高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜鑒定甘薯葉中的主要化學(xué)組成

涂宗財(cái) 溫慶輝 王 輝 張 露 傅志豐

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜鑒定甘薯葉中的主要化學(xué)組成

涂宗財(cái)1，2溫慶輝1王 輝1張 露1傅志豐1

（南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1，南昌 330047）
（江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2，南昌 330022）

以2種肉色型甘薯葉—橘心甘薯葉（OFL）和白心甘薯葉（CFL）為原料，旨在采用高效液相色譜－電噴霧離子源－四級桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC－ESI－QTOF－MS／MS）比較2種甘薯葉DHPM提取物中的主要化合組成的差異。根據(jù)化合物的前體離子、MS／MS裂解規(guī)律、紫外圖譜、保留時(shí)間，并與相關(guān)數(shù)據(jù)庫和參考文獻(xiàn)對照，對2種甘薯葉提取物中的主要化合物進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，OFL是比CFL更好的抗氧化劑資源。從OFL和CFL中共鑒定出22種化合物，包括8種有機(jī)酸、3種氨基酸、4種羥基肉桂酸衍生物、3種黃酮和4種脂肪酸。因此，HPLC－ESI－QTOF－MS／MS是快速分析復(fù)雜植物提取物中化學(xué)組成的有效方法。

甘薯葉 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜 多酚 電噴霧離子

甘薯是我國的主要糧食之一，其產(chǎn)量和種植面積均居世界之首。甘薯葉是甘薯生產(chǎn)的主要副產(chǎn)物，其中含有豐富的酚酸、黃酮、花青素、膳食纖維和蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分［1］。甘薯葉中多酚含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于甘薯的皮、根、肉以及其他常見食用蔬菜［2－3］。然而，除少數(shù)作為飼料和蔬菜外，大部分甘薯葉被丟棄，造成了生物活性資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。藥理學(xué)研究表明，甘薯葉具有促進(jìn)胃腸消化、抗氧化、降血糖、降血壓、免疫調(diào)節(jié)、抗癌和預(yù)防糖尿病等功效［1－3］。但目前大多數(shù)文獻(xiàn)均是報(bào)道甘薯葉中活性成分的提取及提取物的生物活性，對其活性成分的分析較少，其中Carvalho等［4］采用HPLC技術(shù)對不同甘薯葉中的6種酚酸、3種黃酮和2種兒茶素進(jìn)行了定量分析，Luo等［5］采用HPLC －ESI－MS／MS技術(shù)從甘薯葉中鑒定出黃酮和酚酸共24種，Islam等［6］采用HPLC技術(shù)從甘薯葉中分析出15種花青素。

高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC－MSn）結(jié)合了液相色譜高效分離和質(zhì)譜高靈敏度、高特異性的優(yōu)點(diǎn)，對復(fù)雜樣品中植物化學(xué)組成的分析具有很高的靈敏性和選擇性，只需對樣品進(jìn)行簡單的預(yù)處理，即可在短時(shí)間內(nèi)對提取物中的化學(xué)圖譜進(jìn)行初步鑒定。目前，HPLC－MSn已成為分析天然產(chǎn)物中化學(xué)成分強(qiáng)有力的工具［7］。Abu － Reidah 等［8］采用HPLC－DAD－ESI－MS／MS技術(shù)從漆樹果中初步鑒定出211種化合物；同時(shí)采用反相超高效液相色譜電噴霧離子源飛行時(shí)間質(zhì)譜（UHPLC－ESI－QTOF－MS）比較了3個(gè)苼菜品種中植物化學(xué)成分的差異，并從提取物中快速鑒定出了171種化合物［9］。Liu等［10］利用HPLC － ESI－ MS／MS 技術(shù)從“Mikael”、“Mortti”和“Jaloste n：o 15”3 個(gè)黑醋粟的70%丙酮提取物中分別快速鑒定出43、35和35種酚類化合物。Huang等［11］研究表明，與常規(guī)熱水浸提相比，動(dòng)態(tài)高壓微射流輔助提取能顯著提高黃酮類化合物的得率和抗氧化活性，但提取物中的主要抗氧化成分有待研究。因此，本研究以江西栽培最廣的2種肉色類型甘薯葉為原料，即橘心甘薯葉（orange－flesh sweetpotato leaves，OFL）和白心甘薯葉（cream－flesh sweetpotato leaves，CFL），采用高效液相色譜－電噴霧離子源－飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（HPLC－ESIQTOF－MS／MS）比較2個(gè)甘薯葉品種的DHPM提取物中的主要化學(xué)組成差異，即可探明甘薯葉DHPM提取物中的主要化學(xué)組成，又可為快速鑒定植物提取物中的化學(xué)成分提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘薯葉于2013年11月從南昌市郊區(qū)采集。乙腈、甲酸（色譜純）：德國Merck公司；無水乙醇、乙酸、石油醚（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；超純水用Millipore超純水凈化系統(tǒng)制備。

1.2 儀器與設(shè)備

1290 HPLC／6538 QTOF － MS／MS、色譜柱：ZORBAX XDB －C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）：美國Agilent公司；TDL－5－A離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；GYB60－6S均質(zhì)機(jī)：上海東華高壓均質(zhì)機(jī)廠；UV－Vis分光光度計(jì)：上海普析通用；M－110EH微射流：美國Microfludics公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

參照Huang等［11］的方法提取甘薯葉多酚，準(zhǔn)確稱取5.0 g甘薯葉粉末于200 mL 70%乙醇中混勻，35 MPa均質(zhì)處理2次后，DHPM 100 MPa處理2次，然后45 ℃浸提2.0 h，4 000 r／min 離心15 min，最后收集上清液，并濃縮定容至100 mL。樣品過0.22μm微孔有機(jī)濾膜后，HPLC－QTOF－MS／MS上樣分析。

1.3.2 色譜條件

采用Agilent Technologies 1290 HPLC infinity system進(jìn)行分析；色譜柱：Zorbax Eclipse XDB C18柱（250

mm ×4.6 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；流動(dòng)相：0.1%甲酸水（A）和乙腈（B）；洗脫條件：0 ～5 min，10%～35%B；5～20 min，35%～80%B；20 ～23 min，80%～100%B；流速：0.8 mL／min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測器：二極管陣列檢測器（DAD）；掃描波長：200～400 nm。

1.3.3 質(zhì)譜條件

采用Agilent Technologies 6538 OHD Accurate－Mass Q－TOF分析；電離方式：電噴霧離子源（electronspray ionization，ESI）；噴霧電壓：4 000 kV；霧化氣體：N2；霧化壓力：50 psi；霧化氣流速：10 L／min；碰撞氣體：He；碰撞電壓：250V；干燥溫度：350 ℃；掃描方式：負(fù)離子；離子范圍：m／z 100 ～1 000；采用MassHunter工作站對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC－ESI－QTOF－MS／MS分析

OFL和CFL提取物的基峰色譜圖（Base peak chromatography，BPC）如圖1所示，甘薯葉中主要成分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)及化合物的相應(yīng)峰面積如表1所示，通過分析每個(gè)峰的保留時(shí)間、紫外特征吸收λmax、母離子、裂解規(guī)律、分子量和分子式等信息，并與可利用的相關(guān)文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫（Metlin和Massbank）對照，共鑒定或初步鑒定出22種化合物，包括8種有機(jī)酸、

3種氨基酸、4種羥基肉桂酸、3種黃酮和4種脂肪酸。由于BPC圖的峰越高、峰面積越大，表明對應(yīng)化合物的含量越高，而OFL中化合物的響應(yīng)值比CFL高，因此OFL中的活性成分含量比CFL高，結(jié)合表1可知OFL是更好的抗氧化劑資源。

圖1 OFL和CFL提取物的基峰色譜圖

2.2 有機(jī)酸

化合物1、2、3和9的母離子［M －H］－分別為m／z191.067 2 （C7H11O6）、133.023 9 （C4H5O5）、191.030 8 （C6H7O7）和175.062 4（C7H11O5）。它們對應(yīng)的MS／MS特征碎片離子分別為m／z 127.042 9［M－HCOOH－H2O －H］－、115.006 4［M －H2O －H］－、111.011 2［M －CO2－2H2O －H］－和115.042 2［M －CH3COOH －H］－。根據(jù)Abu－Reidah 等［9］和Cádiz－Gurrea等［12］的報(bào)道，化合物1、2、3 和9 分別鑒定為奎寧酸、蘋果酸、檸檬酸、異丙基蘋果酸?；衔?的母離子［M－H］－為m／z 117.020 2（C4H5O4），MS／MS碎片99.009 3 和73.031 6 分別為母離子失去一個(gè)H2O和一個(gè)CO2所得，因此鑒定為琥珀酸，這與Abu－Reidah等［9］報(bào)道的琥珀酸裂解規(guī)律一致。

化合物10的前體離子［M－H］－為m／z 305.072 7（C11H13O10），MS／MS 特征離子為173.051 4 ［烏頭酸－H］－和130.970 5［戊糖－H］－，證明分子中存在烏頭酸和戊糖，由此推斷化合物10為烏頭酸戊糖苷?；衔?1（［M －H］－，137.025 4）的主要MS／MS 碎片離子m／z119.016 1、109.033 8、93.038 2 分別為母離子失去一個(gè)H2O、CO和CO2所產(chǎn)生，證明化學(xué)中存在羥基和羧基，因此鑒定為對羥基苯甲酸，這與Regos等［13］的報(bào)道一致。由于化合物16和壬二酸有相同的母離子［M－H］－187.107 9和MS／MS特征碎片離子169.092 4［M－H2O－H］－，125.100 4［M－H2O－CO2－H］－，97.069 9［M －H2O －CO2－CO －H］－，因此鑒定為壬二酸［14］。

表1 橘心甘薯葉和白心甘薯葉提取物HLPC－ESI－QTOF－MS2分析生物活性特征

2.3 氨基酸類化合物

化合物5的母離子［M－H］－為m／z 164.072 7，碎片離子m／z 147.049 0和103.057 3為母離子接連失去NH3和CO2部分所產(chǎn)生，78.037 4對應(yīng)于化合物的苯環(huán)部分；化合物7的母離子［M－H］－為m／z 203.084 1，碎片離子m／z 186.062 4、159.099 1、142.07、116.054 2 分別是母離子失去NH3、CO2、NH3＋CO2和CH2CH（NH2）COOH 部分產(chǎn)生，因此，化合物5鑒定為苯丙氨酸，化合物7鑒定為色氨酸［9］。

化合物22的母離子［M－H］－為m／z421.2030，主要的MS／MS 特征離子m／z 259.128 7、241.111 0、218.072 2、130.082 6、128.030 9 對應(yīng)的碎片分別為［M －162－H］－，［M －162－H2O －H］－，［亮／異亮氨酸－H］－和［葡萄糖－H2O－H］－，根據(jù)參考文獻(xiàn)［9］，化合物22初步鑒定為谷氨酸－亮氨酸／異亮氨酸－葡萄糖。

2.4 羥基肉桂酸類化合物

化合物6和8具有相同的母離子［M－H］－m／z 353.10（C16H18O9），其紫外最大特征吸收為226和326 nm，且在298 nm有1個(gè)肩峰，從而判定為咖啡酰奎寧酸（Caffeoylquinic acid，CQA）同分異構(gòu)體。碎片離子m／z 191.07、173.05、179.04 和161.03 分別與［奎寧酸－H］－、［奎寧酸－H2O －H］－、［咖啡酸－H］－、［咖啡酸－H2O－H］－相對應(yīng)。由于化合物6和8的基峰分別為179.042 3和191.062 6（MS／MS圖如圖2a和圖2b所示），根據(jù)Lin等［15］的研究，化合物6和8分別鑒定為3－CQA和5－CQA。

圖2 3－咖啡?？鼘幩岷?－咖啡酰奎寧酸的MS／MS圖譜和結(jié)構(gòu)式

化合物14和15的母離子［M－H］－均為m／z 515.138，其MS／MS特征離子m／z353.09 ［咖啡?？鼘幩幔璈］－、191.06、179.03、173.05 表明它們?yōu)槎Х弱？鼘幩犷惢衔铮―icaffeoylquinic acids，DiCQAs），通過與標(biāo)準(zhǔn)品的比對，化合物14和15分別鑒定為3，4 － diCQA 和3，5 － diCQA。Islam 等［16］在甘薯葉中曾鑒定出此類化合物。

2.5 黃酮類化合物

化合物12的母離子［M－H］－為m／z 449.211 7（C21H21O11）。MS／MS 碎片離子m／z 269.147 3、225.157 0和209.123 6對應(yīng)的片段分別為［MC6H10O5－H2O－H］－、［M －C6H10O5－CO2－H］－和［M－C6H10O5－C3H8O－H］－，因此化合物12鑒定為二氫山奈酚葡萄糖苷［13］?；衔?3的母離子［M－H］－為m／z 463.105 0，其MS／MS 碎片離子m／z 301.043 3、271.031 5、179.002 7、163.011 4 對應(yīng)的片段分別為［槲皮苷－H］－、［槲皮苷－CH2OH］－、［葡萄糖－H］－、［葡萄糖－H2O －H］－，因此該化合物被鑒定為異槲皮苷［13］?；衔?8的母離子［M－H］－和苷元離子分別為m／z 409.027 1（C17H14SO10）和329.071 9（C17H14O7），表明苷元離子是由母離子失去一個(gè)SO3所產(chǎn)生。碎片離子m／z 314.046 1、299.023 9、271.024 1、269.046 9 分別是苷元失去CH3、2CH3、2CH3＋ H2O、2CH3＋ CH2O 部分所產(chǎn)生的，通過與Metlin中的數(shù)據(jù)比對，初步鑒定苷元離子m／z329.071 9（C17H14O7）為商陸黃素或者麥黃酮，因此化合物18初步鑒定為硫酸化商陸黃素或者硫酸化麥黃酮。

2.6 脂肪酸

化合物17的母離子［M－H］－為m／z 327.220 3，碎片離子m／z309.207 5、291.201 8分別為母離子失去1個(gè)和2個(gè)水分子所產(chǎn)生，m／z 229.141 5、211.136 6依次是C12－C13鍵裂解和碎片再脫去1個(gè)水分子所產(chǎn)生，因此，化合物17鑒定為9，12，13－三羥基十八碳二烯酸［17］，其裂解規(guī)律如圖3a所示。化合物20和21的母離子［M －H］－均為m／z 293.212 2（C18H30O3），MS／MS離子m／z275.2054和235.1714分別為母離子失去1個(gè)H2O和C14－C15鍵斷裂形成。化合物20的碎片離子m／z 121.103 5來源于C10－C11鍵的斷裂和脫甲酸（HCOOH）作用?；衔?1的碎片離子m／z195.138 9來源于C11－C12鍵斷裂。根據(jù)化合物17的裂解規(guī)律，化合物20和21分別鑒定為13－羥基－6，9，11－十八碳三烯酸和13－酮－9，11－十八碳二烯酸。同理，化合物24（［M －H］－，559.331 2）初步鑒定為十八碳三烯酸衍生物，主要的MS／MS離子277.217 7對應(yīng)化合物十八碳三烯酸（C18H30O2）。

圖3 脂肪酸的裂解途徑和MS／MS圖譜

3 結(jié)論

采用HPLC－QTOF－MS／MS技術(shù)比較了OFL和CFL中的主要化學(xué)成分。OFL和CFL的植物化學(xué)組成相差不大，但化合物的組成比例相差很大，OFL的BPC圖響應(yīng)高度及化合物峰面積明顯高于CFL，以上證明OFL中多酚類化合物的含量明顯高于CFL，是優(yōu)于CFL的膳食多酚資源。通過對主要色譜峰的MS、MS／MS圖譜和紫外光譜進(jìn)行分析，初步鑒定出22種化合物。2種甘薯葉的主要化合物均為奎寧酸、蘋果酸、檸檬酸、苯丙氨酸、5－CQA、烏頭酸戊糖苷、對羥基苯甲酸、異槲皮苷、3，4－diCQA、3，5－diCQA、9，12，13－三羥基十八碳二烯酸、硫酸化商陸素／麥黃酮、13－羥基－6，9，11－十八碳三烯酸。琥珀酸、二氫山奈酚葡萄糖苷和13－酮－9，11－十八碳二烯酸只在OFL中檢測到，而谷氨酸－亮氨酸／異亮氨酸－葡萄糖和十八碳三烯酸只在CFL中檢測到。其中蘋果酸、異丙基蘋果酸、烏頭酸戊糖苷、對羥基苯甲酸、二氫山奈酚葡萄糖苷、壬二酸和脂肪酸類化合物都是第1次被在甘薯葉中鑒定。因此，在缺乏標(biāo)準(zhǔn)品的條件下，HPLC－QTOFMS／MS技術(shù)是分析天然產(chǎn)物復(fù)雜體系中活性成分組成的有效工具，同時(shí)本研究可為HPLC－MS／MS技術(shù)在植物組學(xué)中的應(yīng)用提供參考。

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Identification of Major Chemical Constituents in Sweetpotato Leaves by High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

Tu Zongcai1，2Wen Qinghui1Wang Hui1Zhang Lu1Fu Zhifeng1
（State key laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University1，Nanchang 330047）
（College of Life Science，Jiangxi Normal University2，Nanchang 330022）

Taking two flesh color─orange－flesh and cream －flesh sweetpotato leaves（OFL and CFL）as materials，this study aimed to compare the chemical constituents in DHPM extractions from OFL and CFL by using high performance liquid chromatography diode array detection and quadrupole time of flight electrospray ionization tandem mass spectrometry （HPLC －ESI－QTOF －MS／MS）.The major chemical compounds of extractions from the two leaves were identified by comparing the precursor ion，MS／MSfragmentation pattern，ultraviolet spectra and retention time with relevant databases and references.The results showed that OFL is a better antioxidants resource than CFL.Totally，22 compounds were proposed in OFL and CFL extracts，including 8 organic acids，3 amino acids，4 hydroxycinnamic acid derivates，3 flavonoids and 4 fatty acids.Thus，HPLC －ESI－QTOF －MS／MScan be a useful，powerful and rapid tool in quickly analyzing the chemical constituents in complex plant extracts.

sweetpotato leaves，HPLC － MS／MS，polyphenols，ESI

S531

A

1003－0174（2016）07－0142－06

國家自然科學(xué)基金（21276118），江西省重大科技創(chuàng)新研究（20124ACB00600）

2014－11－28

涂宗財(cái)，男，1965年出生，教授，博士生導(dǎo)師，食物資源開發(fā)與高效利用