較為敏感；由圖3c可見，氟苯尼考（≥18 mm即為敏感）藥敏試紙在涂滿產(chǎn)品浸出液的平皿上出現(xiàn)十分明顯抑菌圈，抑菌圈直徑為43.5 mm，表明產(chǎn)品對氟苯尼考十分敏感。產(chǎn)品經(jīng)藥敏試驗表明，其對阿莫西林不敏感，對新霉素、氟苯尼考較敏感。

2.4.3 產(chǎn)品耐熱性評價（見表4）

由表4可知，凝結(jié)芽孢桿菌制劑在模擬制粒高溫85℃處理10 min后菌種數(shù)顯著降低（P＜0.05），但存活率仍舊保持70%以上，可以滿足對飼料的添加要求。

表4 產(chǎn)品耐熱性評價

2.4.4 產(chǎn)品貯存期的評價（見圖4）

如圖4所示，產(chǎn)品在貯存7 d后可以保持80%以上的存活率，貯存30 d依舊存活一半以上，而在貯存60 d后活菌數(shù)保持在108數(shù)量級，產(chǎn)品較一般的乳酸菌產(chǎn)品更耐儲存。

圖4 貯存時間和溫度對菌種的影響

3 討論

3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

3.1.1 培養(yǎng)基的前期處理

本試驗采用是價格低廉、易得的農(nóng)副產(chǎn)品培養(yǎng)基，經(jīng)蒸煮后，有利于其中淀粉質(zhì)、含氮物質(zhì)的分解，PO43-更好釋放，更利于被微生物的繁殖和芽孢的形成。經(jīng)過處理后的培養(yǎng)基可防止玉米粉、麥麩結(jié)塊堵塞發(fā)酵罐管道，使發(fā)酵罐通氣均勻，也利于菌體和芽孢的形成。因此，結(jié)合實際生產(chǎn)的需要，可發(fā)酵之前采用對培養(yǎng)基進行前處理。

3.1.2 通氣量、攪拌速度對發(fā)酵效果的影響

在臨床上應(yīng)用效果的關(guān)鍵取決所添加的菌種數(shù)，凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵條件的探索是為了獲得大量菌體和抗逆性高的芽孢。本文采用已優(yōu)化培養(yǎng)基在通氣量為350 L/h活菌數(shù)和芽孢數(shù)均可達到109cfu/ml，芽孢得率（芽孢數(shù)/菌種數(shù)）高達93.0%，與劉鑫磊等采用補料分批發(fā)酵方式，菌體濃度達到4.5×109cfu/ml，芽孢濃度達到1.2×109cfu/ml的結(jié)果一致。葛風(fēng)清等對凝結(jié)芽孢桿菌AHU1366的培養(yǎng)條件進行了研究，芽孢形成率為80%；戚薇等中空纖維膜過濾法高密度培養(yǎng)凝結(jié)芽孢桿菌得率可達75%，最終菌體濃度為1.6×1010cfu/ml；本文與之相比芽孢得率高，但菌體密度略低。攪拌速度和通氣量都可調(diào)節(jié)溶氧量，溶氧量的增加促進了菌體和芽孢的生成，但溶氧量達到一定程度也會抑制菌體生長和芽孢形成。本試驗表明，攪拌速度為200 r/min、通氣量350 L/h為最佳發(fā)酵工藝參數(shù)，與陳紅秋等報道一致。本試驗中發(fā)酵培養(yǎng)基以價廉、易得農(nóng)副產(chǎn)品為主要原料發(fā)酵工藝較簡單易控發(fā)酵，芽孢形成率可達90%以上。因此，小試生產(chǎn)獲得的最佳培養(yǎng)條件可應(yīng)用于實際生產(chǎn)，但需進一步探究提高芽孢產(chǎn)量和菌體密度的方法。

3.2 菌劑制備

因發(fā)酵液濃度低，不利于貯存、運輸和添加，因此需要濃縮處理。有機膜過濾設(shè)備具有機械強度高、且耐化學(xué)腐蝕、清洗再生性能好，兼?zhèn)溆懈咝н^濾與精密過濾等優(yōu)點，已被引入發(fā)酵行業(yè)。本試驗所用礦物質(zhì)吸附劑表面分布著一層均勻的硅氧烷和硅烷醇基，這些基團具有很強的吸水性。硅烷醇基化學(xué)活性高，并且還可作為飼料抗結(jié)劑添加，小于其添加量（0.5%）時均不會對動物產(chǎn)生不良影響，可以選用此物質(zhì)作為吸附劑。觀察吸附后的產(chǎn)品狀態(tài)，選擇最佳固液質(zhì)量比為1∶1。最終產(chǎn)品為細粉狀，不需要烘干處理即可使用。

3.3 產(chǎn)品評價

本工藝制備的產(chǎn)品在pH值為2的胃液中存活率為86.8%，劉轉(zhuǎn)等將仔雞腸道內(nèi)分離的凝結(jié)芽孢桿菌置于pH值為1.5、2.5的模擬胃液中測得存活率分別為53%、81%，試驗結(jié)果與文獻報道相差不大；董超等研究發(fā)現(xiàn)未經(jīng)過包埋處理的飼用納豆芽孢桿菌在pH值為1.5的模擬胃液環(huán)境中的存活率僅為20%，本工藝制備的凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)品的耐酸性能比較理想。因本文的試驗操作方法與張媛媛等的試驗操作比較接近，而本工藝制備的凝結(jié)芽孢桿菌制劑的消化后存活率為71%，優(yōu)于部分市售產(chǎn)品，但較普通菌種發(fā)酵液存活率偏低，可能是制備工藝對菌種性能有一定影響。藥敏試驗結(jié)果與文獻報道中的結(jié)果相似，產(chǎn)品與抗生素配伍使用情況比較明確。郭照輝對凝結(jié)芽孢桿菌液體菌劑的保存期進行研究，發(fā)現(xiàn)添加防霉劑和調(diào)節(jié)pH值可以使得保存30 d菌體存活約80%，保存180 d存活率高于50%。此外，也有研究表明，吸附后的凝結(jié)芽孢桿菌粉劑保存60 d菌體存活率高于80%。然而，本產(chǎn)品在保存60 d后其菌種數(shù)只可以保持108數(shù)量級，因此，此凝結(jié)芽孢桿菌粉劑的貯存條件，還需進一步探究。所以，目前本研究僅僅是一個初級研究階段，距離應(yīng)用到畜禽中還有很長一段時間。

4 結(jié)論

①在本試驗條件下，對發(fā)酵培養(yǎng)基進行前處理不會影響發(fā)酵效果；在通氣量為350 L/h、攪拌速度為200 r/min時可以達到最佳的發(fā)酵效果。

②通過凝結(jié)芽孢桿菌制劑進行體外消化試驗、體外藥敏試驗、耐高溫試驗和產(chǎn)品儲存試驗，表明此產(chǎn)品具有耐酸、耐膽鹽、耐高溫和易于儲存等優(yōu)良特性。

（參考文獻20篇，刊略，需者可函索）