畢赤酵母高密度發(fā)酵產(chǎn)β—甘露聚糖酶的工藝優(yōu)化

張曉龍+肖靜+王瑞明

摘要：以表達(dá)β-甘露聚糖酶的畢赤酵母工程菌為研究對(duì)象，采用搖瓶發(fā)酵確定碳源、接種量、溫度、pH基礎(chǔ)條件，通過30 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵，探究菌體濃度、甲醇濃度、甲醇補(bǔ)料方式、溶氧量等條件對(duì)目的蛋白產(chǎn)量的影響，并通過正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝條件。結(jié)果表明，最佳產(chǎn)酶條件為接種量10%，初始葡萄糖質(zhì)量濃度30 g/L，誘導(dǎo)溫度28 ℃，pH 5.0，溶氧量10%～20%。在此發(fā)酵條件下，最終細(xì)胞干重135 g/L，目的蛋白表達(dá)量5.04 g/L，最高酶活力29 600 U/mL，較優(yōu)化前提高24倍，已滿足工業(yè)化要求。

關(guān)鍵詞： β-甘露聚糖酶; 巴斯德畢赤酵母; 高密度培養(yǎng); 發(fā)酵優(yōu)化

中圖分類號(hào)：Q815 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2015）23-5978-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.23.047

Optimization Technology of β-Mannanase Fermented by Pichia pastoris

ZHANG Xiao-long，XIAO Jing，WANG Rui-ming

（Institute of Biological Engineering of Qilu University of Technology， Shandong Province Key Laboratory of Microbial Engineering，

Jinan 250353，China）

Abstract：The fermentation conditions of genetically engineered Pichia pastoris for β-Mannanase were studied. Basic conditions of the carbon source， immunization rates， temperature， pH were optimized in shake-flask. The tests in 30 L fermenter was applied to study the effects of DCW，methanol concentration and DO on enzyme production. Through the orthogonal design to optimize the fermentation conditions. The results indicated that the optimum conditions were as follows：10% inoculum size，30 g/L initial glucose concentration， 10%～20% DO，pH 5.0 at 28 ℃. The dry cell weight was 135 g/L，the target protein concentration could reach to 5.04 g/L. And the β-Mannanase activity got to be 29 600 U/mL，which was 24 times of that the results in the shake flask under these conditions.

Key words：β-Mannanase;Pichia pastoris;high cell density culture;fermentation optimization

β-甘露聚糖酶（β-1，4-D-mannan mannohydrolase，EC 3.2.1.78）是β-1，4甘露聚糖甘露糖苷水解酶的簡稱，屬于半纖維素酶類，廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥、紡織印染等方面[1]，在飼用酶制劑應(yīng)用方面尤其重要[2]，添加β-甘露聚糖酶可以降解飼料中含有的β-甘露聚糖，有助于消除甘露聚糖對(duì)機(jī)體胰島素分泌和胰島素樣生長因子（IGF）生成的抑制作用，提高葡萄糖吸收速率，促進(jìn)碳水化合物代謝過程，提高日糧能量利用率，是一種良好的飼料添加劑，也是抗生素的理想代替品[3]。

畢赤酵母（Pichia pastoris）表達(dá)系統(tǒng)既具有原核表達(dá)系統(tǒng)易于培養(yǎng)、繁殖快速、表達(dá)量高的優(yōu)點(diǎn)，又具有真核表達(dá)系統(tǒng)外源蛋白翻譯后再加工修飾等特點(diǎn)，目前已有超過500種外源蛋白在畢赤酵母中獲得成功表達(dá)。山東省微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建一株表達(dá)枯草芽孢桿菌β-甘露聚糖酶基因畢赤酵母工程菌，在前期工作的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)通過優(yōu)化畢赤酵母工程發(fā)酵最適pH、溫度、碳源濃度、接種量等基礎(chǔ)條件，以及選取在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中的重要因素甲醇補(bǔ)料方式、甲醇濃度、菌體濃度、DO值等，進(jìn)行畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達(dá)β-甘露聚糖酶的工藝優(yōu)化，獲得較為成熟的工藝，使酶活力達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)要求。

1 ?材料與方法

1.1 ?菌種

β-甘露聚糖酶畢赤酵母工程菌：山東省微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、保存[4]。

1.2 ?儀器設(shè)備

30 L發(fā)酵罐為上海國強(qiáng)生化裝備有限責(zé)任公司生產(chǎn)，配備溫度、溶氧、pH電極、壓縮空氣、氨氣、冷卻水以及蒸汽系統(tǒng)。

1.3 ?培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基（YPD）：20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：2.5%葡萄糖、5 g/L KH2PO4、3 g/L CaSO4、15 g/L K2SO4、15 g/L MgSO4、35 g/L NH4H2PO4、4.2 g/L KOH、12 g/L微量元素。endprint

分批補(bǔ)料培養(yǎng)基：50%甘油（W/V，g/mL）（含12 g/L微量元素溶液，g/mL）。

誘導(dǎo)劑：100%甲醇（含12 mL/L微量元素溶液）。

補(bǔ)料培養(yǎng)基：200 g NH4H2PO4、20 g CaSO4、100 g K2SO4、100 g MgSO4，定容至2 L。

微量元素溶液：參照Invitrogen表達(dá)手冊(cè)。

1.4 ?畢赤酵母表達(dá)β-甘露聚糖酶基礎(chǔ)條件優(yōu)化

1）在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%的葡萄糖或1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%的甘油作為碳源，單獨(dú)滅菌后混勻，調(diào)節(jié)pH 5.0，30 ℃、240 r/min培養(yǎng)24～30 h，初始碳源耗盡后，補(bǔ)充1 mL 50%甘油，甘油耗盡后饑餓培養(yǎng)0.5 h，每24 h補(bǔ)充100%甲醇0.4 mL，每24 h取發(fā)酵液測(cè)定酶活力，以確定最適碳源種類以及最適添加比例。

2）分別接種2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%YPD培養(yǎng)液（OD600 nm≈8.0）于發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，其他條件不變，測(cè)定酶活力確定最佳接種量。

3）誘導(dǎo)溫度梯度為26、28、30、32 ℃，其他條件不變，測(cè)定酶活力確定最佳接種量。

4）誘導(dǎo)pH梯度為4.5、5.0、5.5、6.0，其他條件不變，測(cè)定酶活力確定最佳接種量。

1.5 ?發(fā)酵罐高密度發(fā)酵β-甘露聚糖酶工藝優(yōu)化

1.5.1 ?發(fā)酵罐常規(guī)控制工藝 ?種子制備：YPD液體培養(yǎng)基于30 ℃、240 r/min培養(yǎng)至OD600 nm≈8.0時(shí)，按0.5%接入30 L種子罐中，30 ℃、400 r/min培養(yǎng)至OD600 nm≈8.0時(shí)，按8%接種量接入30 L發(fā)酵罐基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。細(xì)胞增殖階段：pH 5.5、溫度30 ℃、罐壓0.1 MPa、通氣量1 m3/h、轉(zhuǎn)速400～600 r/min。誘導(dǎo)表達(dá)階段：pH 5.0、溫度28 ℃、罐壓0.12 MPa、通氣量2.0～ 4.5 m3/h、轉(zhuǎn)速600～800 r/min，采用連續(xù)補(bǔ)料方式添加甲醇，測(cè)定培養(yǎng)基中N、P含量剩余30%時(shí)，添加補(bǔ)料培養(yǎng)基。

1.5.2 ?不同誘導(dǎo)前菌體濃度對(duì)赤酵母產(chǎn)β-甘露聚糖酶酶活力的影響 ?基礎(chǔ)培養(yǎng)基中葡萄糖耗盡后，通過控制流加甘油時(shí)間提高菌體濃度，使誘導(dǎo)前菌體濃度分別達(dá)到80、100、140、180 g/L，其他條件不變，發(fā)酵180 h，測(cè)定酶活力確定最佳誘導(dǎo)前菌體濃度。

1.5.3 ?甲醇濃度對(duì)畢赤酵母產(chǎn)β-甘露聚糖酶酶活力的影響 ?初始添加甲醇速度1 mL/L·h，之后每小時(shí)增加1個(gè)單位，直至達(dá)到8 mL/L·h，之后控制甲醇流加速度，中后期使甲醇濃度分別達(dá)到為0.5、1.0 g/L，其他條件不變，發(fā)酵180 h，測(cè)定酶活力確定最佳甲醇濃度。

1.5.4 ?溶氧量（DO）對(duì)畢赤酵母產(chǎn)β-甘露聚糖酶酶活力的影響 ? 甲醇誘導(dǎo)階段，通過調(diào)節(jié)罐壓及通氣量，控制溶氧量在10%～20%、20%～30%、30%～40%，其他條件不變，發(fā)酵180 h，測(cè)定酶活力確定最佳溶氧量。

1.5.5 ?補(bǔ)料方式對(duì)畢赤酵母產(chǎn)β-甘露聚糖酶酶活力的影響 ?畢赤酵母工業(yè)化大規(guī)模發(fā)酵時(shí)，甲醇補(bǔ)料方式基本分為分批式補(bǔ)料、連續(xù)式補(bǔ)料等[5]，據(jù)此確定以下3種甲醇添加方案進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)：①分批式補(bǔ)料，每次補(bǔ)入1%甲醇，待甲醇消耗完后繼續(xù)補(bǔ)料;②分批-連續(xù)式補(bǔ)料，誘導(dǎo)初期加入0.5%甲醇，甲醇消耗完后，繼續(xù)補(bǔ)加0.5%甲醇，10 h后控制流速為8 ～12 mL/（L·h）;③連續(xù)式補(bǔ)料，誘導(dǎo)初期補(bǔ)料速度為1 mL/（L·h），每小時(shí)提升一個(gè)單位，10 h后控制流加速度為8～12 mL/（L·h）。

1.5.6 ?正交試驗(yàn) ?為進(jìn)一步研究各因素間的相互關(guān)系，根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，選取接種量、碳源濃度、溶氧量、誘導(dǎo)前濕重對(duì)發(fā)酵影響較大的因素，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，按正交L9（34）安排試驗(yàn)（表1），各因素最佳值的確定以各水平平均值K最高為準(zhǔn)。

1.5.7 ?批量發(fā)酵 ?在正交試驗(yàn)優(yōu)化條件下，采用4套30 L上海國強(qiáng)發(fā)酵罐設(shè)備進(jìn)行連續(xù)30批發(fā)酵，測(cè)定β-甘露聚糖酶酶活。

1.6 ?測(cè)定方法

1.6.1 ?β-甘露聚糖酶酶活測(cè)定方法 ?采用DNS法測(cè)定酶活，酶活單位定義為在37 ℃、pH 5.5的條件下，每分鐘從濃度3 mg/mL的甘露聚糖溶液降解釋放1 μmol還原糖所需的酶量為一個(gè)酶活單位。

1.6.2 ?發(fā)酵參數(shù)測(cè)定方法 ?采用高碘酸鈉氧化法測(cè)定甘油殘留濃度[6]，氣相色譜測(cè)定分析甲醇濃度[7]，甲醛滴定法測(cè)定氨基氮含量，鉬酸銨-米吐爾法測(cè)定磷含量，數(shù)據(jù)分析參照文獻(xiàn)[8]。

1.6.3 ?細(xì)胞質(zhì)量濃度測(cè)定方法 ?取適量發(fā)酵液經(jīng)80 ℃烘干至恒重，測(cè)定細(xì)胞干質(zhì)量，再除以所取發(fā)酵液體積即為細(xì)胞質(zhì)量濃度[9]，根據(jù)測(cè)量數(shù)值繪制線性回歸曲線，細(xì)胞干重與OD600 nm的關(guān)系為DCW=0.226OD600 nm+0.017（R2=0.989 2）。

1.6.4 ?菌體濃度（WCW）測(cè)定方法 ?取發(fā)酵液，經(jīng)10 000 r/min離心5 min，去上清液，計(jì)算菌體濃度（g/L）。

1.6.5 ?發(fā)酵液中總蛋白與目的蛋白含量測(cè)定 ?采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定發(fā)酵液中總蛋白含量[10]，使用BIO-PRINT凝膠成像與分析系統(tǒng)，根據(jù)發(fā)酵液中總蛋白含量計(jì)算目的蛋白含量。endprint

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?畢赤酵母產(chǎn)酶基礎(chǔ)條件分析

甘油濃度為1.5%與葡萄糖濃度為2.5%時(shí)，畢赤酵母產(chǎn)β-甘露聚糖酶酶活達(dá)到最高（圖1a），分別為1 032、998 U/mL，酶活力差距較小，鑒于工業(yè)級(jí)葡萄糖單價(jià)3 000～4 000元/t，甘油單價(jià)5 000～ ? 7 000元/t，在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中，宜選用葡萄糖作為初始碳源;不同pH對(duì)畢赤酵母產(chǎn)β-甘露聚糖酶酶活影響較大（圖1b），在pH 5.0時(shí)酶活最高，達(dá)到1 230 U/mL;接種量不僅影響菌體增殖速度，而且一定程度上影響了發(fā)酵培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，當(dāng)接種量為8%時(shí)，酶活達(dá)到最高1 100 U/mL（圖1c）;在不同溫度下進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵，28 ℃時(shí)，β-甘露聚糖酶酶活最高，當(dāng)溫度為32 ℃時(shí)，酶活力明顯降低（圖1d）。

2.2 ?發(fā)酵罐高密度發(fā)酵優(yōu)化

2.2.1 ?誘導(dǎo)前菌體濃度、溶氧量對(duì)β-甘露聚糖酶酶活的影響 ?提高菌體濃度是提高外源蛋白表達(dá)量的有效手段，但通過試驗(yàn)驗(yàn)證（圖2a），當(dāng)誘導(dǎo)前菌體濃度為140 g/L發(fā)酵144 h時(shí)，β-甘露聚糖酶酶活最高，達(dá)到29 500 U/mL，過高的誘導(dǎo)前菌體濃度一定程度上抑制了酶蛋白的高效表達(dá);通過測(cè)定不同溶氧條件下酶活（圖2b），發(fā)現(xiàn)當(dāng)發(fā)酵罐通氣量控制在20%～30%、發(fā)酵144 h時(shí)，β-甘露聚糖酶表達(dá)量最高，達(dá)到29 000 U/mL。

2.2.2 ?甲醇補(bǔ)料方式對(duì)β-甘露聚糖酶酶活的影響 ?結(jié)果表明（圖3），采用連續(xù)補(bǔ)料的方式可以使畢赤酵母更好地適應(yīng)甲醇，延長最佳表達(dá)周期，最高酶活達(dá)到29 000 U/mL，而采用分批補(bǔ)料的方式，受甲醇濃度過高影響，畢赤酵母前期未能適應(yīng)碳源變化，導(dǎo)致48 h后外源蛋白停止表達(dá)，誘導(dǎo)期明顯縮短，采用分批-連續(xù)補(bǔ)料的方式，連續(xù)補(bǔ)料方式有助于酶蛋白表達(dá)，但前期變換碳源過渡不佳，導(dǎo)致發(fā)酵后期酶活不高，因此采用連續(xù)補(bǔ)料的方式進(jìn)行畢赤酵母產(chǎn)β-甘露聚糖酶誘導(dǎo)表達(dá)。

2.2.3 ?發(fā)酵罐中不同甲醇濃度對(duì)β-甘露聚糖酶酶活的影響 ?21 h進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)期（圖4），甲醇濃度為約1.0 g/L時(shí)，菌體增殖速度與酶蛋白表達(dá)速度均明顯加快，但發(fā)酵后期高甲醇濃度下細(xì)胞大量衰亡，導(dǎo)致菌體濃度下降，同時(shí)菌體破裂造成酶蛋白降解[11]，發(fā)酵后期酶活損失嚴(yán)重;酶活方面，低甲醇濃度時(shí)在144 h酶活最高，達(dá)到29 600 U/mL，高甲醇濃度下在120 h達(dá)到最高酶活28 000 U/mL，雖然高甲醇組酶活較前者低，但其發(fā)酵周期縮短約24 h;無機(jī)鹽方面，隨著菌體不斷增殖，高甲醇濃度下氮、磷消耗同樣較快，當(dāng)誘導(dǎo)階段進(jìn)入80 h左右時(shí)，僅通過調(diào)節(jié)pH進(jìn)入的氨氣不足以彌補(bǔ)氮消耗，因此在N、P剩余30%時(shí)添加補(bǔ)料培養(yǎng)基，后續(xù)60 h誘導(dǎo)階段氮、磷消耗仍然較快，表明之前補(bǔ)充氮源、磷源十分必要，以保持培養(yǎng)基中離子濃度穩(wěn)定性以及穩(wěn)定的滲透壓。甲醇濃度在0.5 g/L時(shí)酶蛋白表達(dá)量較高，因此，誘導(dǎo)時(shí)選擇添加0.5 g/L甲醇。

2.2.4 ?發(fā)酵條件正交優(yōu)化 ?正交試驗(yàn)經(jīng)重復(fù)驗(yàn)證后得到最佳發(fā)酵條件：接種量為10%、碳源濃度為3.0%、DO控制在10%～20%、誘導(dǎo)前濕重為140 g/L（表2），按極值差R值大小決定因素的主次順序?yàn)椋篋O、碳源濃度、接種量、誘導(dǎo)前濕重。

2.2.5 ?最優(yōu)發(fā)酵工藝下參數(shù)分析 ?表3為正交試驗(yàn)最優(yōu)發(fā)酵工藝下畢赤酵母產(chǎn)β-甘露聚糖酶發(fā)酵參數(shù)，21 h開始甲醇誘導(dǎo)，150 h酶活達(dá)到最高29 600 U/mL，細(xì)胞干重、目的蛋白含量、比酶活分別為127.3 g/L、5.32 g/L、2 740.74 U/mg，目的蛋白生成比速率（qp）、細(xì)胞對(duì)甲醇得率（Yx /s）、目的蛋白對(duì)細(xì)胞得率（Yp /s）分別為0.201 mg/g·h、0.158 g/g、5.96 mg/g;比酶活隨誘導(dǎo)時(shí)間不斷升高，在酶蛋白高表達(dá)期達(dá)到最高值，150 h之后酶活力和比酶活等均呈下降趨勢(shì)，此時(shí)畢赤酵母不斷表達(dá)外源蛋白以及蛋白降解綜合作用的表觀結(jié)果，因此發(fā)酵應(yīng)控制在150 h。

2.2.6 ?搖瓶發(fā)酵與發(fā)酵罐高密度發(fā)酵蛋白電泳 ?結(jié)果（圖5）表明，在約37 kDa處有明顯的目的條帶，搖瓶發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵上清液中雜蛋白很少，但在發(fā)酵罐高密度發(fā)酵過程中，隨著酶蛋白表達(dá)量的不斷提高，雜蛋白含量相對(duì)增加，147 h前，蛋白含量隨時(shí)間延長不斷增加，之后由于細(xì)胞衰亡，上清液中的酶蛋白被部分降解，在227 h時(shí)，蛋白含量已經(jīng)降解50%以上。

2.2.7 ?批量發(fā)酵結(jié)果 ?在正交試驗(yàn)最優(yōu)工藝條件下，采用4套30 L上海國強(qiáng)發(fā)酵罐設(shè)備進(jìn)行連續(xù)30批發(fā)酵，得到酵母細(xì)胞干重均達(dá)120～160 g/L，達(dá)到高密度發(fā)酵目的，并且β-甘露聚糖酶蛋白的表達(dá)量達(dá)到5.1 g/L，酶活力達(dá)到29 600 U/mL。

3 ?小結(jié)與討論

溫度不但影響畢赤酵母發(fā)酵液溶氧量、基質(zhì)的分解吸收速率，還會(huì)影響發(fā)酵產(chǎn)物的活性及生物合成方向[12]，是影響細(xì)胞生長和目的蛋白產(chǎn)率及穩(wěn)定性的一個(gè)重要因素，最佳誘導(dǎo)溫度是各種因素綜合表現(xiàn)的結(jié)果[13]。不同外源基因?qū)囟纫蟛煌?，在本試?yàn)中，溫度升高有利于提高酶蛋白表達(dá)速率，誘導(dǎo)溫度為28 ℃時(shí)，酶活最高，達(dá)到1 150 U/mL，溫度繼續(xù)升高時(shí)，酶活單位時(shí)間增加較快，但發(fā)酵后期酶活衰減嚴(yán)重，這是因?yàn)闇囟壬?，表達(dá)速度過快不利于外源蛋白的正確折疊和有效地向胞外分泌[14]，當(dāng)溫度為32 ℃時(shí)，外源蛋白表達(dá)嚴(yán)重受阻。

在畢赤酵母高密度發(fā)酵過程中，溶氧作為重要參數(shù)，不同溶氧水平，甲醇代謝速率和代謝產(chǎn)物相差較大[15]。低溶氧水平下，酵母因溶氧不足，呼吸向無氧代謝途徑漂移[16，17]，導(dǎo)致甲醇利用減慢，最終生成乙醇、乙酸等副產(chǎn)物，進(jìn)一步抑制酵母生長，同時(shí)也抑制醇氧化酶AOX活性，降低外源蛋白表達(dá)量，而溶氧過高時(shí)，會(huì)促進(jìn)胞內(nèi)活性氧（ROS）的積累，對(duì)細(xì)胞造成損傷，影響表達(dá)系統(tǒng)的穩(wěn)定性[18]，合適的溶氧值有助于外源蛋白的高效表達(dá)[19]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)較低的溶氧更利于β-甘露聚糖酶的表達(dá)，這與發(fā)酵工藝中較低的甲醇濃度有關(guān)，作為畢赤酵母Mut+型，對(duì)甲醇需求較大，且易受甲醇濃度影響[20]，在誘導(dǎo)期，甲醇作為惟一碳源，被酵母增殖與目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)競(jìng)爭消耗，此時(shí)過低的甲醇濃度會(huì)導(dǎo)致誘導(dǎo)不足而降低酶蛋白表達(dá)量，濃度過高又抑制菌體增殖，導(dǎo)致發(fā)酵失敗[21]。王帥坤等[22]在較高的甲醇以及較高的溶氧量下獲得最優(yōu)發(fā)酵條件，但本試驗(yàn)甲醇濃度在0.5 g/L時(shí)酶蛋白表達(dá)量較高，此時(shí)只需10%～20%較低的溶氧量就可滿足酶蛋白的高效表達(dá)，進(jìn)一步降低了供氧設(shè)備成本。endprint

高密度發(fā)酵時(shí)基因工程是提高外源蛋白表達(dá)量的重要策略之一。目前，一般認(rèn)為酵母細(xì)胞密度為100～200 g/L（DCW）即為高密度發(fā)酵，本試驗(yàn)中采用4套30 L上海國強(qiáng)發(fā)酵罐設(shè)備進(jìn)行連續(xù)30批發(fā)酵，細(xì)胞干重均達(dá)120～160 g/L，達(dá)到高密度發(fā)酵目的，并且β-甘露聚糖酶蛋白的表達(dá)量達(dá)到5.1 g/L，酶活達(dá)到29 600 U/mL，遠(yuǎn)高于目前相關(guān)報(bào)道，如Chen等[23]將硫色曲霉的甘露聚糖酶基因序列優(yōu)化在畢赤酵母中進(jìn)行分泌表達(dá)，發(fā)酵酶活為1 100 U/mL，喬宇等[24]克隆一株枯草芽孢桿菌中的甘露聚糖酶基因至畢赤酵母中，在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行高密度發(fā)酵，酶活為1 102 U/mL，馬威等[25]將枯草芽孢桿菌中的甘露聚糖酶基因克隆到畢赤酵母中，10 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵活為2 100 U/mL，張娟等[26]克隆黑曲霉中甘露聚糖酶基因到畢赤酵母中，進(jìn)行5 L液體發(fā)酵，酶活為11 785 U/mL。

本試驗(yàn)獲得畢赤酵母產(chǎn)β-甘露聚糖酶最佳發(fā)酵工藝，初始葡萄糖質(zhì)量濃度為30 g/L，誘導(dǎo)前菌體濕重140 g/L（DCW約27 g/L），誘導(dǎo)溫度為28 ℃，pH 5.0，誘導(dǎo)期溶氧量控制在10%～20%，甲醇流加方式采用前10 h為適應(yīng)期，后續(xù)采用溶氧恒定法，控制甲醇流速在8～12 mL/（L·h）。最終細(xì)胞干重為135 g/L，胞外總蛋白含量達(dá)到10.9 g/L（目的蛋白5.1 g/L），酶活最高為29 600 U/mL，是搖瓶培養(yǎng)最高酶活力的24倍，通過本試驗(yàn)優(yōu)化產(chǎn)酶條件及高密度發(fā)酵工藝研究，使得畢赤酵母表達(dá)β-甘露聚糖酶工程菌酶活力得到極大提高，已滿足工業(yè)化生產(chǎn)要求。

參考文獻(xiàn)：

[1] BENECH R O，LI X M，PATTON D，et al. Recombinant expression，characterization，and pulp prebleaching property of a Phanerochaetr chrysosporium endo-β-1，4-mannanase[J].Enzyme and Microbial Technology，2007，41（6-7）：740-747.

[2] 黃小文，劉雪山，徐鳳芹，等.甘露聚糖酶對(duì)小豬生產(chǎn)性能的影響[J].飼料工業(yè)，2003，24（1）：15-27.

[3] 辛總秀.β-甘露聚糖酶在家禽飼料中應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].畜牧與飼料料學(xué)，2011，32（5）：28-30.

[4] 唐衛(wèi)華，王瑞明，肖 ?靜，等.β-甘露聚糖酶基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)[J].生物技術(shù)，2013，23（2）：18-22.

[5] CEREGHINO J L，CREGG J M. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J]. FEMS Microbiol Rev，2000，24（1）：45-66.

[6] 王劍鋒，修志龍，范圣第.甘油轉(zhuǎn)化生產(chǎn)1，3-丙二醇發(fā)酵液中甘油含量的測(cè)定[J].工業(yè)微生物，2001，31（2）：33-35.

[7] DENG B B，F(xiàn)ENG H Q，XUE C，et al. GC rapid analysis of methanol and ethanol during high cell density culture of recombinant methylotrophic yeast[J].Ind Microbiol，2001，31（2）：26-29.

[8] 戚以政，夏 ?杰.生物反應(yīng)工程[M].北京：化工出版社，2004.

[9] JAHIC M，GUSTAVSSON M，JANSEN A K，et al. Analysis and control of proteolysis of a fusion protein in Pichia pastoris fed-batch processes[J]. Biotechnol，2003，102（1）：45-53.

[10] 薩姆布魯克J， 弗里奇EF， 曼尼阿蒂斯J. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M]第二版.金冬雁，黎孟楓，譯.北京：科學(xué)出版社，1998.

[11] SINHA J，PLANTZ B A，INAN M，et al. Causes of proteolytic degradation of secreted recombinant proteins produced in methylotrophic yeast Pichia pastoris： Case study with recombinant ovine interferon[J]. Biotechnol Bioeng，2005，89（1）：102-112.

[12] 薛 ?雁，徐 ?梅，薛百忠，等.畢赤酵母表達(dá)巴曲酶發(fā)酵條件的優(yōu)化研究[J].蛇志，2009，21（2）：94-97.

[13] MATTANOVICH D，GASSER B，HOHENBLUM H，et al. Stress in recombinant protein producing yeasts[J]. Journal of Biotechnology，2004， 113（2）：121-135.

[14] 孫戰(zhàn)勝，陳勁春.重組人血清蛋白在畢赤酵母表達(dá)中的降解控制[J].北京化工大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，31（4）：9-11.

[15] CUNHA A E，CLEMENTE J J，GOMES R，et al. Methanol induction optimization for scFv antibody fragment production in Pichia pastoris[J].Biotechnol Bioeng， 2004，86（4）：458-467.endprint

[16] KHATRI N K， HOFFMANN F. Impact of methanol concentration on secreted protein production in oxygen-limited cultures of recombinant Pichia pastoris[J].Biotechnol Bioeng，2006， ?93（5）：871-879.

[17] INAN M，MEAGHER M M. The effect of ethanol and acetate on protein expression in Pichia pastoris[J]. J Biosci Bioeng，2001，92（4）：337-341.

[18] MARK D T，IAN W D，GABRIEL G P. Complex cellular responses to reactive oxygen species[J]. Trends Cell Biol，2005， 15（6）：319-326.

[19] TRENTMANN O，KHATRI N K，HOFFMANN F. Reduced oxygen supply increase process stability and product yield with recombinant Pichia pastoris[J]. Biotechnol Prog，2004，20（6）：1766-1975.

[20] 周祥山，范衛(wèi)民，張?jiān)d.不同甲醇流加策略對(duì)重組畢赤酵母高密度發(fā)酵生產(chǎn)水蛭素的影響[J].生物工程學(xué)報(bào)，2002，18（3）：348-351.

[21] MACAULEY-PATRICK S，F(xiàn)AZENDA M L，MCNEIL B，et al. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system[J].Yeast，2005，22（2）：249-270.

[22] 王帥坤，郝杰清，王振偉，等.畢赤酵母表達(dá)重組葡萄糖氧化酶的發(fā)酵條件[J].生物技術(shù)通報(bào)，2013，14（9）：136-141.

[23] CHEN X L，QIAO J Y，YU H F，et al. Overexpression of an optimized Aspergillus sulphureus β-mannanase gene in Pichia pastoris[J]. Biologia， 2009， 64（2）：235-238.

[24] 喬 ?宇，陳小兵，丁宏標(biāo)，等.甘露聚糖酶基因在畢赤酵母中表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].中國生物工程雜志，2006，26（7）：52-56.

[25] 馬 ?威，沈志娜，陳軼群，等.枯草芽孢桿菌β-甘露聚糖酶在畢赤酵母中的分泌表達(dá)[J].生物技術(shù)通訊，2010，21（2）：171-174.

[26] 張 ?娟，羅長財(cái).耐酸性黑曲霉β-甘露聚糖酶的克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá)分析[J].生物技術(shù)通訊，2011，22（2）：184-187.endprint