奶牛乳腺上皮細(xì)胞系的培養(yǎng)與鑒定

詹 康 貢笑笑 左曉昕 陳銀銀 占今舜 趙國(guó)琦（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州225009）

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奶牛乳腺上皮細(xì)胞系的培養(yǎng)與鑒定

詹 康 貢笑笑 左曉昕 陳銀銀 占今舜 趙國(guó)琦?
（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州225009）

摘 要：本試驗(yàn)旨在培養(yǎng)功能性奶牛乳腺上皮細(xì)胞系，為奶牛泌乳調(diào)控和奶牛乳房炎發(fā)病機(jī)制研究提供功能性的細(xì)胞模型。采用組織塊細(xì)胞培養(yǎng)法來(lái)分離純化并鑒定奶牛乳腺上皮細(xì)胞；采用有限稀釋法單克隆奶牛乳腺上皮細(xì)胞；采用噻唑藍(lán)（MTT）法來(lái)分析奶牛乳腺上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線是否為正常的“S”形；觀察細(xì)胞角蛋白18免疫熒光來(lái)證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為上皮型；選擇培養(yǎng)至10和20代的奶牛乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行染色體核型分析。結(jié)果表明：1）利用組織塊細(xì)胞分離法能夠成功獲得奶牛乳腺上皮細(xì)胞并傳至20代。2）培養(yǎng)5～6 d成纖維細(xì)胞迅速增殖且周圍分裂出少量的上皮細(xì)胞。培養(yǎng)8 d奶牛乳腺上皮細(xì)胞迅速增殖，形成島嶼狀集落，呈單層“鵝卵石”和“鋪路石”形態(tài)生長(zhǎng)。3）奶牛乳腺上皮細(xì)胞角蛋白18鑒定為陽(yáng)性。4）培養(yǎng)至10和20代的奶牛乳腺上皮細(xì)胞染色體數(shù)為60條，具有正常的細(xì)胞二倍體核型。綜上所述，采用組織塊培養(yǎng)細(xì)胞能夠獲得具有穩(wěn)定性、功能性的奶牛乳腺上皮細(xì)胞，但不是永生化細(xì)胞。

關(guān)鍵詞：奶牛乳腺上皮細(xì)胞；乳房炎；功能性；核型分析

功能性奶牛乳腺上皮細(xì)胞在奶牛泌乳調(diào)控和奶牛乳房炎發(fā)病機(jī)制研究中，已經(jīng)成為一種重要的細(xì)胞模型［1］。Schmid等［2］首次建立了奶牛乳腺上皮細(xì)胞系，但是此細(xì)胞系只是用于細(xì)胞骨架蛋白的研究并無(wú)對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的泌乳營(yíng)養(yǎng)的研究。Huynh等［3］利用對(duì)溫度敏感的突變體SV40 T抗原基因轉(zhuǎn)染原代的牛乳腺細(xì)胞建立了奶牛乳腺上皮細(xì)胞系，該細(xì)胞系保留了上皮細(xì)胞的典型特征，而且在激素的誘導(dǎo)下能夠分泌乳蛋白。Zavizion等［4］建立了溫度敏感的奶牛乳腺上皮細(xì)胞系，雖然能夠合成乳蛋白，但是表達(dá)的乳蛋白極低甚至不表達(dá)。由于轉(zhuǎn)染的外源基因是隨機(jī)插入奶牛乳腺上皮細(xì)胞染色體上，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞具有不同的核型，影響細(xì)胞的正常形態(tài)及功能［5－8］。本試驗(yàn)旨在對(duì)成功培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞系進(jìn)行功能驗(yàn)證，為奶牛乳腺上皮細(xì)胞的泌乳調(diào)控和奶牛乳房炎的發(fā)病機(jī)制研究提供功能性的細(xì)胞素材。

1　材料與方法

1．1 試劑

DMEM／F12完全培養(yǎng)基：10%胎牛血清、5 mL胰島素－轉(zhuǎn)鐵蛋白－硒－乙醇胺溶液、15 mmol／L羥乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）（Gibco公司），100 U／mL青霉素、100 μg／mL鏈霉素、4 mmol／L L－谷氨酰胺溶液、2．8 μmol／L氫化可的松、1 μg／mL催乳素（Sigma公司），15 ng／mL表皮生長(zhǎng)因子（EGF）（Peprotech公司）。

杜氏磷酸鹽緩沖液（DPBS）、0．25%胰蛋白酶－乙二胺四乙酸（trypsin?EDTA）購(gòu)自Gibco公司，細(xì)胞角蛋白18單克隆抗體、羊抗鼠熒光二抗購(gòu)自Santa cruz公司。

1．2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)

對(duì)健康無(wú)乳房炎荷斯坦奶牛進(jìn)行活體采樣，把乳腺組織塊放入含有300 U／mL的青霉素和300 μg／mL鏈霉素的DMEM／F12培養(yǎng)基中，立即帶回實(shí)驗(yàn)室。參照Gibson等［5］進(jìn)行組織塊培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞。將活體采樣的乳腺組織帶回實(shí)驗(yàn)室，用酒精消毒并撕下封口膜，把組織放入培養(yǎng)皿中，用DPBS（添加200～300 U／mL的青霉素和200～300 μg／mL鏈霉素）清洗乳腺組織數(shù)次，去除結(jié)締組織和脂肪組織，將組織移至新培養(yǎng)皿中，用DPBS再進(jìn)行清洗乳腺組織，直至上清液清亮。再用無(wú)血清的DMEM／F12培養(yǎng)基反復(fù)清洗組織，直至培養(yǎng)基上清液清亮無(wú)雜物，并轉(zhuǎn)移到100 mL小燒杯中，并用小剪刀將組織剪成＜1 mm3的碎片，靜置1～2 min自行沉淀，棄去上清液，繼續(xù)剪碎，加無(wú)血清DMEM／F12培養(yǎng)基懸浮組織塊，再轉(zhuǎn)移至15 mL的離心管中清洗，130×g離心5 min，棄上清。如上反復(fù)清洗組織塊，直至上清液澄清。加入含10%胎牛血清的DMEM／F12完全培養(yǎng)基懸浮組織塊，用擴(kuò)口移液管將組織塊轉(zhuǎn)入25 cm2培養(yǎng)瓶中，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。加入培養(yǎng)基量非常重要，剛開始加入一點(diǎn)點(diǎn)濕潤(rùn)組織即可，切記不能讓組織塊漂起來(lái)。

1．3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的純化和克隆

將培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下觀察，用記號(hào)筆只圈出1個(gè)上皮細(xì)胞集落，然后用一次性細(xì)胞刮刀將其他區(qū)域的細(xì)胞全部刮掉，并用DPBS清洗培養(yǎng)皿吸去雜細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)10 d之后，用胰酶分離消化細(xì)胞，完全培養(yǎng)基終止消化，吹打并懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)，使細(xì)胞密度為10個(gè)／mL，取100 μL細(xì)胞懸液加入96孔板中，培養(yǎng)1周。如果沒(méi)有集落再培養(yǎng)1周，若仍然沒(méi)有集落形成，換液再培養(yǎng)1周，這時(shí)再?zèng)]有形成集落，就不會(huì)形成集落了。

1．4 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

取第5代奶牛乳腺上皮細(xì)胞，按照3× 103個(gè)／孔的密度接種到96孔板，每隔24 h取8孔，每孔加入20 μL的噻唑藍(lán)（MTT）溶液放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸出MTT溶液再用DPBS清洗細(xì)胞2～3遍并吸棄，每孔加入150 μL的二甲基亞砜（DMSO），慢搖10 min。吸出8孔的液體并轉(zhuǎn)入96孔板中，490 nm測(cè)吸光度（OD）值，連續(xù)測(cè)10 d。

1．5 奶牛乳腺上皮細(xì)胞角蛋白18的鑒定

將奶牛乳腺上皮細(xì)胞按1×104個(gè)／cm2接種于8孔腔室玻片（chamber slide），待細(xì)胞密度至60%時(shí)，用預(yù)冷的DPBS清洗細(xì)胞2次。用－20℃的丙酮、甲醛混合液（V∶V＝1∶1）固定30 min，用DPBS清洗細(xì)胞2次，每次5 min。3%雞血清室溫封閉30 min，棄血清。加鼠源細(xì)胞角蛋白18一抗，對(duì)照組加磷酸鹽緩沖液（PBS），放置4℃冰箱過(guò)夜。DPBS洗3次，加綠色熒光羊抗鼠二抗，避光孵育1 h。DPBS清洗3次，二脒基苯基吲哚（DAPI）室溫染色7 min。DPBS洗3次，蒸餾水洗1次，封固劑封片，避光。

1．6 奶牛乳腺上皮細(xì)胞核型分析

取10和20代的奶牛乳腺上皮細(xì)胞，加秋水仙素至終濃度為0．1～0．4 μg／mL，在37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3～4 h，大部分處于細(xì)胞分裂中期。胰蛋白酶消化分離細(xì)胞，轉(zhuǎn)入15 mL離心管，250×g 4℃離心3 min收集細(xì)胞。吸去上清液加入預(yù)熱至37℃0．075 mol／L氯化鉀溶液7 mL，吹打均勻，37℃培養(yǎng)箱中溫育17 min。懸液中加入新鮮固定液1 mL，打勻。將懸液250×g離心10 min去上清，加入新鮮固定液7 mL打勻，室溫靜置30 min。重復(fù)以上步驟。離心后去掉上清液，視細(xì)胞量加入固定液0．5～1．0 mL，吹打均勻。取出預(yù)冷的載玻片并將載玻片傾斜45°，在上方用吸管迅速滴上2～3滴細(xì)胞懸液。用嘴輕輕吹散，使細(xì)胞分散均勻，室溫干燥。吉姆薩（Giemsa）工作液染色15 min，自來(lái)水沖洗，空氣干燥。先用低倍鏡尋找良好的分裂相，再使用高倍鏡觀察。

2　結(jié) 果

2．1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的純化和克隆

由圖1可知，培養(yǎng)18 h內(nèi)組織塊即可貼壁，并分裂出少量的成纖維細(xì)胞。圖2顯示培養(yǎng)6 d成纖維細(xì)胞迅速增殖并處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，同時(shí)輻射出少量的乳腺上皮細(xì)胞。由圖3可知，培養(yǎng)8～9 d乳腺上皮細(xì)胞增殖明顯且活力較強(qiáng)。從圖4來(lái)看，利用96孔板有限稀釋法克隆細(xì)胞，已成功獲得克隆的乳腺上皮細(xì)胞株。乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)不規(guī)則形狀，細(xì)胞與細(xì)胞之間緊密相連，呈單層“鋪石路”和“鵝卵石”生長(zhǎng)。

2．2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

培養(yǎng)1～3 d奶牛乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)至3～7 d奶牛乳腺上皮細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，增殖較快。培養(yǎng)7～10 d細(xì)胞增殖緩慢達(dá)到平臺(tái)期。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線為“S”形，符合正常細(xì)胞生長(zhǎng)的一般規(guī)律。

圖1　組織塊種植大約18 h后發(fā)生貼壁，并有少量成纖維細(xì)胞分裂Fig．1　The tissue mass started the adherence and a few fibroblast cells divided after 18 h of inoculation（10×）

圖2　培養(yǎng)6 d成纖維細(xì)胞迅速增殖并處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Fig．2　At 6 days of cultivation，fibroblast cells had rapid proliferation and were in logarithmic growth phase（4×）

圖3　培養(yǎng)8～9 d乳腺上皮細(xì)胞增殖明顯Fig．3　At 8 to 9 days of cultivation，bovine mammary epithelial cells proliferated obviously（4×）

2．3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞角蛋白18的鑒定

由圖6顯示，通過(guò)熒光拍照視野下的所有細(xì)胞都發(fā)出綠色熒光，這說(shuō)明每個(gè)細(xì)胞表面都有細(xì)胞角蛋白18抗原，表明克隆的細(xì)胞為上皮型細(xì)胞。

2．4 奶牛乳腺上皮細(xì)胞核型分析

選擇培養(yǎng)至10和20代的奶牛乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行染色體核型分析。由圖7可知，培養(yǎng)至10和20代的奶牛乳腺上皮細(xì)胞染色體數(shù)仍然是60條，具有哺乳動(dòng)物細(xì)胞的二倍體核型。以上數(shù)據(jù)暗示培養(yǎng)至20代的奶牛乳腺上皮細(xì)胞仍然保持著生物學(xué)功能，細(xì)胞并未轉(zhuǎn)化。

3　討 論

3．1 組織塊法培養(yǎng)原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞

利用組織塊培養(yǎng)原代細(xì)胞是最簡(jiǎn)單方便的方法。此方法未經(jīng)任何酶的處理，因此能夠獲得活性很高且增殖旺盛的細(xì)胞，這為建立永生化細(xì)胞系奠定基礎(chǔ)。國(guó)外培養(yǎng)原代細(xì)胞主要是通過(guò)酶消化法和組織塊法來(lái)獲得原代細(xì)胞［9－11］。然而，此方法需要經(jīng)過(guò)高濃度酶消化組織塊，會(huì)使奶牛乳腺上皮細(xì)胞膜表面的一些受體蛋白遭到破壞。膜蛋白是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要中間蛋白，一旦被破壞，那么細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻，細(xì)胞無(wú)法正常發(fā)揮生物學(xué)功能。國(guó)外研究者還通過(guò)乳汁分離法來(lái)獲得乳腺上皮細(xì)胞。一部分的上皮細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)脫落到乳汁中，通過(guò)密度梯度離心乳汁可以得到乳腺上皮細(xì)胞［12］。鑒于此，本試驗(yàn)采取組織塊細(xì)胞培養(yǎng)法，并成功獲得奶牛乳腺上皮細(xì)胞株。組織塊細(xì)胞培養(yǎng)首先確保組織不能被污染。本試驗(yàn)在培養(yǎng)基中加入3倍常規(guī)濃度的青霉素和鏈霉素是防止細(xì)菌污染的最好的方法。隱形乳房炎的奶牛，采集的乳腺組織中會(huì)帶有真菌，因此在培養(yǎng)基中加入4 μg／mL兩性霉素是防止真菌污染的最有效途徑。組織塊接種到培養(yǎng)瓶的數(shù)量也是非常重要，過(guò)少導(dǎo)致細(xì)胞難以匯合，過(guò)多會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分降低。本試驗(yàn)每隔1 cm大約接種1個(gè)組織塊，取得良好的效果。培養(yǎng)基的用量是組織塊能否成功培養(yǎng)出乳腺上皮細(xì)胞的重要因素，剛開始用培養(yǎng)基濕潤(rùn)組織塊即可。24 h之后再加1 mL DMEM／F12完全培養(yǎng)基，48 h后可再加1 mL DMEM／F12完全培養(yǎng)基。原代培養(yǎng)過(guò)程中，要每天觀察細(xì)胞的培養(yǎng)狀況，如有污染應(yīng)立即丟棄。添加抗生素可以有效防止各種微生物的污染。有研究表明，抗生素會(huì)抑制上皮細(xì)胞的增殖［13］。從培養(yǎng)箱拿出培養(yǎng)瓶的時(shí)候，要小心操作，禁止晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，只要輕微的晃動(dòng)，組織塊就可能會(huì)漂起來(lái)。培養(yǎng)6 d奶牛乳腺上皮細(xì)胞就會(huì)從乳腺組織周圍分裂出來(lái)，然而，動(dòng)物的小腸上皮細(xì)胞24 h就會(huì)從組織塊周圍輻射出。這可能是小腸上皮細(xì)胞還處于胚胎時(shí)期，并未分化成熟，增殖旺盛。然而，奶牛乳腺上皮細(xì)胞已具有分泌乳蛋白的功能，處于細(xì)胞的分化末期。本試驗(yàn)研究表明，運(yùn)用組織塊培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞是獲得原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞的最佳方法。

圖4　利用96孔板有限稀釋法獲得的單克隆奶牛乳腺上皮細(xì)胞系Fig．4　Monoclonal bovine mammary epithelial cell lines obtained using limiting dilution method（10×）

圖5　奶牛乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig．5　Growth curve of bovine mammary epithelial cells

圖6　奶牛乳腺上皮細(xì)胞角蛋白18免疫熒光鑒定Fig．6　Identification of bovine mammary epithelial cells bycytokeratin 18 immunofluorescence

圖7　奶牛乳腺上皮細(xì)胞核型分析Fig．7　Karyotype analysis of bovine mammary epithelial cells

3．2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞分離純化與克隆

組織塊細(xì)胞培養(yǎng)法最大的缺點(diǎn)是上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞夾雜生長(zhǎng)。本試驗(yàn)采用刮除法、相差消化和相差貼壁法來(lái)純化奶牛乳腺上皮細(xì)胞。首先在顯微鏡下用油筆圈出幾個(gè)上皮細(xì)胞集落，然后將上皮細(xì)胞集落外的雜細(xì)胞刮掉，再用DPBS清洗以去除雜細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)，直至培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)大部分是上皮細(xì)胞。采用0．25%胰酶消化細(xì)胞4 min，這時(shí)大部分成纖維細(xì)胞皺縮發(fā)亮，用力敲打培養(yǎng)瓶，大量的成纖維細(xì)胞從瓶底脫落，然而上皮細(xì)胞不會(huì)脫落或很少脫落，DMEM／F12完全培養(yǎng)基終止消化。如果仍然有雜細(xì)胞生長(zhǎng)，可采用相差貼壁法進(jìn)一步純化細(xì)胞。由于成纖維細(xì)胞的貼壁速率比上皮細(xì)胞貼壁快。因此，放入培養(yǎng)箱中30 min，成纖維細(xì)胞基本貼壁，上皮細(xì)胞沒(méi)有貼壁，將培養(yǎng)基移入另一培養(yǎng)瓶中，此時(shí)培養(yǎng)瓶基本上是奶牛乳腺上皮細(xì)胞，但仍然有很少的成纖維細(xì)胞。通過(guò)有限稀釋法能夠獲得單克隆奶牛乳腺上皮細(xì)胞系。國(guó)外克隆細(xì)胞采用克隆環(huán)方法，然而本試驗(yàn)未獲得成功，有待進(jìn)一步探討。

3．3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

細(xì)胞生長(zhǎng)曲線是評(píng)定奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的生物學(xué)特性。非轉(zhuǎn)化細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞在增殖方面差異較大。按照1×104個(gè)／cm2接種細(xì)胞，轉(zhuǎn)化細(xì)胞在2 d之內(nèi)細(xì)胞密度為80%，然而，非轉(zhuǎn)化細(xì)胞需要3 d細(xì)胞密度才達(dá)到70%。由圖5可知，培養(yǎng)1～3 d奶牛乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)速度較慢，培養(yǎng)3～7 d奶牛乳腺上皮細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，增殖較快；培養(yǎng)7～10 d細(xì)胞增殖緩慢達(dá)到平臺(tái)期，細(xì)胞無(wú)法增殖。從時(shí)間上看，原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖10 d才能完成細(xì)胞的增殖過(guò)程。然而，一些腸上皮細(xì)胞和癌細(xì)胞的增殖速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于原代細(xì)胞。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，原代細(xì)胞就會(huì)進(jìn)入衰老期和死亡期。一旦進(jìn)入衰老期，細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞體積變大，有些細(xì)胞出現(xiàn)增殖抑制。越過(guò)細(xì)胞衰老期之后，細(xì)胞就會(huì)進(jìn)入死亡期，這時(shí)大量的原代細(xì)胞凋亡，大部分細(xì)胞開始從瓶底脫落。原代的奶牛乳腺上皮細(xì)胞能夠傳至20代，然而動(dòng)物的腸上皮細(xì)胞一般傳至11代，細(xì)胞就不會(huì)繼續(xù)生長(zhǎng)。為了克服細(xì)胞增殖抑制難題，可通過(guò)轉(zhuǎn)入病毒基因使目的細(xì)胞永生化。有研究表明，一些病毒基因或人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）基因會(huì)使原代細(xì)胞永生化并具有無(wú)限增殖的性能［14－19］。然而，傳代數(shù)的增加，這樣的細(xì)胞會(huì)成為轉(zhuǎn)化細(xì)胞。因此，選取細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)研究，我們必須選取細(xì)胞傳代次數(shù)越少的細(xì)胞進(jìn)行研究，這樣得出的結(jié)果才是可靠的。本試驗(yàn)通過(guò)組織塊培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞并未轉(zhuǎn)入致癌基因，然而也能夠傳至20代，基本上符合試驗(yàn)的需求。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線符合奶牛乳腺上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)特性。以上數(shù)據(jù)暗示培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞具有良好的細(xì)胞生物學(xué)功能，為奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳營(yíng)養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

3．4 奶牛乳腺上皮細(xì)胞角蛋白18的鑒定

國(guó)外鑒定乳腺上皮細(xì)胞過(guò)程中，除了運(yùn)用細(xì)胞角蛋白進(jìn)行鑒定之外，Kumura等［20］和Barash等［21］利用熒光定量β－酪蛋白mRNA的表達(dá)量來(lái)鑒定乳腺上皮細(xì)胞。酪蛋白是乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的特有蛋白質(zhì)。同時(shí)，β－酪蛋白占總酪蛋白50%，因此β－酪蛋白也可作為鑒定是否為乳腺上皮細(xì)胞的重要指標(biāo)之一。本試驗(yàn)采用免疫熒光來(lái)鑒定上皮細(xì)胞表面特異性抗原。由于細(xì)胞角蛋白是上皮細(xì)胞表面特有的蛋白，因此常用來(lái)鑒定是否為上皮細(xì)胞型。利用上皮細(xì)胞表面特異性細(xì)胞角蛋白來(lái)鑒定上皮細(xì)胞型，在鑒定過(guò)程中，一抗稀釋的比例和孵育時(shí)間非常重要，否則會(huì)導(dǎo)致背景過(guò)高。核經(jīng)過(guò)DAPI染色之后，核發(fā)出藍(lán)色熒光，細(xì)胞角蛋白18發(fā)出綠色熒光，以上數(shù)據(jù)暗示我們所培養(yǎng)的細(xì)胞為上皮型。細(xì)胞在一定傳代次數(shù)范圍內(nèi)具有一定的活力，并且仍是上皮細(xì)胞型。但是隨著乳腺上皮細(xì)胞傳代次數(shù)增加至20代之后，細(xì)胞開始出現(xiàn)衰老跡象。

3．5 奶牛乳腺上皮細(xì)胞核型分析

細(xì)胞在傳代的過(guò)程中必然有一些重要的遺傳信息丟失，從而導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法正常模擬體內(nèi)細(xì)胞一樣的正常功能。因此，在傳代的過(guò)程中鑒定奶牛乳腺上皮細(xì)胞的染色體核型是至關(guān)重要。Zhang等［7］通過(guò)SV40 T永生化原代鼻咽上皮細(xì)胞并研究永生化細(xì)胞分子遺傳特征，發(fā)現(xiàn)NP69?LMP1亞細(xì)胞系傳至50代之后染色體紊亂，暗示細(xì)胞傳代增加，細(xì)胞生物學(xué)功能將喪失。國(guó)內(nèi)外研究中，奶牛乳腺上皮細(xì)胞在傳代過(guò)程中同時(shí)鑒定細(xì)胞的染色體核型報(bào)道鮮見，這樣就很容易造成試驗(yàn)結(jié)果不理想。細(xì)胞染色體變?yōu)閱伪扼w、二倍體或多倍體，這些改變對(duì)細(xì)胞的遺傳功能不利的。有研究表明，轉(zhuǎn)錄區(qū)染色體的丟失將阻礙細(xì)胞分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，將下調(diào)抑癌基因的表達(dá)或高表達(dá)一些癌基因［22－24］，這些改變將影響乳腺上皮細(xì)胞的泌乳營(yíng)養(yǎng)調(diào)控和基因表達(dá)。功能基因的表達(dá)是基于啟動(dòng)子基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)的，一旦啟動(dòng)子丟失或甲基化這會(huì)下調(diào)基因表達(dá)或阻礙基因表達(dá)。然而，有些核轉(zhuǎn)錄因子位于染色體上，如果細(xì)胞在傳代法過(guò)程中，染色體丟失或重排，最終引起細(xì)胞功能基因不能夠正常表達(dá)。丟失含有核轉(zhuǎn)錄因子染色體細(xì)胞根本不能夠模擬奶牛體內(nèi)乳腺上皮細(xì)胞的泌乳模型。本試驗(yàn)研究表明，我們所培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞在10和20代染色體數(shù)仍然是60條，是典型的二倍體核型，具有穩(wěn)定的細(xì)胞生物學(xué)功能。

4　結(jié) 論

本試驗(yàn)利用組織塊細(xì)胞培養(yǎng)法成功培養(yǎng)了奶牛乳腺上皮細(xì)胞，且細(xì)胞活力較強(qiáng)，并能夠繼續(xù)傳至20代，原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞成功培養(yǎng)可為細(xì)胞的永生化、酪蛋白調(diào)控機(jī)制、奶牛的分子營(yíng)養(yǎng)研究和奶牛乳房炎的治療提供理想的試驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

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（責(zé)任編輯 王智航）

ZHAN Kang GONG Xiaoxiao ZUO Xiaoxin CHEN Yinyin ZHAN Jinshun ZHAO Guoqi

?

（College of Animal Science and Technology，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China）

【編者按】

現(xiàn)代動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)正朝著營(yíng)養(yǎng)與免疫、營(yíng)養(yǎng)與應(yīng)激乃至營(yíng)養(yǎng)與遺傳育種等相鄰學(xué)科的邊緣地帶互相滲透與拓寬，并取得了許多可喜的進(jìn)展。近年來(lái)為了保證畜禽的健康飼養(yǎng)，防止化學(xué)合成藥物或抗生素添加劑對(duì)畜產(chǎn)品和環(huán)境的污染，一些科技工作者對(duì)中草藥添加劑的應(yīng)用效果進(jìn)行了試驗(yàn)研究?，F(xiàn)發(fā)表一篇有關(guān)杜仲葉提取物方面的來(lái)稿，供讀者參考。但值得注意的是我國(guó)中草藥資源有限，如何科學(xué)合理利用中草藥資源、緩解人畜對(duì)中草藥資源需求的矛盾及監(jiān)控中草藥飼料添加劑的質(zhì)量等對(duì)中草藥添加劑的開發(fā)利用將是十分重要的。

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Culture and Identification of the Bovine Mammary Epithelial Cell Line

?Corresponding author，professor，E?mail：gqzhao＠yzu．edu．cn

Abstract：To establish a functional model of bovine mammary epithelial cell line for the study of lactation reg?ulation，pathogenesis of mastitis，this research applied tissue culture to isolate and culture bovine mammary epi?thelial cells；the limiting dilution method to purify bovine mammary epithelial cells；methyl thiazolyl tetrazoli?um（MTT）method was used to identify whether the growth curve of bovine mammary epithelial cells was‘S’type or not；cytokeratin 18 immunofluorescence was observed to prove that the cells were epithelial type；kary?otype analysis was carried out on bovine mammary epithelial cells in passages 10 and 20．The results showed as follows：1）bovine mammary epithelial cells could be successfully cultured and passaged 20 generations by tis?sue culture method．2）At 5 to 6 days of cultivation，the fibroblast cells proliferated rapidly and a small amount of epithelial cells divided．At 8 days of cultivation，bovine mammary epithelial cells proliferated rapidly and formed island?like colonies，and grew like‘cobblestone’and‘slabstone’as monolayer．3）Bovine mammary epithelial cells showed positive reaction against cytokeratine 18 antigen．4）At passages 10 and 20 of cultiva?tion，the cell chromosome number was 60 and the cells had normal diploid karyotype．In conclusion，tissue culture cells are able to obtain stable，functional bovine mammary epithelial cells，but are not immortalized cells．［Chinese Journal of Animal Nutrition，2015，27（8）：2544?2550］

Key words：bovine mammary epithelial cells；mastitis；functional；karyotype analysis

通信作者：?趙國(guó)琦，教授，博士生導(dǎo)師，E?mail：gqzhao＠yzu．edu．cn

作者簡(jiǎn)介：詹 康（1988—），男，江蘇南京人，博士研究生，從事動(dòng)物分子營(yíng)養(yǎng)研究。E?mail：zhankang0305＠163．com

基金項(xiàng)目：江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工作資助項(xiàng)目（PAPD）

收稿日期：2015－03－02

doi：10．3969／j．issn．1006?267x．2015．08．028

文章編號(hào)：1006?267X（2015）08?2544?07

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：S823