結(jié)核菌特異性Elispot檢測(cè)IFN—γ對(duì)肺結(jié)核病診斷及其治療的指導(dǎo)意義

李永興 陶學(xué)芳 尉理梁

[摘要] 目的 探討結(jié)核菌特異性Elispot檢測(cè)IFN-γ對(duì)肺結(jié)核病診斷及其治療的指導(dǎo)意義。 方法 選擇我院2011年1月～2014年12月收治的肺結(jié)核患者100例，所有患者入組期間均采用住院觀察，并持續(xù)住院時(shí)間均在3 d以上，先行Elispot檢測(cè)，1 d后行PPD實(shí)驗(yàn)，比較確診患者Elispot檢測(cè)結(jié)果與PPD實(shí)驗(yàn)結(jié)果、Elispot檢測(cè)陽(yáng)性與陰性結(jié)果中斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)與Elispot檢測(cè)卡介苗接種前后IFN-γ分泌水平。 結(jié)果 卡介苗接種前后IFN-γ分泌中ESAT-6水平和PoolA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），Elispot檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果中斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)顯著多于陰性（P<0.05），Elispot檢測(cè)法的陽(yáng)性率為88.0%，靈敏度為90.5%，特異度為19.2%，PPD實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性率為74.0%，靈敏度為76.1%，特異度為41.7%，Elispot檢測(cè)法陽(yáng)性率和靈敏度均高于PPD實(shí)驗(yàn)（P<0.05）。 結(jié)論 結(jié)核菌特異性IFN-γ Elispot檢測(cè)對(duì)于篩查肺結(jié)核感染患者具有明顯優(yōu)勢(shì)，其不受接種卡介苗與否的影響，其陽(yáng)性率和敏感性均顯著高于常規(guī)PPD試驗(yàn)。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)核菌特異性；Elispot檢測(cè)；IFN-γ；肺結(jié)核

[中圖分類號(hào)] R52 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）33-0021-04

研究顯示，我國(guó)人群中被結(jié)核菌感染的比例在30%以上，而超過90%人群在結(jié)核菌感染后并不出現(xiàn)核感染的臨床癥狀[1]。進(jìn)入新世紀(jì)后，我國(guó)進(jìn)行的結(jié)核病大樣本普查發(fā)現(xiàn)，隨著生活質(zhì)量的改善和醫(yī)療水平的提高，結(jié)核感染率有所下降，但仍有接近50%的人群被結(jié)核所感染。也就是說，健康人群中存在大量的結(jié)核桿菌潛伏感染者，加上感染后發(fā)病者，我國(guó)結(jié)核病疫情已較為嚴(yán)重[2]。目前針對(duì)該部分結(jié)核感染初診上最主要的方法是結(jié)核菌素試驗(yàn)（也稱為芒圖試驗(yàn)、PPD試驗(yàn)），該試驗(yàn)中許多患者雖然PPD試驗(yàn)陽(yáng)性，但仍無臨床癥狀，處于潛伏期，所以PPD試驗(yàn)在臨床中對(duì)于區(qū)分真正結(jié)核感染者效果有限[3]。本研究主要探討結(jié)核菌特異性Elispot檢測(cè)IFN-γ對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核病診斷及其治療效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇我院2011年1月～2014年12月收治的肺結(jié)核患者100例，所有患者均符合以下診斷標(biāo)準(zhǔn)：①具有典型的肺結(jié)核臨床癥狀或胸部X射線檢查明確的肺結(jié)核病灶；②痰液或支氣管灌洗液涂片行抗酸染色結(jié)果陽(yáng)性；③痰液或支氣管灌洗液測(cè)定結(jié)核分枝桿菌體外培養(yǎng)結(jié)果陽(yáng)性；④痰內(nèi)聚合反應(yīng)發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌DNA片段；⑤芒圖試驗(yàn)強(qiáng)陽(yáng)性，患者體內(nèi)存在血清抗結(jié)核抗體且檢查結(jié)果為陽(yáng)性；⑥排除非結(jié)核性肺部疾??；⑦規(guī)律抗結(jié)核治療患者臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室檢查、影像學(xué)檢查均得到改善。符合①與⑦以及②～⑥中兩項(xiàng)以上者。其中男46例，女54例，年齡18～50歲，平均（42.3±2.1）歲，肺結(jié)核病程1～20年，平均（6.3±1.2）年，肺結(jié)核類型：原發(fā)性肺結(jié)核（Ⅰ型）者19例，血行播散型肺結(jié)核（Ⅱ型）者26例，繼發(fā)型肺結(jié)核（Ⅲ型）者55例。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 結(jié)核菌特異性 IFN-γ體外檢測(cè) 收集通過乙二胺四乙酸進(jìn)行抗凝后的晨起患者肘靜脈血5 mL，使用Ficoll法對(duì)外周淋巴細(xì)胞進(jìn)行分離，并采用Elispot法進(jìn)行檢測(cè)。所有患者于采血后2 h內(nèi)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行外周血單個(gè)核細(xì)胞分離。對(duì)分離細(xì)胞活化后將其包被于抗體平板上，每孔注入100 μL，保持每孔的細(xì)胞濃度達(dá)到2×105個(gè)以上，之后加入結(jié)核菌重組蛋白抗原（ESAT-6）、PoolA及卡介苗，保持終濃度為5 μg每孔。隨后蓋上板蓋，放置于37℃、5%二氧化碳溫箱培養(yǎng)持續(xù)24 h。之后進(jìn)行洗板，并加入待檢測(cè)抗體，37℃條件下孵化1 h，再次洗板并加入親和素孵化1 h。最后添加顯色劑進(jìn)行顯色后最后洗板，計(jì)數(shù)Elispot斑點(diǎn)及其參數(shù)，以上所有操作均由具有5年以上工作經(jīng)驗(yàn)的同一實(shí)驗(yàn)師嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)讀板儀對(duì)斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)。結(jié)果判斷：陽(yáng)性：質(zhì)控孔內(nèi)斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)遍布整個(gè)反應(yīng)孔，陰性為質(zhì)控孔內(nèi)存在5個(gè)以內(nèi)斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)。

1.2.2 PPD試驗(yàn) 每例患者均使用2個(gè)國(guó)際結(jié)核菌素單位，約0.1 mL由同一護(hù)士選擇患者前臂內(nèi)側(cè)皮膚進(jìn)行皮內(nèi)注射，持續(xù)觀察15 min后可自行活動(dòng)，于3 d后觀察結(jié)果，詳細(xì)記錄硬結(jié)的直徑，質(zhì)地、顏色、有無紅腫破潰等。

1.2.3 卡介苗接種 選擇患者左上臂三角肌外側(cè)下緣進(jìn)行卡介苗的皮內(nèi)注射，劑量為0.1 mL，所含菌量為0.5～0.75 mg。

1.2.4 主要試劑 Elispot試劑由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物實(shí)驗(yàn)中心研制，結(jié)核菌素由成都生物制品研究所提供，包被抗體和檢測(cè)抗體均由eBioscience公司生產(chǎn)，酶聯(lián)二抗由PierceBiotechonology公司生產(chǎn)，結(jié)核菌重組蛋白抗原（ESAT-6）由本院檢驗(yàn)科制備，卡介苗由上海生物制品研究所提供。

1.3 觀察指標(biāo)

對(duì)所有患者入組前均簽署知情同意書，并申報(bào)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，根據(jù)入組標(biāo)準(zhǔn)確診后抽取患者肘靜脈血5 mL備用，所有患者入組期間均采用住院觀察，并持續(xù)住院時(shí)間均在3 d以上，比較確診患者Elispot檢測(cè)結(jié)果與PPD實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Elispot檢測(cè)陽(yáng)性與陰性結(jié)果中斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)與Elispot檢測(cè)卡介苗接種前后IFN-γ分泌水平。所有患者均先進(jìn)行Elispot檢測(cè)，1 d后行PPD實(shí)驗(yàn)。靈敏度=真陽(yáng)性人數(shù)/（真陽(yáng)性人數(shù)+假陰性人數(shù)）×100%，特異度=真陰性人數(shù)/（真陰性人數(shù)+假陽(yáng)性人數(shù)）×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，四格表資料采用四格表χ2檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Elispot檢測(cè)卡介苗接種前后IFN-γ分泌水平

卡介苗接種前后IFN-γ分泌中ESAT -6水平和PoolA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.2 Elispot檢測(cè)陽(yáng)性與陰性結(jié)果中斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)及比較

Elispot檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果中斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)顯著多于陰性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3 100例確診患者Elispot檢測(cè)結(jié)果與PPD實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

Elispot檢測(cè)法的陽(yáng)性率為88.0%（88/100），靈敏度為90.5%（67/74），特異度為19.2%（5/26），PPD實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性率為74.0%（74/100），靈敏度為76.1%（67/88），特異度為41.7%（5/12），Elispot檢測(cè)法陽(yáng)性率和靈敏度均高于PPD實(shí)驗(yàn)，兩種檢查方法差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.811，P=0.026）。見表3。

3 討論

我國(guó)屬于發(fā)展中國(guó)家，結(jié)核菌感染是一種嚴(yán)重危害人群生命健康的公共衛(wèi)生問題[4]，是國(guó)家衛(wèi)生工作不容忽視重點(diǎn)需要防控的傳染性疾病[5]。如何更有效地對(duì)結(jié)核病患者進(jìn)行早期的診斷、篩查以指導(dǎo)治療是防治結(jié)核病的重要手段[6]。其中結(jié)核菌素試驗(yàn)作為目前臨床上唯一用于檢測(cè)結(jié)核潛伏感染的方法，因其敏感性偏低，且存在加大的假陽(yáng)性率而不被臨床看好[7]。

目前使用IFN-γ檢測(cè)代替PPD試驗(yàn)是研究熱點(diǎn)，早在2005年，美國(guó)疾病控制及預(yù)防中心就已明確酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法（Elispot）檢測(cè)IFN-γ的臨床價(jià)值，并規(guī)定其應(yīng)用范圍，尤其是針對(duì)移民人群、醫(yī)務(wù)工作者、有結(jié)核感覺密切接觸史者[8]。作為結(jié)核病診斷及治療后效果評(píng)估中的主要細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)手段[9]。其有效結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)兩者之長(zhǎng)處，有效分析特異性抗原活化后的分泌型細(xì)胞因子，尤其是IFN-γ單個(gè)效應(yīng)細(xì)胞的頻數(shù)，從而更敏感的特異性鑒定結(jié)核桿菌。Elispot檢測(cè)是通過再次刺激轉(zhuǎn)導(dǎo)的同種抗原引起的致敏反應(yīng)，促使記憶性T淋巴細(xì)胞釋放IFN-γ，被認(rèn)為是記憶性T淋巴細(xì)胞近期內(nèi)暴露于結(jié)核抗原的有效指標(biāo)[10]。肺結(jié)核患者免疫發(fā)病機(jī)制主要因T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫改變所致。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為疫苗接種后所誘導(dǎo)的抗原特異性多功能T淋巴細(xì)胞可顯著控制結(jié)核分枝桿菌感染及患者的病情[11]。尤其是Th1類細(xì)胞因子，如IFN-γ發(fā)揮十分重要的臨床作用[12]。IFN-γ可反映T淋巴細(xì)胞的功能，其所產(chǎn)生非細(xì)胞損傷性病毒清除細(xì)胞因子在結(jié)核病患者的免疫應(yīng)答中發(fā)揮積極作用[13]。另外，酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)則是上世紀(jì)80年代應(yīng)用于實(shí)踐，通過單細(xì)胞水平檢測(cè)特異性抗體所分泌細(xì)胞及特異性細(xì)胞因子分泌細(xì)胞的免疫技術(shù)，其穩(wěn)定性強(qiáng)、敏感性和特異性均較高[14]。近年來已將其應(yīng)用于免疫系統(tǒng)疾病的檢測(cè)，其中針對(duì)結(jié)核病患者機(jī)體免疫功能的測(cè)定，以更好地指導(dǎo)臨床治療而受到臨床重視。有研究稱[15]，與以往常用的PPD試驗(yàn)比較，結(jié)核菌抗原特異性IFN-γ水平檢測(cè)具有兩大優(yōu)勢(shì)，其一，具有較高的敏感性與特異性，而且不受接種卡介苗與否的影響[16]；其二，該實(shí)驗(yàn)可一次實(shí)驗(yàn)即得結(jié)果，無需受試者多次來院進(jìn)行結(jié)果的判斷，減少了患者不必要的麻煩[17]。

本組對(duì)患者進(jìn)行Elispot檢測(cè)與PPD實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Elispot檢測(cè)法陽(yáng)性率和靈敏度均高于PPD實(shí)驗(yàn)（P<0.05）。PPD試驗(yàn)屬于機(jī)體對(duì)結(jié)核菌素純蛋白衍化物發(fā)生的一種遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)，其主要的缺點(diǎn)為PPD可能混雜有除結(jié)核分枝桿菌外的非結(jié)核分枝桿菌等多種抗原[18]。尤其是PPD實(shí)驗(yàn)對(duì)于接種卡介苗后患者亦存在敏感性，患者將出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，故進(jìn)行PPD試驗(yàn)者除受結(jié)核分枝桿菌感染外還有可能是因接種卡介苗所致。而Elispot檢測(cè)則是利用多種混合性特異抗原多肽[19]，其中關(guān)鍵是ESAT-6和PoolA為主的混合抗原，臨床應(yīng)用特異性顯著優(yōu)于PPD試驗(yàn)。

本組選擇ESAT-6和PoolA抗原進(jìn)行研究，無論接種卡介苗與否，其ESAT-6和PoolA抗原水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），可認(rèn)為以上兩種抗原多肽所誘導(dǎo)的IFN-γ水平變化不受接種卡介苗與否的影響，證實(shí)Elispot檢測(cè)IFN-γ水平可有效避免接種卡介苗對(duì)其影響。針對(duì)100例Elispot檢測(cè)患者而言，其陽(yáng)性結(jié)果中斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)顯著多于陰性（P<0.05）。雖然所有患者均確診患有肺結(jié)核，但因結(jié)核蛋白來源不同，其長(zhǎng)度與氨基酸排列順序存在差異，故陽(yáng)性患者斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)多于陰性者。而且針對(duì)規(guī)律治療患者，治療前其IFN-γ分泌水平一般較高，隨者治療的進(jìn)行以及患者病情的好轉(zhuǎn)，IFN-γ分泌水平逐漸下降[20]。

綜上所述，結(jié)核菌特異性IFN-γ Elispot檢測(cè)對(duì)于篩查肺結(jié)核感染患者具有明顯優(yōu)勢(shì)，其不受接種卡介苗與否的影響，其陽(yáng)性率和敏感性均顯著高于常規(guī)PPD試驗(yàn)。

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（收稿日期：2015-07-17）