煙酸對(duì)水牛瘤胃發(fā)酵指標(biāo)及微生物區(qū)系的影響

林 波 梁 辛 韋升菊 李麗莉 梁賢威 李 萍 鄒彩霞（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，農(nóng)業(yè)部（廣西）水牛遺傳繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧530001）

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煙酸對(duì)水牛瘤胃發(fā)酵指標(biāo)及微生物區(qū)系的影響

林 波 梁 辛 韋升菊 李麗莉 梁賢威 李 萍 鄒彩霞?
（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，農(nóng)業(yè)部（廣西）水牛遺傳繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧530001）

摘 要：本試驗(yàn)旨在研究飼糧添加煙酸對(duì)水牛瘤胃發(fā)酵指標(biāo)及微生物區(qū)系的影響。試驗(yàn)選用36頭健康狀況良好，體重接近的雜交泌乳水牛，隨機(jī)分為4個(gè)組，分別在基礎(chǔ)飼糧中添加0（對(duì)照）、4、8、12 g／d煙酸，煙酸與精料混合飼喂，進(jìn)行預(yù)試期14 d，正試期42 d的飼養(yǎng)試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)束后，胃管采集瘤胃液測(cè)定瘤胃發(fā)酵指標(biāo)，并采用Illumina Miseq PE250高通量測(cè)序平臺(tái)分別測(cè)序瘤胃細(xì)菌和甲烷菌16S rRNA基因以確定二者區(qū)系組成。結(jié)果表明：1）與對(duì)照組相比，添加12 g／d煙酸提高了水牛日均采食量（P＜0．05）和瘤胃液氨態(tài)氮濃度（P＞0．05），煙酸各組均顯著降低了瘤胃液總揮發(fā)性脂肪（TVFA）濃度（P＜0．05），但未顯著影響瘤胃液pH（P＞0．05）。2）水牛瘤胃內(nèi)細(xì)菌在門水平上主要以擬桿菌門和厚壁菌門為主，科水平上為普雷沃氏菌科和黃桿菌科；甲烷菌以甲烷短桿菌屬為主，占90%以上，其次為甲烷球菌屬和熱原體屬，水牛瘤胃微生物區(qū)系總體上與奶牛等其他利用植物纖維的反芻動(dòng)物相似。3）與對(duì)照組相比，飼糧添加煙酸顯著降低了瘤胃內(nèi)厚壁菌門的比例（P＜0．05），顯著提高了黃桿菌科細(xì)菌的比例（P＜0．05），但對(duì)瘤胃甲烷菌區(qū)系無顯著影響（P＞0．05）。飼糧添加煙酸改變了水牛瘤胃發(fā)酵指標(biāo)和微生物區(qū)系組成，瘤胃發(fā)酵指標(biāo)的變化除了與煙酸對(duì)水牛熱應(yīng)激的緩解和消化吸收的影響有關(guān)，還與煙酸添加對(duì)瘤胃細(xì)菌區(qū)系的影響有關(guān)。

關(guān)鍵詞：煙酸；水牛；瘤胃發(fā)酵；微生物區(qū)系

水牛是我國(guó)南方地區(qū)重要的奶源動(dòng)物，主要生活在亞熱帶高溫潮濕地區(qū)，對(duì)熱應(yīng)激有一定的耐受性［1］。然而隨著奶水牛集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，高產(chǎn)奶水牛對(duì)應(yīng)激的敏感性增強(qiáng)，因此有必要補(bǔ)充微量元素和維生素等抗應(yīng)激添加劑。煙酸是與動(dòng)物體內(nèi)的碳水化合物、脂肪及蛋白質(zhì)代謝密切相關(guān)的一種B族維生素，飼糧中添加煙酸的作用機(jī)制之一是彌補(bǔ)了瘤胃內(nèi)合成的不足，從而滿足了動(dòng)物正常生理代謝對(duì)煙酸的需求，特別是在高溫條件下，可緩解動(dòng)物的熱應(yīng)激［2］。李萍等［3］研究表明飼糧添加8和12 g／d煙酸分別提高水牛產(chǎn)奶量達(dá)11．5%和8．0%。也有研究表明飼糧添加煙酸可刺激瘤胃微生物的生長(zhǎng)，進(jìn)而影響瘤胃發(fā)酵指標(biāo)［4－5］?，F(xiàn)有研究表明飼糧添加煙酸提高了瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸和氨態(tài)氮濃度，增加了微生物蛋白濃度［6－7］。目前，煙酸添加對(duì)水牛瘤胃發(fā)酵指標(biāo)影響的研究還較少，特別是尚無對(duì)瘤胃微生物區(qū)系影響的研究報(bào)道，而外源煙酸對(duì)瘤胃微生物區(qū)系的影響是闡明煙酸在瘤胃內(nèi)作用機(jī)制的關(guān)鍵。因此，本研究對(duì)處于高溫條件下的泌乳水牛飼糧中添加煙酸，研究其對(duì)瘤胃微生物區(qū)系和瘤胃發(fā)酵指標(biāo)的影響，旨在闡明外源煙酸對(duì)瘤胃發(fā)酵的影響機(jī)制。

1　材料與方法

1．1 試驗(yàn)動(dòng)物與管理

本試驗(yàn)于2012－07－07—2012－08－31在廣西水牛研究所水牛養(yǎng)殖試驗(yàn)研究與示范基地進(jìn)行。選取36頭日均產(chǎn)奶量在5 kg以上，泌乳天數(shù)超過30 d的健康雜交（廣西本地水?！聊崂铮扑！聊＃┟谌樗＃ㄆ骄挲g為6．5歲，平均體重為615 kg，胎次為2～4胎）。按產(chǎn)奶量、泌乳期等相近原則隨機(jī)分為4組，每組9頭水牛。試驗(yàn)牛進(jìn)行單槽專人飼喂、每天擠奶2次，采取先粗后精的飼喂順序。飼喂后，試驗(yàn)牛放于運(yùn)動(dòng)場(chǎng)自由運(yùn)動(dòng)和飲水。

1．2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將4組水牛分為對(duì)照組和試驗(yàn)組，其中對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧（組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1），按照張麗英［8］的方法測(cè)定各原料營(yíng)養(yǎng)水平后，按照配方計(jì)算出飼糧營(yíng)養(yǎng)水平；試驗(yàn)組分別飼喂基礎(chǔ)飼糧添加4、8、12 g／d煙酸（購(gòu)自廣西彼得漢預(yù)混飼料有限公司，有效含量≥99．0%）的試驗(yàn)飼糧，煙酸與精料混合飼喂。整個(gè)試驗(yàn)期共56 d，其中預(yù)試期14 d，正試期42 d。預(yù)試期內(nèi)逐步增加各試驗(yàn)組煙酸喂量，直至正試期前達(dá)到試驗(yàn)設(shè)定水平。從正試期開始，每隔7 d用逐一稱量各試驗(yàn)牛飼糧飼喂量和剩料量，并計(jì)算各組試驗(yàn)牛日均采食量。

1．3 樣品采集和測(cè)定

1．3．1 瘤胃液采集

正試期結(jié)束后，每組挑選泌乳量和采食量最為接近的3頭水牛采集瘤胃液，分析瘤胃微生物區(qū)系。于正試期第42天晨飼前通過胃管采集水牛瘤胃液500 mL，通過4層紗布過濾后，立即用便攜式pH測(cè)定儀（PP?50?P11，Sartorius，德國(guó)）測(cè)定各樣品pH，取10 mL瘤胃液保存于－20℃，用于乳酸和揮發(fā)性脂肪酸濃度測(cè)定，另取50 mL濾液冷凍干燥（Christ Alpha 1?4 LD plus，Christ Alpha，德國(guó)）后用于DNA提取測(cè)定微生物區(qū)系。

1．3．2 瘤胃液氨態(tài)氮、乳酸和揮發(fā)性脂肪酸濃度測(cè)定

瘤胃液氨態(tài)氮濃度采用比色法按照馮宗慈等［9］的方法測(cè)定。乳酸濃度測(cè)定采用試劑盒法（試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所），該法是基于比色法進(jìn)行。揮發(fā)性脂肪酸濃度按照胡偉蓮等［10］的方法，采用氣相色譜法測(cè)定，測(cè)定儀器為Agilent 7890A型氣相色譜儀，毛細(xì)管柱為Agilent?HP?INNOWax毛細(xì)管柱（19091N－133）。氣相色譜條件為柱溫180℃，氣化室溫度200℃，檢測(cè)室溫度220℃，載氣使用高純氮?dú)?，總壓?0 kPa，總流量37．2 mL／min，柱流量0．67 mL／min，線速度23．4 cm／s，分流比50∶50，吹掃流量3 mL／min，循環(huán)流量8 mL／min，氫氣流量40 mL／min，空氣流量400 mL／min，進(jìn)樣量2 μL。

表1　基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 1　Composition and nutrient levels of the basal diet（air?dry basis）　%

1．3．3 瘤胃微生物區(qū)系測(cè)定

1．3．3．1 瘤胃液DNA提取

稱取25 mg冷凍干燥瘤胃液置于裝有0．7 g鋯珠（0．1 mm）200 μL的20%十二烷基四乙酸二鈉（SDS）、282 μL的QIAquick Buffer A、268 μL的QIAquick Buffer PB（QIAquick kit，Qiagen，德國(guó)）和550 μL的飽和酚／氯仿／異戊醇（25∶24∶1）溶液的離心管中。封閉離心管后于小型珠磨器（Bio?spec Mini?Beadbeater?16，美國(guó)）上破碎2 min，然后于16 000×g（4℃）下離心20 min，取500 μL上清液與650 μL的磷酸鹽緩沖液混合后，用QIAquick PCR purification kit純化混合液獲得DNA樣品。1．3．3．2 水牛瘤胃微生物區(qū)系組成的測(cè)序分析

瘤胃細(xì)菌和甲烷菌的16S rRNA基因片段擴(kuò)增與處理均按照Kittelmann等［11］提供的方法進(jìn)行。PCR引物由Illumina Miseq PE250測(cè)序接頭、1個(gè)2堿基的連接（linker）和樣品標(biāo)簽（barcode）組成，細(xì)菌PCR引物為515f／806r，甲烷菌PCR引物為519f／915r（表2）。PCR擴(kuò)增采用Promega PCR mix進(jìn)行，體系為50 μL，每個(gè)樣品的2種微生物分別擴(kuò)增2管；PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃，3 min；然后進(jìn)入94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s的循環(huán)，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；PCR擴(kuò)增后，將同一樣品的同一種微生物的2管PCR產(chǎn)物混合，電泳后切膠回收，采用天根膠回收試劑盒純化；采用ND2000超微量核酸蛋白測(cè)定儀（THERMO，德國(guó)）準(zhǔn)確測(cè)定純化產(chǎn)物的DNA濃度后（精確到0．1 ng／μL），每個(gè)樣品的PCR純化產(chǎn)物按照細(xì)菌∶甲烷菌＝5∶1的濃度比例混合。最后，將各樣品全部PCR產(chǎn)物混合后，送廣州?；锛夹g(shù)有限公司應(yīng)用Miseq PE250平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序分析。

表2　瘤胃微生物區(qū)系測(cè)序分析采用的引物信息Table 2　Information of primers used to microbe composition sequencing analysis

1．3．3．3 測(cè)序序列的聚類分析和注釋

測(cè)序數(shù)據(jù)分析采用QIIME 1．5進(jìn)行，經(jīng)過去除接頭污染、低復(fù)雜度以及低質(zhì)量reads等質(zhì)量控制后，對(duì)獲得的序列（clean reads）進(jìn)行拼接并去除引物，用于后繼分析［12］。序列分類操作單元（OTU）注釋和聚類分析按照細(xì)菌和古菌97%相似度進(jìn)行。OTU聚類分析和注釋通過與Ribosomal Data?base Project（RDP）數(shù)據(jù)庫(kù)中的細(xì)菌和古菌序列比對(duì)進(jìn)行，細(xì)菌聚類分析到門和屬水平，甲烷菌分類到屬水平，豐度圖采用Excel軟件制作。

1．4 統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)均采用SAS 8．02軟件的GLM程序進(jìn)行單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析，多重比較采用Duncan氏法，P＜0．05為差異顯著性判定標(biāo)準(zhǔn)。

2　結(jié) 果

2．1 飼糧添加煙酸對(duì)泌乳水牛瘤胃發(fā)酵指標(biāo)的影響

飼糧添加煙酸后，日均采食量和瘤胃發(fā)酵指標(biāo)如表3所示。低、中水平煙酸（4和8 g／d）添加對(duì)日均采食量無顯著影響（P＞0．05），但高水平煙酸（12 g／d）添加則顯著提高了日均采食量（P＜0．05）。飼糧添加煙酸對(duì)瘤胃液pH沒有顯著影響（P＞0．05）。添加煙酸各組瘤胃液氨態(tài)氮的濃度均與對(duì)照組差異不顯著（P＞0．05）。12 g／d煙酸相比于其他各組均顯著提高了瘤胃液乳酸濃度（P＜0．05），而與對(duì)照組相比，4和8 g／d的煙酸添加對(duì)乳酸濃度無顯著影響（P＞0．05）。飼糧添加煙酸極顯著降低了瘤胃液乙酸、丙酸和丁酸濃度和總揮發(fā)性脂肪酸濃度（P＜0．01）。與對(duì)照組相比，中、高水平煙酸（8和12 g／d）添加組總揮發(fā)性脂肪酸濃度降幅達(dá)34%以上。

2．2 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制與多樣性分析結(jié)果

高通量測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)量控制后獲得的細(xì)菌和甲烷菌序列數(shù)、OTU數(shù)以及樣品物種多樣性指數(shù)如表4所示。水牛瘤胃內(nèi)細(xì)菌測(cè)序后，在種水平上得到的平均序列數(shù)為22 663條，平均OTU數(shù)為1 042個(gè)，測(cè)序覆蓋率均在0．88以上；細(xì)菌平均香農(nóng)多樣性指數(shù)為6．65，平均Chao1多樣性指數(shù)為1 137，細(xì)菌組間各指標(biāo)均無顯著差異（P＞0．05）。水牛瘤胃內(nèi)甲烷菌測(cè)序后，在種水平上得到的平均序列數(shù)為8 599條，平均OTU數(shù)為200個(gè)，測(cè)序覆蓋率均在0．87以上；平均甲烷菌香農(nóng)多樣性指數(shù)為1．41，平均Chao1多樣性指數(shù)為277，甲烷菌

組間各指標(biāo)均無顯著差異（P＞0．05）。

表3　飼糧添加煙酸對(duì)泌乳水牛日均采食量和瘤胃發(fā)酵指標(biāo)的影響Table 3　Effects of dietary niacin addition on ADFI and ruminal fermentation indexes of lactating water buffaloes

表4　細(xì)菌和甲烷菌高通量測(cè)序質(zhì)量控制與物種多樣性指數(shù)Table 4　Quality control of high?flux sequencing and diversity indexes of bacteria and methanogen

2．3 飼糧添加煙酸對(duì)泌乳水牛瘤胃細(xì)菌區(qū)系的影響

飼糧添加煙酸后瘤胃細(xì)菌在門水平的組成如圖1所示，水牛瘤胃細(xì)菌在門水平上共有14個(gè)門，其中主要的細(xì)菌門是擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），這3類菌占總細(xì)菌的90%左右。飼糧添加煙酸后瘤胃細(xì)菌在科水平上的組成如圖2所示，共有65個(gè)科，其中普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）和黃桿菌科（Fibrobacteraceae）是在科水平的上主要細(xì)菌種類，共占據(jù)了總細(xì)菌的30%左右。

圖1　飼糧添加煙酸對(duì)泌乳水牛瘤胃細(xì)菌在門水平上組成的影響Fig．1　Effects of dietary addition of niacin on ruminal bacteria composition at phyla level of lactating water buffaloes

圖2　飼糧添加煙酸對(duì)泌乳水牛瘤胃細(xì)菌在科水平上組成的影響Fig．2　Effects of dietary addition of niacin on ruminal bacteria composition at family level of lactating water buffaloes

由表5可見，在門水平上，煙酸各組均顯著降低了瘤胃內(nèi)厚壁菌門的比例（P＜0．05），但未影響其他占總菌比例大于1%的細(xì)菌比例（P＞0．05）。在科水平上，煙酸各組均顯著提高了瘤胃內(nèi)黃桿菌科的比例（P＜0．05），未影響其他占總菌比例大于1%的細(xì)菌比例（P＞0．05）。

2．3 飼糧添加煙酸對(duì)泌乳水牛瘤胃甲烷菌區(qū)系的影響

飼糧添加煙酸后瘤胃甲烷菌區(qū)系在屬水平的組成如圖3所示。可鑒定到屬水平的水牛瘤胃甲烷菌共6個(gè)，其中主要的甲烷菌是甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）、熱原體屬（Thermoplasma）和甲烷球菌屬（Methanosphaera），這3類菌占總甲烷菌的95%，其中甲烷短桿菌屬在各樣品的比例均在90%以上。飼糧煙酸添加未影響各組中甲烷短桿菌屬和其他甲烷菌的比例。

3　討 論

3．1 煙酸對(duì)水牛瘤胃發(fā)酵指標(biāo)的影響

煙酸又名尼克酸，屬B族維生素，是2個(gè)重要輔酶煙酰胺腺嘌呤二核甘酸（NADH）和煙酰胺腺嘌呤二核甘酸磷酸（NADP）的成分，在動(dòng)物體內(nèi)的起著重要作用。煙酸對(duì)于奶牛的應(yīng)激，特別是熱應(yīng)激具有緩解作用，且在高產(chǎn)奶牛和水牛飼糧中添加一定量的煙酸可顯著提高奶牛產(chǎn)奶量、乳脂率［3］。飼糧添加煙酸的主要作用機(jī)制可能在于，吸收入動(dòng)物體內(nèi)后促進(jìn)了碳水化合物、脂肪及蛋白質(zhì)代謝。也有研究表明，煙酸可影響瘤胃發(fā)酵指標(biāo)，進(jìn)而影響動(dòng)物的消化吸收［13－14］。一些體內(nèi)與體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，煙酸可以促進(jìn)奶牛瘤胃微生物合成蛋白質(zhì)［13，15］；楊艷等［6］研究表明高精料（80%）條件下，添加煙酸顯著提高了瘤胃液pH及丙酸、總揮發(fā)性脂肪酸濃度，降低了乳酸濃度；歐陽(yáng)克蕙等［14］研究表明，在體外試驗(yàn)條件下高精料飼糧（精粗比85∶15）中添加適量煙酸促進(jìn)揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)生，提高氨態(tài)氮的濃度。本研究表明，低、中水平（4和8 g／d）的煙酸對(duì)瘤胃液氨態(tài)氮和乳酸濃度無顯著影響，但添加高水平（12 g／d）煙酸則提高了氨態(tài)氮和乳酸濃度，表明高水平的煙酸可能促進(jìn)了微生物對(duì)飼料蛋白質(zhì)的分解利用；而乳酸濃度升高則不同于楊艷等［6］的結(jié)論，原因與本試驗(yàn)中水牛飼喂高粗飼糧且采食量有所提高有關(guān)。目前，現(xiàn)有多數(shù)研究表明煙酸添加有提高瘤胃揮發(fā)性脂肪濃度的趨勢(shì)［6，15］，機(jī)制是煙酸可促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)進(jìn)而促進(jìn)瘤胃發(fā)酵，但這些研究多是在體外條件下進(jìn)行，未考慮到煙酸對(duì)動(dòng)物機(jī)體代謝的影響［13，15］。本研究中的煙酸的添加，特別是在中、高水平（8和12 g／d）下顯著降低了瘤胃液中總揮發(fā)性脂肪濃度的機(jī)制尚不明了，可能是煙酸添加后降低了熱應(yīng)激且提高了水牛產(chǎn)奶量［3］，進(jìn)而促進(jìn)了瘤胃對(duì)揮發(fā)性脂肪酸的攝取利用，但尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

表5　飼糧添加煙酸對(duì)泌乳水牛瘤胃細(xì)菌在門和科水平上細(xì)菌比例（占總菌比例大于1%的細(xì)菌）的影響Table 5　Effects of dietary addition of niacin on ruminal bacteria composition（the percentage of bacteria in total bacteria＞1%）at phyla and family levels of lactating water buffaloes　%

3．2 煙酸對(duì)水牛瘤胃細(xì)菌組成的影響

細(xì)菌約占瘤胃生物量的50%～80%，研究表明反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)具有豐富的細(xì)菌種群，與其他脊椎動(dòng)物消化道微生物區(qū)系相似，厚壁菌門和擬桿菌門是主要的2大類別，占80%左右，另外還含有比例較少的螺旋體門（Spirochaetes）、放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門等類群［11，16－17］。本研究采用高通量測(cè)序分析結(jié)果表明，水牛瘤胃內(nèi)細(xì)菌種類較多，共發(fā)現(xiàn)有68個(gè)屬的細(xì)菌，在種水平上的香農(nóng)多樣性指數(shù)平均為6．65，飼糧煙酸并未影響瘤胃細(xì)菌多樣性。水牛瘤胃內(nèi)主要的細(xì)菌在門水平為擬桿菌門和厚壁菌門，科水平為普雷沃氏菌科和黃桿菌科。本研究結(jié)果與其他有關(guān)水牛瘤胃細(xì)菌區(qū)系的研究結(jié)果相似，總體上也與其他反芻動(dòng)物瘤胃細(xì)菌區(qū)系的組成相似，表現(xiàn)出典型的纖維消化主導(dǎo)的細(xì)菌區(qū)系特征［18－20］。瘤胃細(xì)菌可合成煙酸，因此瘤胃內(nèi)自身就有煙酸的存在，現(xiàn)有研究表明，外源煙酸添加可進(jìn)一步促進(jìn)瘤胃微生物的生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)的合成［13，15］，而本研究的其他試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)煙酸可提高水?？箲?yīng)激和能力和能量表觀消化率，但對(duì)纖維表觀消化率無顯著影響［3］。目前有關(guān)煙酸對(duì)瘤胃細(xì)菌組成影響的研究還較少，本研究中，添加煙酸降低了水牛瘤胃內(nèi)革蘭氏陽(yáng)性的厚壁菌門細(xì)菌的比例，但提高了與瘤胃纖維消化密切相關(guān)的黃桿菌科細(xì)菌的比例，可見煙酸在一定程度上影響了瘤胃細(xì)菌的區(qū)系組成。因此，本研究中瘤胃發(fā)酵指標(biāo)的變化，特別是揮發(fā)性脂肪在煙酸添加組中顯著降低是否與瘤胃細(xì)菌區(qū)系的變化有關(guān)是一個(gè)值得后繼研究的重要內(nèi)容。此外，瘤胃揮發(fā)性脂肪酸濃度的降低可能也與煙酸添加后緩解了熱應(yīng)激［3］，進(jìn)而促進(jìn)了瘤胃對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的吸收有關(guān)。

圖3　飼糧添加煙酸對(duì)泌乳水牛瘤胃甲烷菌在屬水平上組成的影響Fig．3　Effects of dietary addition of niacin on ruminal methanogen composition at genus level of lactating water buffaloes

3．3 煙酸對(duì)水牛瘤胃甲烷菌組成的影響

甲烷菌主要在瘤胃內(nèi)主要參與有機(jī)物厭氧降解的最后一步，并利用發(fā)酵產(chǎn)生的氫生產(chǎn)甲烷。反芻動(dòng)物排放的甲烷是與全球氣候變化密切相關(guān)的溫室氣體，因此反芻動(dòng)物瘤胃甲烷菌區(qū)系和特點(diǎn)是研究的熱點(diǎn)［21］?，F(xiàn)有研究表明，反芻動(dòng)物瘤胃甲烷菌以甲烷短桿菌屬為主，其次是甲烷球菌屬和熱原體屬［22］；有較多印度學(xué)者的研究表明，水牛瘤胃內(nèi)甲烷菌以甲烷微菌屬（Methanomicrobi?um）菌群為主，表現(xiàn)出于其他反芻動(dòng)物不同的區(qū)系［23－25］。本研究高通量測(cè)序分析結(jié)果表明，水牛瘤胃內(nèi)共發(fā)現(xiàn)有11個(gè)屬的細(xì)菌，在種水平上的香農(nóng)多樣性指數(shù)平均是1．41，且飼糧煙酸也未影響瘤胃甲烷菌多樣性。水牛瘤胃內(nèi)90%的甲烷菌為甲烷短桿菌屬，其次為甲烷球菌屬和熱原體屬，總體上于其他反芻動(dòng)物瘤胃甲烷菌區(qū)系組成相似，該結(jié)果與Franzolin等［26］的報(bào)道一致。添加煙酸后，瘤胃甲烷菌區(qū)系并無明顯變化，各組中甲烷短桿菌屬的比例均在90%以上，并未顯著影響甲烷短桿菌屬在瘤胃內(nèi)的主導(dǎo)地位。煙酸是瘤胃內(nèi)產(chǎn)氫細(xì)菌的必須輔酶因子，而氫是瘤胃內(nèi)以氫為底物的甲烷短桿菌屬和甲烷球菌屬等甲烷菌生長(zhǎng)代謝的底物，因此煙酸的添加可促進(jìn)這些氫利用甲烷菌的生長(zhǎng)，進(jìn)一步鞏固其主導(dǎo)地位。

4　結(jié) 論

①飼糧中添加煙酸能不同程度地提高水牛日均采食量和瘤胃液氨態(tài)氮濃度，但顯著降低了瘤胃液總揮發(fā)性脂肪濃度。

②水牛瘤胃內(nèi)細(xì)菌在門水平上主要以擬桿菌門和厚壁菌門為主，科水平上為普雷沃氏菌科和黃桿菌科；甲烷短桿菌屬是瘤胃內(nèi)主要的甲烷菌，占90%以上?？傮w上水牛瘤胃微生物區(qū)系與奶牛等其他反芻動(dòng)物相似，表現(xiàn)出以纖維消化為特征的區(qū)系組成。

③煙酸降低了瘤胃內(nèi)厚壁菌門細(xì)菌的比例，提高了黃桿菌科細(xì)菌的比例，但對(duì)瘤胃甲烷菌區(qū)系無顯著影響。

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Effects of Niacin on Ruminal Fermentation Indexes and Microflora of Water Buffaloes

LIN Bo LIANG Xin WEI Shengju LI Lili LIANG Xianwei LI Ping ZOU Caixia

?

（責(zé)任編輯 王智航）

（Key Laboratory of Buffalo Genetics，Breeding and Reproduction，Ministry of Agriculture and Guangxi，Buffalo Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530001，China）

?Corresponding author，professor，E?mail：caixiazou2002＠hotmail．com

Abstract：This study was conducted to study the effects of dietary addition of niacin on ruminal fermentation indexes and microflora of water buffaloes．Thirty?six healthy hybrid water buffaloes with similar body weight were selected and divided into four groups randomly．The four groups were fed the same basal diet but added with 0（control），4，8 and 12 g／d，respectively．Niacin was mixed in concentrate to feed．The advanced ex?periment feeding period was 14 days and the formal experimental period was 42 days．At the end of experi?ment，rumen fluid samples were taken from rumen by stomach tube to test the ruminal fermentation indexes，16S rRNA genes of ruminal bacteria and methanogen were tested to determine microbial community by Illumi?na Miseq PE250 high?throughput sequencing．The results showed as follows：1）compared with control group，the addition of 12 g／d of niacin increased average daily feed intake（P＜0．05）and rumen fluid ammonia con?centration（P＞0．05），niacin groups significantly decreased rumen fluid total volatile fatty acid（TVFA）con?centration（P＜0．05），but the rumen fluid pH was not significantly influenced（P＞0．05）．2）Water buffalo ruminal bacterial community was dominated by Bacteroidetes and Firmicutes at phyla level，Prevotellaceae and Fibrobacteraceae at family level，while ruminal methanogen community was dominated by Methanobrevibacter （over 90%）at genus level，followed by Methanosphaera and Thermoplasma．Water buffalo ruminal bacteria and methanogen community composition was generally similar with other ruminants which could utilize plant fi?ber．3）Compared with control group，the addition of niacin significantly decreased ruminal Firmicutes the pro?portion（P＜0．05），and significantly increased ruminal Fibrobacteraceae proportion（P＜0．05），but there was no influence on methanogen community（P＞0．05）．In conclusion，the addition of niacin changes ruminal fer?mentation indexes and microflora of water buffaloes，the changes of ruminal fermentation indexes on one hand are related with release on heat stress and improvement on digestion of niacin，on another hand are related with the change of ruminal microflora．［Chinese Journal of Animal Nutrition，2015，27（8）：2396?2404］

Key words：niacin；water buffalo；ruminal fermentation；microflora

通信作者：?鄒彩霞，研究員，碩士生導(dǎo)師，E?mail：caixiazou2002＠hotmail．com

作者簡(jiǎn)介：林 波（1983—），男，四川雅安人，副研究員，博士，主要從事反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究，E?mail：linbobri＠foxmail．com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31160470）；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2013GXNSFBA019114）

收稿日期：2015－03－02

doi：10．3969／j．issn．1006?267x．2015．08．011

文章編號(hào)：1006?267X（2015）08?2396?09

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：S823；S816．7