高脂飼糧對日本鵪鶉（Cotur nix japonica）盲腸微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

劉莎莎張宏福鄭明德計 成

（1．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)國家重點實驗室，北京100193；2．中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京100193；3．加拿大英屬哥倫比亞大學(xué)，禽類研究中心，溫哥華V6T1Z4）

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高脂飼糧對日本鵪鶉（Cotur nix japonica）盲腸微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

劉莎莎1，2張宏福1?鄭明德3計 成2

（1．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)國家重點實驗室，北京100193；2．中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京100193；3．加拿大英屬哥倫比亞大學(xué)，禽類研究中心，溫哥華V6T1Z4）

摘 要：本試驗旨在研究高脂飼糧對日本鵪鶉（Cotur nix japonica）盲腸微生物群落結(jié)構(gòu)、組成及其脂肪代謝的影響。選擇160只1日齡日本鵪鶉，1～6周齡飼喂半合成飼糧，6周齡時，所有鵪鶉隨機分成2個組，每組8個重復(fù)，每個重復(fù)10只。2組分別飼喂半合成飼糧和添加膽固醇的半合成飼糧，繼續(xù)飼喂6周。試驗期結(jié)束后，每個重復(fù)隨機挑選1只接近平均體重的鵪鶉進行屠宰，收集血液分離得到血漿用于脂肪代謝指標分析；采集鵪鶉盲腸內(nèi)容物，用焦磷酸測序分析微生物群落結(jié)構(gòu)和組成。結(jié)果表明：1）高脂飼糧組鵪鶉總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）含量和LDL／高密度脂蛋白（HDL）顯著提高（P＜0．05）；2）高脂飼糧顯著降低盲腸微生物多樣性（P＜0．05）；在微生物科水平，高脂飼糧顯著降低Lactobacillal、Streptococcaceae和Clostridiales （P＜0．05）、其他（others）科的豐度（P＜0．05），顯著提高Erysipelotrichales、Erysipelotrichaceae科的豐度（P＜0．05），在微生物屬水平，高脂飼糧顯著降低Ruminococcaceae、Ruminococcus的豐度（P＜0．05），但是顯著提高了Erysipelotrichaceae、cc＿115和Erysipelotrichaceae、Eubacterium的豐度（P＜0．05）；3）cc＿115（Erysipelotrichaceae）和未被分類的微生物（屬于Lachnospiraceae科）豐度與TC、LDL含量和LDL／HDL呈顯著正相關(guān)（P＜0．05），除此之外Eubacterium（Erysipe?lotrichaceae）只與LDL／HDL呈顯著正相關(guān)（P＜0．05），Ruminococcus（Ruminococcaceae）的豐度與TC、LDL含量和LDL／HDL呈顯著負相關(guān)（P＜0．05），Ruminococcus（Lachnospiraceae）的豐度與HDL含量呈顯著正相關(guān)（P＜0．05）。由此可見，高脂飼糧影響了日本鵪鶉盲腸微生物群落的結(jié)構(gòu)、組成及其脂肪代謝。

關(guān)鍵詞：高脂飼糧；腸道微生物群落；脂肪代謝

自從2005年新一代測序技術(shù)（next?generation sequencing，NGS）問世以來，對科學(xué)研究領(lǐng)域產(chǎn)生了翻天覆地的影響。隨著核酸序列數(shù)據(jù)的單堿基測序費用下降，給動物科學(xué)研究帶來了更多的新思路和新方案，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動物全基因組測序、基因組重測序、轉(zhuǎn)錄組測序、小RNAs測序和微生物測序等方面。微生物在動物腸道能降解食物中纖維，合成維生素幫助動物吸收營養(yǎng)物質(zhì)，維持腸道免疫系統(tǒng)功能，抵擋有害微生物的侵入。Zhao等［1］用新一代高通量測序技術(shù)研究雞雙向選擇家系的個體腸道微生物，提出腸道微生物菌群的組成和分布具備數(shù)量性狀的特點，將其視為宿主的一個性狀。動物腸道中寄生的微生物群落種類繁多，數(shù)量驚人，是動物體細胞總量的10倍以上［2］，目前依然有80%以上的微生物不為所知，宿主和腸道微生物相互作用的特點和規(guī)律還不是很清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，飼喂高脂肪飼糧給無菌小鼠和正常小鼠，無菌小鼠沒有得肥胖癥；進一步研究分別移植肥胖癥小鼠和瘦鼠的腸道微生物到無菌小鼠腸道中發(fā)現(xiàn)，移植肥胖小鼠腸道微生物的無菌小鼠會得肥胖癥，而對照組無菌小鼠正常［3－4］。這些結(jié)果說明腸道微生物能調(diào)節(jié)宿主代謝和炎癥反應(yīng)，腸道微生物與宿主營養(yǎng)和免疫關(guān)系的研究在世界范圍內(nèi)越來越受到矚目。高脂飼糧會引起宿主機體的異常代謝，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，與腸道微生物群落功能改變密切相關(guān)，因為微生物在動物腸道中保持一種平衡，當腸道微生物在宿主體內(nèi)的平衡被打破，發(fā)生紊亂時，會對動物的生長和健康產(chǎn)生影響［5］，了解微生物群落功能的前提是掌握其結(jié)構(gòu)和組成。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷更新，NGS的高通量數(shù)據(jù)、高檢測深度和高準確率等優(yōu)點可以解決以往研究微生物試驗方法的不足，如變性梯度凝膠電泳（DGGE）分辨率低，且不能反映微生物的豐度情況；生物芯片只能檢測到已知微生物，沒有辦法探測出未知微生物的情況。使用NGS使研究者能夠準確檢測到腸道微生物的豐度和組成、不同個體腸道微生物的共同及其獨有特征，腸道微生物組成對腸道群落功能的預(yù)測等［6］。目前關(guān)于腸道微生物與宿主代謝關(guān)系研究主要使用小鼠模型，本研究使用日本鵪鶉（Cotur?nix japonica）作為動物模型，通過飼喂高脂飼糧和對照飼糧，研究其對宿主盲腸微生物群落結(jié)構(gòu)、組成及其脂肪代謝的影響，為探索腸道群落在宿主能量和脂肪代謝方面所起的作用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1．1 試驗設(shè)計及樣品采集

選擇1日齡日本鵪鶉160只，1～6周齡飼喂半合成飼糧，6周齡時，所有鵪鶉隨機分成2個組，每個組8個重復(fù)，分別飼喂半合成飼糧（對照飼糧）和添加膽固醇的半合成飼糧（高脂飼糧），繼續(xù)飼喂6周。半合成試驗飼糧配制根據(jù)NRC（1994）鵪鶉營養(yǎng)需要標準。試驗期間動物在同一標準下養(yǎng)殖，自由采食和飲水。試驗期結(jié)束時，每個重復(fù)隨機挑選1只接近平均體重的鵪鶉進行屠宰，收集血液分離得到血漿，用鑷子和剪刀快速采集盲腸及內(nèi)容物放到離心管中，干冰速凍，－20℃保存。所有試驗用具都經(jīng)過高壓滅菌處理，試驗臺用75%酒精擦拭。

表1　試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 1　Composition and nutrient levels of experimental diets（air?dry basis）　%

續(xù)表1

1．2 測定指標與方法

1．2．1 血漿脂肪代謝指標測定

血漿脂肪代謝指標有總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、甘油三酯（TGs）。TC、HDL和TGs含量采用酶法測定使用ADVIA 1650化學(xué)分析儀，HDL含量采用直接測定法［7－9］。LDL含量使用Friedewald公式［10－11］，利用TC、HDL和TGs含量的測定值計算得出。1．2．2 盲腸食糜總DNA的提取及焦磷酸測序

將盲腸內(nèi)容物輕輕擠到離心管，食糜總DNA的提取按照PowerMax Soil DNA Isolation（Mo．Bio laboratories．Inc．，Carlsbad，CA）試劑盒中的說明進行。PCR擴增采用FastStart High Fidelity體系（Roche Molecular Diagnostics，Branchburg，NJ，USA），341F（5’－ACTCCTACGG GAGGCAGCAG－3’）和926R（5’－CCGTCAATTCMTTTGAGTTT－3’）引物擴增微生物16s DNA V3～V5區(qū)。引物341F和926R分別添加適配序列（adaptor A，B），同時926R引物添加上不同的識別序列（a multi?plex identifier sequences，MID）。使用454 GS Jun?ior平臺（454 Life Sciences?a Roche Company，Branford，CT，USA）對PCR產(chǎn)物進行測序。

1．3 數(shù)據(jù)分析

1．3．1 生物信息分析流程

QIIME（quantitative insights into microbial ecol?ogy）軟件包對測序結(jié)果進行修剪降噪（拼接和去除引物）、篩選（質(zhì)量控制）、匹配和分析［12］。滿足如下條件的數(shù)據(jù)序列被剔除：數(shù)據(jù)平均質(zhì)量得分≤25；序列長度＜150 bp或者＞900 bp；沒有引物的序列、錯誤及包含模糊不清的序列；同聚體超過8 nt。數(shù)據(jù)去噪使用安裝在QIIME的DENOISING v．0．9．1［13］軟件。嵌合體序列剔除使用Chimera Slayer。數(shù)據(jù)根據(jù)各自的識別序列進行分組。UCLUST（http：／／www．drive5．com／usearch／）將含有超過97%的相同序列被分到同一個操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）。代表序列（representative sequences）是OTUs中最豐富的序列。使用Ribosomal Database Project（RDP）分類軟件2．0．1［14］對代表序列（97%的相似）進行匹配分類。使用PyNAST對OTUs進行校準，要求最低校準長度是150 bp，序列75%以上相似［15］。然后使用PHLANE mask（http：／／greengenes．lbl．gov／）去除變異區(qū)段。

1．3．2 統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 13．0對血漿中脂肪代謝指標及微生物的門、科和屬的豐富度進行單因素方差分析（one?way ANOVA），數(shù)據(jù)用平均值±標準誤表示，置信區(qū)間是95%。PC?ORD用于主成分分析（principal component analysis，PCA）分析盲腸微生物群落β多樣性和PERMANOVA分析［16－17］。熱圖（heatmap）分析微生物的豐度與血漿中脂肪代謝指標的相關(guān)性。

2　結(jié) 果

2．1 鵪鶉血漿中脂肪代謝指標

由表1所示，鵪鶉血漿指標中TC、LDL含量和LDL／HDL在高脂飼糧組顯著提高（P＜0．05），HDL和TGs含量在2組間沒有顯著差異（P＞0．05）。

表2　鵪鶉血漿中脂肪代謝指標Table 2　The lipid plasma metabolism indices of Cotur nix japonica

2．2 盲腸微生物群落結(jié)構(gòu)的比較

測序結(jié)果經(jīng)過去噪過濾和質(zhì)量控制后總共得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)257 860條，平均讀長為545 bp，平均每個樣品有（16 116±4 269）個序列。所有序列被歸類到366種微生物（OTUs），平均每個樣品有OTUs（123．00±24．75）個／組。方差分析結(jié)果（表3）顯示高脂飼糧組和對照飼糧組之間序列數(shù)量沒有顯著差異（P＞0．05），但是高脂飼糧組盲腸微生物OTUs顯著減少（P＜0．05）。

表3　測序數(shù)量及OTUs分析Table 3　Analysis of Sequencing quantities and OTUs

由圖1可見，使用全部OTUs對微生物群落的β多樣性進行PCA分析顯示，高脂飼糧組與對照飼糧組被明顯分成2組，這個結(jié)果說明2組的盲腸微生物群落結(jié)構(gòu)和組成不同，PERMANOVA分析表明高脂飼糧組顯著影響鵪鶉盲腸微生物群落的結(jié)構(gòu)和組成（P＜0．05）。

2．3 盲腸微生物群落在門、科和屬分類水平的比較

為了尋找2組間微生物群落結(jié)構(gòu)和組成的不同，我們對微生物不同分類單位進行比較研究。由圖2可見，對序列數(shù)據(jù)進行匹配歸類顯示366個OTUs歸屬于6大門，序列主要分布于Firmicutes （77%）和Bacteroidetes（21%），其他序列屬于如Spirochaetes、Tenericutes、Proteobacteria和Acti?nobacteria，總共占序列的2%。方差分析結(jié)果顯示，序列分布在6個門的水平，高脂飼糧組和對照飼糧組之間沒有顯著差異（P＞0．05）。微生物分類單位越大高脂飼糧的影響越深。在科的水平，高脂飼糧顯著降低Lactobacillales、Streptococcaceae 和Clostridiales；其他（others）的序列數(shù)（P＜0．05），顯著提高Erysipelotrichales、Erysipelotrichaceae的序列數(shù)（P＜0．05）（表4）。如圖3所示，在科的水平，雖然統(tǒng)計分析差異不限制，高脂飼糧組的鵪鶉盲腸微生物還主要包括Clostridiaceae科，而對照組鵪鶉盲腸微生物還主要有Lactobacillaceae科。進一步分析發(fā)現(xiàn)在微生物屬水平，高脂飼糧顯著降低Ruminococcaceae、Ruminococcus的豐度（P＜0．05），但是顯著提高了Erysipelotrichaceae、cc＿115和Erysipelotrichaceae、Eubacterium的豐度（P＜0．05）（表5）。

2．4 盲腸微生物豐度與血漿脂肪代謝指標的相關(guān)性

盲腸微生物豐度與血漿脂肪代謝指標的相關(guān)性分析如圖5所示，cc＿115（Erysipelotrichaceae）和未被分類的微生物屬于Lachnospiraceae科的豐度與TC、LDL含量和LDL／HDL呈顯著正相關(guān)（P＜0．05），除此之外Eubacterium（Erysipelotrichace?ae）只與LDL／HDL呈顯著正相關(guān)（P＜0．05）。Ru?minococcus（Ruminococcaceae）的豐度與TC、LDL含量和LDL／HDL呈顯著負相關(guān)（P＜0．05）。Ru?minococcus（Lachnospiraceae）的豐度與HDL含量呈顯著正相關(guān)（P＜0．05）。

3　討 論

對微生物進行分類發(fā)現(xiàn)，日本鵪鶉盲腸微生物的組成在不同的分類單元與人類、小鼠、倉鼠、雞和美洲鵪鶉體內(nèi)的微生物相似［18－22］。在微生物門的水平，Bacteroidetes和Firmicutes是日本鵪鶉盲腸微生物的主要組成，超過98%的序列都屬于這兩大門類。在科的水平，主要包括Rikenellace?ae、Lactobacillaceae、Streptococcaceae、Lachnospir?aceae、Coprobacillaceae和Erysipelotrichaceae，在屬的水平，微生物主要包括Ruminococcus、Blautia、Coprococcus和Eubacterium。

圖1　盲腸微生物群落主成分分析三維圖Fig．1　Three?dimensional projection of PCA of cecal microbial community

圖2　盲腸微生物在門水平分布Fig．2　The pie chart of cecal microbial abundance on phyla level

研究報道降低腸道微生物的多樣性會對宿主免疫產(chǎn)生影響，進而影響健康，產(chǎn)生代謝疾?。?3－24］。本研究飼喂高脂飼糧后，測序數(shù)據(jù)量2組之間沒有差異，但是鵪鶉盲腸OTUs顯著降低，說明盲腸微生物的種類多樣性顯著減少。PCA分析顯示高膽固醇飼糧組與對照組盲腸微生物群落結(jié)構(gòu)和組成不同，高膽固醇飼糧顯著影響了各個分類單元微生物的豐富度，改變了盲腸微生物群落結(jié)構(gòu)和組成。研究發(fā)現(xiàn)飼喂老鼠高脂飼糧增加了Bacteroidetes豐度和減少了Firmicutes豐度，其他研究也有類似發(fā)現(xiàn)［25－26］。我們發(fā)現(xiàn)飼喂鵪鶉高脂飼糧，盲腸微生物Bacteroidetes有增加趨勢和Firmicutes存在減少趨勢，但是沒有生物統(tǒng)計上的差異，導(dǎo)致這樣的結(jié)果可能是每個組有8個樣品，樣品量不夠達到顯著性，所以今后的研究中需要增加采樣量驗證。進一步分析發(fā)現(xiàn)高脂飼糧影響微生物大的分類單位。在科的水平，高脂飼糧顯著降低Firmicutes門中Lactobacillales、Streptococ?caceae和Clostridiales、others的豐度，但是顯著提高Erysipelotrichales、Erysipelotrichaceae的豐度。顯著增加的微生物引起我們的注意，研究表明人和動物腸道中Erysipelotrichaceae科微生物能產(chǎn)生短鏈脂肪酸（SCFAs）［27］，主要包括乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽［28］。大部分SCFAs是能量來源，能為人體提供10%的日常能量［29］，為豬供應(yīng)30%的能量［30］，70%的乙酸鹽被肝臟利用［31］。所以對于顯著增加的Erysipelotrichaceae科微生物，我們推測該科微生物與動物體能量代謝相關(guān)，進一步研究發(fā)現(xiàn)Erysipelotrichaceae科中的cc＿115和Eubacte?rium屬豐度顯著增加。通過微生物豐度與血漿脂肪代謝指標的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，Erysipelotrichaceae科中cc＿115屬微生物豐度與TC、LDL含量和LDL／HDL呈顯著正相關(guān)。在本次研究還發(fā)現(xiàn)，雖然在統(tǒng)計分析中不顯著，但是高脂飼糧減少Lacto?bacillaceae科的豐富度，前人研究表明高脂飼糧顯著減少該科微生物，與引起宿主的低炎癥反應(yīng)，增加血漿中內(nèi)毒素相關(guān)［32－34］，飼喂高脂飼糧的鵪鶉機體是否存在低炎癥，需要進一步的試驗驗證。腸道微生物的活動作為一個整體，受到干擾或者病態(tài)的群落結(jié)構(gòu)和組成會使某些微生物過度生長或者減少，所以打破平衡的微生物群落會對宿主健康產(chǎn)生一定影響。

圖3　盲腸微生物在科水平分布Fig．3　The histogram of cecal microbial abundance on family level

表4　盲腸微生物在科水平顯著性分析Table 4　Family level significance analysis of cecal microbial　　條／組

表5　盲腸微生物在屬水平顯著性分析Table 5　Genus level significance analysis of cecal microbial　　條／組

圖4　盲腸微生物在屬水平豐富度與脂肪代謝指標相關(guān)性分析熱圖Fig．4　Correlations heat map demonstrating the association between the abundances of different cecal microbial genera and plasma lipid parameters

本試驗中，高脂飼糧組鵪鶉血漿中TC、LDL含量和LDL／HDL顯著高于對照組，而且盲腸中一些微生物的豐度與脂肪代謝存在相關(guān)性。cc＿115 （Erysipelotrichaceae）和未被分類的微生物屬于Lachnospiraceae科與TC、LDL含量和LDL／HDL呈顯著正相關(guān)，有報道指出人的糞便中屬于Erys?ipelotrichaceae和Lachnospiraceae科的微生物豐度與這3個脂肪代謝指標存在顯著正相關(guān)［18］。除此之外，鵪鶉研究還發(fā)現(xiàn)Eubacterium（Erysipe?lotrichaceae）只與LDL／HDL呈顯著正相關(guān)。Ru?minococcus（Ruminococcaceae）的豐度與TC、LDL含量和LDL／HDL呈顯著負相關(guān)。Ruminococcus （Lachnospiraceae）的豐度與HDL含量呈顯著正相關(guān)。這個信息為今后進一步研究具體細菌株與能量代謝的相關(guān)性提供了信息。

4　結(jié) 論

使用焦磷酸測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了高脂飼糧能顯著顯著降低日本鵪鶉盲腸微生物的多樣性，F(xiàn)irmi?cutes門中Lactobacillales；Streptococcaceae和Clos?tridiales；others的豐度，但是顯著提高Erysipe?lotrichales；Erysipelotrichaceae的豐度，且Erysipe?lotrichaceae科中cc＿115屬微生物豐度與能量代謝有相關(guān)性。

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（責(zé)任編輯 武海龍）

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Effects of High Lipid Diet on Cecal Microbial Community Structure of Japanese Quail（Cotur nix japonica）

LIU Shasha1，2ZHANG Hongfu1?ZHEMG Mingde3JI Cheng2
（1．State Key Laboratory of Animal Nutrition，Institute of Animal Sciences，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China；2．College of Animal Science，Chinese Agruculture University，Beijing 100193，China；3．Avian Research Centre，F(xiàn)aculty of Land and Food Systems，The University of British Columbia，Vancouver V6T1Z4，Canada）

?Corresponding author，professor，E?mail：zhanghf656＠vip．sina．com

Abstract：The object of this study was to investigate the effects of high lipid diet on cecal microbial community structure and composition and its lipid metabolism of Japanese quail（Cotur nix japonica）．A total of 160 one?day?old Japanese quail fed a semi?synthetic diet for the first 6 weeks．At 6 weeks of age，the birds were ran?domly divided into 2 groups with 8 replicates per group and 10 birds per replicate，fed either a regular synthetic diet or a synthetic diet with added cholesterol for another 6 weeks．After the feeding trial，8 birds from each group were euthanized and collected blood for testing the lipid metabolism indices，cecal contents for investiga?ting the microbial community by using pyrosequencing．The results showed as follows：1）The content of total cholesterol（TC），low density lipoprotein（LDL）and LDL／high density lipoprotein（HDL）of Japanese quail were significantly increased in high lipid diet group（P＜0．05）．2）High lipid diet significantly decreased cecal microbial diversity（P＜0．05）；in high lipid diet group，the abundance of family Lactobacillales，Streptococ?caceae and Clostridiales，others was significantly decreased（P＜0．05），while the abundance of family Erysip?elotrichales，Erysipelotrichaceae was significantly increased（P＜0．05）．3）The abundance of cc＿115（Erysip?elotrichaceae）and unclassified bacteria belong to Lachnospiraceae were positively correlated with contents of TC，LDL and LDL／HDL（P＜0．05），besides Eubacterium（Erysipelotrichaceae）was only positively correla?ted with LDL／HDL（P＜0．05），while the abundance of Ruminococcus（Ruminococcaceae）was negatively correlated with contents of TC，LDL and LDL／HDL（P＜0．05），and the abundance of Ruminococcus（Lach?nospiraceae）was positively correlated with contents of HDL（P＜0．05）．In conclusion，high lipid diet highly affects the cecal microbial community structure and composition and its lipid metabolism of Japanese quail．［Chinese Journal of Animal Nutrition，2015，27（8）：2368?2377］

Key words：high lipid diet；cecal microbial community；lipid metabolism

作者簡介：劉莎莎（1985—），女，河南安陽人，博士研究生，動物營養(yǎng)與飼料專業(yè)。E?mail：King123apple＠126．com

收稿日期：2015－02－16

doi：10．3969／j．issn．1006?267x．2015．08．008

文章編號：1006?267X（2015）08?2368?10

文獻標識碼：A

中圖分類號：S816

通信作者：?張宏福，研究員，博士生導(dǎo)師，E?mail：zhanghf656＠vip．sina．com