花魔芋離體再生體系的建立

秦廷豪 李曉梅 張軍 黃運(yùn)軍

摘要：以花魔芋（Amorphophallus konjac）為材料比較不同滅菌方式對不同外植體的滅菌效果及生長的影響，不同激素濃度及組合對魔芋愈傷組織、不定芽誘導(dǎo)的影響，探討了固液2種培養(yǎng)方式對繼代培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明：球莖和根狀莖均可作為較為理想的外植體;魔芋愈傷組織誘導(dǎo)最適激素組合為MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA，最適不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2.0～2.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA或MS+0.5 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA;液體培養(yǎng)更適合魔芋愈傷的繼代增殖，其不定芽平均增殖率可達(dá)4.69。

關(guān)鍵詞：花魔芋（Amorphophallus konjac）;再生體系;愈傷組織;不定芽

中圖分類號(hào)：S632.3 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2015）23-6054-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.23.066

Establishment of Regeneration System in vitro Culture of Amorphophphallus Konjac

QIN Ting-hao1，LI Xiao-mei2，ZHANG Jun1，HUANG Yun-jun1

（1.Sichuan Province Plant Engineering Research Institute， Zizhong 641200，Sichuan，China;

2.Sichuan Provincial Academy of Agricultural Sciences Institute of Rice and Sorghum，Deyang 618000，Sichuan，China）

Abstract：Taking Amorphophphallus konjac as material， the effects of different sterilizing methods on the regeneration capacity of different explants were compared， the influences of different hormone levels on callus and adventitious buds induction were studied， and the effects of solid culture and liquid culture on subculture were also discussed. The results showed that corm and rhizome are the optimum explants for callus induction. The optimum hormone combination for konjac callus induction is MS 1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA， and the optimum media for adventitious buds induction is MS+2.0～2.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA or MS+0.5 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA， and liquid culture would be suitable for subculture of konjac callus， the reproduction rate of adventitious buds can be up to 4.69.

Key words： Amorphophallus konjac; regeneration system; callus; adventitious bud

魔芋（Amorphophphallus sp）是中國傳統(tǒng)栽培的重要作物，在四川、云南、貴州、湖北、廣西和臺(tái)灣等地有廣泛分布[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國現(xiàn)有魔芋屬植物21種，可食用的有9種，其中大面積主栽培種為花魔芋（A.knojac）和白魔芋（A.albus）[2]。魔芋是迄今發(fā)現(xiàn)的植物界中惟一能大量合成葡甘聚糖（Konjac glucomannan，KGM）的高等植物。葡甘聚糖是魔芋地下球莖主要貯藏物質(zhì)，為一種高分子碳水化合物，具有良好的膠溶性、凝膠性、增稠性、成膜性及與其他植物膠的復(fù)配性等優(yōu)點(diǎn)，因而在食品、化工和醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的用途[3]。

通常利用根狀莖或小球莖對魔芋進(jìn)行無性繁殖，其種芋生產(chǎn)存在繁殖系數(shù)極低，生長周期長，農(nóng)藝性狀一致性差，變異、退化及病害積累嚴(yán)重等問題。根狀莖和小球莖當(dāng)年不能形成商品芋，用于商品芋的魔芋種芋數(shù)量有限，不能滿足生產(chǎn)的需要，制約了魔芋種植及相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[4]。開展魔芋組織培養(yǎng)技術(shù)的研究，形成一套適合魔芋自身特點(diǎn)的離體繁殖體系，是建立魔芋良種繁育體系的前期工作，也是解決目前魔芋生產(chǎn)中種芋問題的關(guān)鍵。有關(guān)魔芋的組織培養(yǎng)已經(jīng)取得較多研究成果[5，6]，但仍存在前期培養(yǎng)污染率高，不同魔芋品種在分化能力、分化周期、繁殖系數(shù)及試管苗存活率等方面相差較大等問題。本試驗(yàn)以四川省資中地區(qū)花魔芋農(nóng)家品種為材料，比較不同滅菌方式對不同外植體的滅菌效果及生長的影響，不同激素濃度及組合對魔芋愈傷組織、不定芽誘導(dǎo)的影響，探討了固液2種培養(yǎng)方式對繼代培養(yǎng)的影響，旨在建立該材料最佳的離體再生體系，為魔芋良種的生產(chǎn)提供指導(dǎo)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試球莖、根狀莖、幼葉柄取自資中縣花魔芋農(nóng)家品種，種植于四川省植物工程研究院試驗(yàn)地。

1.2 ?方法

1.2.1 ?滅菌方法與外植體的篩選 ?將田間釆回的魔芋球莖、根狀莖及長約10 cm由鱗片包裹的葉組織洗凈，放入800倍多菌靈稀釋液中浸泡5 min，于流水下沖洗30 min后，球莖、根狀莖刮去表皮晾干待用，葉柄去3層鱗片，于超凈工作臺(tái)上滅菌，75%乙醇滅菌1 min，采用0.1%、0.2%HgCl2溶液分別滅菌10、15 min，用無菌蒸餾水清洗4次，每次5 min。將滅菌后的球莖、根狀莖切成大小約1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm的塊狀，葉柄切成約0.5 cm厚的圓餅，轉(zhuǎn)入MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+5.5 g/L瓊脂+0.5g/L活性炭（pH=5.8）的培養(yǎng)基中，每處理接種30個(gè)外植體，30 d后統(tǒng)計(jì)污染數(shù)、褐變壞死數(shù)及誘導(dǎo)率。

1.2.2 ?愈傷組織的誘導(dǎo) ?將篩選的最佳外植體接種于添加不同激素的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，其基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，并添加3%蔗糖、0.55%的瓊脂與0.5 g/L的活性炭，pH=5.8。外植體于25 ℃黑暗中培養(yǎng)30 d 后，轉(zhuǎn)入1 500 lx光照條件下培養(yǎng)，每4周轉(zhuǎn)接一次，60 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)情況。

1.2.3 ?愈傷組織的分化培養(yǎng) ?將誘導(dǎo)出的良好愈傷組織轉(zhuǎn)入不同的分化培養(yǎng)基中，其基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，并附加3%蔗糖、0.55%的瓊脂與0.2 g/L活性炭，pH=5.8。愈傷組織于25 ℃、2 000 lx光照條件下培養(yǎng)，每4周轉(zhuǎn)接一次，轉(zhuǎn)接時(shí)輕輕刮去表皮黑色物質(zhì)，45 d后統(tǒng)計(jì)分化情況及成苗數(shù)。

1.2.4 ?繼代培養(yǎng) ?預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，愈傷組織分化出的幼苗會(huì)抑制周圍不定芽的分化，因此需將分化芽與愈傷組織分開進(jìn)行繼代培養(yǎng)，將2種培養(yǎng)材料分別繼代于固、液培養(yǎng)基中（MS+2.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA+5.5 g/L瓊脂+0.2 g/L活性炭）培養(yǎng)，45 d后觀察不同培養(yǎng)方式對其繼代增殖的影響。

1.2.5 ?生根培養(yǎng)及煉苗移栽 ?將長至4 cm左右，葉片露出鱗片的幼苗切下，移入不同濃度6-BA與NAA組成的1/2MS生根培養(yǎng)基中，當(dāng)幼苗葉片充分展開，健壯根數(shù)達(dá)3條以上時(shí)，將培養(yǎng)瓶移出培養(yǎng)室，室外遮陰煉苗7 d以上，移栽前打開瓶蓋煉苗2 d，于自來水下清洗干凈幼苗上殘留的培養(yǎng)基，置入500倍農(nóng)用鏈霉素+800倍多菌靈的混合液中浸泡10 min，移栽至園土∶蛭石=1∶1（體積比）的盆缽內(nèi)，放于陰蔽處，每天噴施自來水保持濕度，7 d后移入適度遮陰條件下培養(yǎng)。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?魔芋不同外植體經(jīng)不同滅菌處理后的誘導(dǎo)效果

外植體在接種3 d開始有不同程度的污染出現(xiàn)，未受污染的外植體7 d開始褐變或者膨大。由表1可知，不同滅菌處理對魔芋外植體的生長有不同影響。外植體的污染數(shù)隨著滅菌強(qiáng)度的增加而減少，壞死數(shù)隨著滅菌強(qiáng)度的增加而增加。根狀莖的壞死數(shù)量明顯高于球莖的壞死數(shù)，其原因在于球莖滅菌前體積較大，根狀莖體積較小、組織更加幼嫩，較高的滅菌強(qiáng)度對外植體有一定的殺傷作用，導(dǎo)致根狀莖壞死數(shù)較多，影響其誘導(dǎo)率。本試驗(yàn)中葉柄因滅菌強(qiáng)度大造成外植體壞死數(shù)量較多，但能看出葉柄作為外植體的脫分化能力較低，大多數(shù)外植體未進(jìn)行脫分化即褐化、死亡。球莖和根狀莖都可以作為較為理想的外植體，采用75%乙醇1 min+0.1%～0.2%HgCl2 15 min處理比較適合魔芋球莖和根狀莖的滅菌，其愈傷誘導(dǎo)率分別達(dá)63.3%、56.7%。

2.2 ?不同培養(yǎng)基對魔芋愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將魔芋球莖外植體接種于添加不同濃度生長調(diào)節(jié)劑組合的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，7 d左右開始膨大，并逐步在外植體表面形成瘤狀突起，起初的瘤狀突起小而密，呈淺綠色，后慢慢變大，一些突起變成粉紅色、淺白色或暗綠色（圖1），其質(zhì)地緊密，較難切割，少部分愈傷組織慢慢褐化，質(zhì)地軟，切后水分多，僅中心為白色，周圍全部變黑，失去增殖能力，這與胡建斌等[7]觀察的魔芋愈傷組織形態(tài)結(jié)果一致。各組合對魔芋球莖愈傷組織誘導(dǎo)的效果見表2。

由表2可知，魔芋球莖外植體在不同濃度生長調(diào)節(jié)劑組合下其愈傷誘導(dǎo)率差異明顯，其最優(yōu)組合為1.0 mg/L 6-BA +1.0 mg/L NAA，其次為2.0 mg/L 6-BA +2.0 mg/L NAA，愈傷誘導(dǎo)率分別為68.42%、65.38%，可見當(dāng)細(xì)胞分裂激素與生長素比值接近時(shí)更利于魔芋愈傷組織的形成。

2.3 ?不同培養(yǎng)基對魔芋愈傷組織分化的影響

魔芋愈傷組織在轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基約30 d左右開始分化，其分化途徑有兩種：①瘤狀突起上長出淡綠色或粉色帶鱗片的芽點(diǎn)，但有部分芽為無效芽，僅有鱗片分化，鱗片中間無有效生長點(diǎn)（圖2a）。②瘤狀突起分化出底部圓球狀的擬球莖，其上有一個(gè)淡粉色或白色較大芽，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，擬球莖上會(huì)分化出側(cè)芽（圖2b），這與前人觀察到的分化途徑相似[8]。分化的有效芽鱗片慢慢伸長，變成粉色或綠色，待鱗片長至3 cm左右后，可見綠色葉片長出。

愈傷組織的分化途徑雖然相似，但其在不同濃度激素組合下，其分化能力各有不同。由表3可知，在生長素不變的情況下不定芽的分化率及出芽數(shù)大多隨著6-BA濃度的提高而增加，其適宜培養(yǎng)基為2.0～2.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA。TDZ為高效細(xì)胞分裂素，在相對較低濃度下具有較好的分化效果，最佳濃度為0.5 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA，雖然TDZ對不定芽的誘導(dǎo)效率稍好于6-BA，但其價(jià)格較高，為了節(jié)約成本在生產(chǎn)上選擇6-BA。

2.4 ?不同培養(yǎng)方式的魔芋繼代效果

將愈傷組織上分化的較大芽切下，分別轉(zhuǎn)入基本培養(yǎng)基MS附加2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA的固體和液體培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在頂端優(yōu)勢解除后，不定芽能較快進(jìn)行伸長生長，并且愈傷組織迅速膨大，可在較短時(shí)間內(nèi)完成進(jìn)一步的分化;繼代培養(yǎng)一個(gè)周期（45 d）統(tǒng)計(jì)表明，固體繼代培養(yǎng)與液體繼代培養(yǎng)的芽增殖倍數(shù)分別為2.53、4.69，相比固體培養(yǎng)基而言，液體培養(yǎng)基中愈傷組織褐變減輕，分化的不定芽更健壯，長成的苗葉柄更粗，葉片更厚實(shí)，葉色更綠（圖3），因此其最適宜魔芋愈傷組織及分化繼代培養(yǎng)。

2.5 ?生根及煉苗移栽情況

在增殖培養(yǎng)過程中，分化出的不定芽在生長的同時(shí)，有大約一半芽的基部有1～3條根形成，在不同濃度生長素的魔芋組培苗生根情況見表4。由表4可知，在同等濃度6-BA作用下，提高生長素NAA的濃度有利于魔芋根的形成，在NAA配合IBA的適當(dāng)濃度下，促進(jìn)根的形成和早發(fā)快生，能夠提早生根2～4 d，縮短生根時(shí)間，并形成更健壯和較多的根。待魔芋幼苗長至10 cm左右時(shí)，根數(shù)達(dá)3條以上后（圖4），將試管苗移出至室外弱光煉苗7 d以上，移栽前洗凈根部培養(yǎng)基，進(jìn)行根部滅菌處理后移栽入蛭石∶園土（1∶1，體積比）的基質(zhì)中，前10 d控制好光、溫和濕度，其成活率可達(dá)95%以上（圖5）。

3 ?小結(jié)與討論

在組織培養(yǎng)中，外植體的選擇是關(guān)鍵，不同外植體其再生能力有所不同，決定著組織培養(yǎng)的成敗與效率。魔芋前期培養(yǎng)污染嚴(yán)重一直是影響魔芋無菌再生體系建立的重要因素，不同來源的外植體應(yīng)選擇其適宜的滅菌處理強(qiáng)度，以達(dá)到減少污染且不影響再生的目的。本試驗(yàn)對不同滅菌處理后的魔芋球莖、根狀莖及葉柄的愈傷組織誘導(dǎo)能力進(jìn)行了對比，結(jié)果表明根狀莖不易滅菌且容易受滅菌劑的影響，導(dǎo)致褐變壞死，但具有較強(qiáng)的脫分化能力，葉柄再生能力低，因此根狀莖和球莖都可作為魔芋愈傷組織誘導(dǎo)的理想外植體，其相應(yīng)最佳滅菌方式為75%乙醇1 min+0.2%HCl2 15 min。

魔芋組織培養(yǎng)中，外源激素種類和不同濃度配比對愈傷組織及不定芽的誘導(dǎo)起著重要作用。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞分裂素與生長素濃度接近時(shí)其愈傷組織誘導(dǎo)率較高，MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA為最佳的魔芋愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。2.0～2.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA或者0.5 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA為魔芋不定芽誘導(dǎo)分化最佳激素組合，但在實(shí)際應(yīng)用中考慮激素TDZ價(jià)格因素對生產(chǎn)成本的影響，因此，6-BA更適合應(yīng)用于魔芋大規(guī)模生產(chǎn)中。

有關(guān)液體培養(yǎng)應(yīng)用于魔芋再生體系建立的報(bào)道較少。本試驗(yàn)在分化繼代培養(yǎng)中對比了液體培養(yǎng)與固體培養(yǎng)的差異，發(fā)現(xiàn)液體培養(yǎng)的平均出芽數(shù)為4.69，是固體培養(yǎng)的1.85倍，并且液體培養(yǎng)具有降低褐變率、加快愈傷組織生長、提高平均出芽數(shù)、培育壯苗的作用，這與胡楠等[9]的研究結(jié)果相似。在繼代培養(yǎng)時(shí)還發(fā)現(xiàn)，其繼代增殖倍數(shù)與接入時(shí)的組織狀態(tài)有關(guān)，接入的愈傷組織越好，越利于增殖與分化，接入的愈傷組織較差時(shí)，很難形成新的愈傷和分化出不定芽。

魔芋組培苗較易生根，在繼代增殖過程中分化出的芽也能形成1～3條根，這有利于魔芋的一次成苗，縮短魔芋組培的時(shí)間。試驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)，魔芋組培苗的生根情況不但與加入的外源生長調(diào)節(jié)劑有關(guān)，而且與接入時(shí)的組培苗關(guān)系較大，過多的切除芽基部組織，不利于其生長和生根，很容易導(dǎo)致生根失敗和組培苗死亡。因此，進(jìn)行生根培養(yǎng)時(shí)必須給組培苗留一部分組織或小球體。

與其他植物組織培養(yǎng)相比，魔芋組培時(shí)的形態(tài)發(fā)生能力較差，形成有效芽的分化頻率較低，同步性差，這些都阻礙了魔芋組培的規(guī)模化生產(chǎn)，值得進(jìn)一步的研究與分析以破解這一難題。

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