中藥通過調(diào)節(jié)鐵死亡作用治療潰瘍性結(jié)腸炎的用藥規(guī)律研究

吳 娜，饒 穎，周佳林，李 重，黃雪云，謝昌營，賀柯慶*

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006； 2.江西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江西 南昌 330006）

潰瘍性結(jié)腸炎是一種病因尚不明確的結(jié)腸和直腸慢性非特異性炎癥性疾病，臨床常表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液膿血便，具有病程長、易復(fù)發(fā)、難治愈等特點(diǎn)，現(xiàn)已被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代社會最難治療的疾病之一，目前其發(fā)病率在我國呈持續(xù)上升趨勢［1-2］。正常的腸上皮細(xì)胞（IECs）死亡可維持其功能，保持其持續(xù)更新能力，維護(hù)組織穩(wěn)態(tài)，而其脫離穩(wěn)態(tài)后會導(dǎo)致腸通透性增加、腸屏障功能障礙，是導(dǎo)致潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素［3］。鐵死亡是近年提出的一種新型細(xì)胞程序性死亡方式，主要依賴于細(xì)胞內(nèi)鐵和脂質(zhì)活性氧積累所引起的細(xì)胞死亡，目前被認(rèn)為是導(dǎo)致IECs 死亡的重要原因［4］。近期多項(xiàng)研究表明，鐵死亡參與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展。

中藥治療潰瘍性結(jié)腸炎由來已久，療效確切，副作用較少，但其具體作用機(jī)制尚不明確。近年來，生物信息學(xué)在疾病診斷、靶向新藥研發(fā)等臨床研究中廣泛運(yùn)用，本研究通過生物信息學(xué)尋找出治療潰瘍性結(jié)腸炎的中藥中作用機(jī)制與鐵死亡相關(guān)的中藥，再采用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)分析其配伍規(guī)律、核心藥物組合，以期為相關(guān)中醫(yī)治療及機(jī)制探索提供參考。

1 資料與方法

1.1 潰瘍性結(jié)腸炎中與鐵死亡相關(guān)基因檢索 FerrDb（http： / /www.zhounan.org/ferrdb/index.html） 是從PubMed數(shù)據(jù)庫中下載關(guān)于鐵死亡的文章，從中提取出與鐵死亡調(diào)控因子、標(biāo)志物及相關(guān)疾病的數(shù)據(jù)庫，于2021 年12 月下載鐵死亡的標(biāo)志物（marker）、抑制因子（suppressor）、驅(qū)動因子（driver） 3 個(gè)文件，并將相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行合并，刪除重復(fù)項(xiàng)，最終獲得相關(guān)基因（數(shù)據(jù)集1）。DisGeNET （v 7.0）［5］（http： / /www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu）包含了17 074 個(gè)基因、20 370 種疾病、561 119 個(gè)基因-疾病相關(guān)，從中獲得與潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)的疾病基因（數(shù)據(jù)集2）。將上述2 個(gè)數(shù)據(jù)集輸入U(xiǎn)niprot 數(shù)據(jù)庫（https： / /www.uniprot.org/） 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后映射，最終得到共有基因，即為潰瘍性結(jié)腸炎中與鐵死亡發(fā)生機(jī)制相關(guān)的基因。

1.2 潰瘍性結(jié)腸炎中與鐵死亡相關(guān)關(guān)鍵基因獲取 將鐵死亡基因輸入STRING （the Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes） 數(shù)據(jù)庫（v 11.5）（http： / /string-db.org/）［6］進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用（PPI） 分析，選取得分大于0.4 的基因輸入Cytoscape 3.7.1 軟件［7］，應(yīng)用network analysis plugin 功能對網(wǎng)絡(luò)中基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到其在網(wǎng)絡(luò)中的作用——自由度（Degree），根據(jù)其大小進(jìn)行可視化，顏色由淺黃色逐漸變成紅色，紅色越深，Degree 越大，該基因在網(wǎng)絡(luò)中的生物功能越多，選取排名前十的基因，即為潰瘍性結(jié)腸炎鐵死亡基因中的關(guān)鍵基因。

1.3 調(diào)節(jié)鐵死亡作用潰瘍性結(jié)腸炎中藥獲取 Coremine Medical 是挪威與中國科學(xué)院、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、美國國立醫(yī)學(xué)圖書館等機(jī)構(gòu)聯(lián)合開發(fā)的醫(yī)學(xué)信息檢索平臺，通過輸入基因名可檢索出與該基因相關(guān)的疾病及潛在治療藥物。將潰瘍性結(jié)腸炎鐵死亡關(guān)鍵基因輸入該數(shù)據(jù)庫，以P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選［8］，得到作用于每個(gè)關(guān)鍵基因的中藥，對其出現(xiàn)頻次進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得到排名最高的前3 味中藥。

1.4 中藥數(shù)據(jù)挖掘 查閱相關(guān)文獻(xiàn)，從“1.3” 項(xiàng)下出現(xiàn)頻次前三的中藥中篩選合適的1 味進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)挖掘，分析以其為核心治療潰瘍性結(jié)腸炎的用藥配伍規(guī)律。

1.4.1 數(shù)據(jù)來源 在中國知網(wǎng)（CNKI） 數(shù)據(jù)庫中以“潰瘍性結(jié)腸炎” 及“1.4” 項(xiàng)下中藥為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，時(shí)間為建庫至2021 年12 月。

1.4.2 納入標(biāo)準(zhǔn) （1） 文獻(xiàn)為已公開發(fā)表、可瀏覽內(nèi)容的隨機(jī)對照試驗(yàn)，單盲、雙盲或非盲法不限，語種中文；（2） 給藥途徑為口服，試驗(yàn)組干預(yù)措施為單純中藥、中成藥或中藥/中成藥聯(lián)合西藥治療，對照組干預(yù)措施為西醫(yī)治療（包括水楊酸制劑、激素、免疫抑制劑等）。

1.4.3 排除標(biāo)準(zhǔn) （1） 使用重復(fù)中藥復(fù)方的文獻(xiàn)； （2）給藥途徑包括中藥灌腸； （3） 無具體中藥組成的文獻(xiàn)；（4） 僅使用單味中藥治療的文獻(xiàn)； （5） 學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)體會類、綜述類、實(shí)驗(yàn)類文獻(xiàn)。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理 經(jīng)檢索后共得到3 905 篇相關(guān)文獻(xiàn)，按“1.4.2” “1.4.3” 項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)篩選后得到363 個(gè)符合條件的方劑，根據(jù)2015 年版《中國藥典》［9］和《中藥學(xué)》［10］將中藥名稱、分類進(jìn)行統(tǒng)一，例如“川白芍” “白芍藥” 均統(tǒng)一為“白芍”，“廣木香” “云木香” 統(tǒng)一為“木香”，“橘皮” 統(tǒng)一為“陳皮”，“炙甘草” 統(tǒng)一為“甘草”。

1.4.5 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 2019 軟件對方劑中單味中藥出現(xiàn)頻次、類型、性味歸經(jīng)等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)； IBM SPSS Modeler 18.0 軟件分析組方中藥，以出現(xiàn)頻次≥40 次者為高頻中藥； Cytoscape 3.7.1 軟件繪制高頻中藥網(wǎng)絡(luò)圖； Apriori 算法進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，其中滿足支持度≥30%、置信度≥100%、提升度≥1 的藥對為核心中藥； IBM SPSS Statistics 26.0 軟件對高頻中藥進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 潰瘍性結(jié)腸炎中與鐵死亡發(fā)生機(jī)制相關(guān)的基因 在FerrDb 數(shù)據(jù)庫中共得到259 個(gè)與鐵死亡發(fā)生機(jī)制相關(guān)的基因（數(shù)據(jù)集1），在DisGeNET 數(shù)據(jù)庫中得到1 458 個(gè)與潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生相關(guān)的基因（數(shù)據(jù)集2），將上述2 個(gè)數(shù)據(jù)集標(biāo)準(zhǔn)化后映射得到76 個(gè)共有基因，即為潰瘍性結(jié)腸炎鐵死亡基因，見圖1。

圖1 潰瘍性結(jié)腸炎中與鐵死亡發(fā)生機(jī)制相關(guān)的基因韋恩圖

2.2 潰瘍性結(jié)腸炎鐵死亡關(guān)鍵基因分析 將76 個(gè)潰瘍性結(jié)腸炎鐵死亡基因輸入STRING 數(shù)據(jù)庫篩選，通過Cytoscape 軟件可視化，根據(jù)Degree 大小進(jìn)行顏色渲染，得到10 個(gè)關(guān)鍵基因，分別為腫瘤蛋白P53 （TP53）、白細(xì)胞介素-6 （IL6）、低氧誘導(dǎo)因子-1A （HIF1A）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3 （STAT3）、白蛋白（ALB）、表皮生長因子受體（EGFR）、血管內(nèi)皮生長因子A （VEGFA）、肉瘤基因（SRC）、V-Ha-Ras 肉瘤病毒癌基因同源物（HRAS）、TOLL樣受體4 （TLR4），具體見表1、圖2。

表1 潰瘍性結(jié)腸炎中與鐵死亡相關(guān)的關(guān)鍵基因

圖2 潰瘍性結(jié)腸炎中與鐵死亡發(fā)生機(jī)制相關(guān)的基因

2.3 調(diào)節(jié)鐵死亡作用潰瘍性結(jié)腸炎的中藥 將“2.2” 項(xiàng)下關(guān)鍵基因輸入Coremine Medical 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)頻次最高的前3 味中藥是丹參、人參、黃芩、黃芪，其中黃芩、黃芪出現(xiàn)頻次相同，故一起納入，具體見表2?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，黃芩主要成分黃芩素可直接螯合人體內(nèi)鐵離子，減少鐵離子沉積，抑制芬頓反應(yīng)，具有顯著的抗鐵死亡活性，對其抑制作用優(yōu)于傳統(tǒng)抑制劑Ferrostatin-1，并且潰瘍性結(jié)腸炎病機(jī)以濕熱、瘀熱蘊(yùn)結(jié)腸道為主，故選擇該中藥進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)挖掘。

表2 調(diào)節(jié)鐵死亡作用潰瘍性結(jié)腸炎的中藥

2.4 含黃芩方劑統(tǒng)計(jì) 共得到含黃芩方劑363 首，包含209 味中藥，①功效，包括清熱類（1 128 次，29.20%）、補(bǔ)虛類（1 040 次，26.92%）、理氣類（356 次，9.22%）、解表類（243 次，6.29%）、止血類（242 次，6.26%）、利水滲濕類（191 次，4.94%）、溫理類（125 次，3.24%）、收澀類（93 次，2.41%）、化濕類（86 次，2.22%）、驅(qū)蟲類（78 次，2.02%）、化痰止咳平喘類（77 次，1.99%）、消食類（64 次，1.66%）、活血化瘀類（64 次，1.66%）、瀉下類（56 次，1.45%）、祛風(fēng)濕類（8 次，0.21%）、平肝息風(fēng)類（5 次，0.13%）、安神類（4 次，0.10%）、開竅類（3 次，0.08%）； ②四氣，包括寒（1 381 次，39.46%）、溫（1 193 次，34.09%）、平 （621 次，17.74%）、涼（169 次，4.83%）、熱（136 次，3.89%），具體見圖3A；③五味，包括苦 （2 495 次，41.72%）、甘 （1 447 次，24.19%）、辛 （ 1 138 次，19.03%）、酸 （ 878 次，14.68%）、咸（23 次，0.38%），具體見圖3B； ④歸經(jīng)，包括脾 （2 825 次，22.00%）、胃 （2 020 次，15.73%）、肺（1 567 次，12.20%）、肝（1 562 次，12.16%）、大腸（1 520 次，11.84%）、心（1 143 次，8.90%）、膽 （984次，7.66%）、小腸 （396 次，3.08%）、腎 （395 次，3.08%）、三焦 （ 218 次，2.19%）、膀胱 （ 156 次，1.21%）、心包（55 次，0.43%），具體見圖3C。

圖3 含黃芩方劑中藥雷達(dá)圖

2.5 核心中藥組分析 采用Apriori 算法進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，發(fā)現(xiàn)核心藥對共16 對，其中黃芩與黃連、甘草、白芍、木香出現(xiàn)頻次最多，為核心中藥組，具體見表3。

表3 核心中藥組

2.6 聚類分析 采用IBM SPSS Modeler 18.0 軟件進(jìn)行聚類分析，共篩選出29 味使用頻次≥40 次的中藥，即為高頻中藥，Cytoscape 軟件繪制其網(wǎng)絡(luò)圖，具體見圖4。再采用IBM SPSS Statistics 26.0 軟件中的“組間聯(lián)接”，測量區(qū)間選擇“皮爾遜相關(guān)性”，設(shè)置區(qū)類間距離為21，可將高頻中藥藥物聚為6 類，第1 類為半夏、干姜、大棗、黨參；第2 類為黃芩； 第3 類中組1 為陳皮、防風(fēng)、白術(shù)、茯苓、黃芪，組2 為柴胡、枳殼、甘草、地榆； 第4 類為大黃、肉桂、檳榔、當(dāng)歸、白芍、木香； 第5 類為薏苡仁、敗醬草、黃連、葛根； 第6 類為白頭翁、秦皮、黃柏、白及、赤芍，具體見圖5。

圖4 高頻中藥網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 高頻中藥聚類分析

3 討論與結(jié)論

2012 年，Dixon、Stockwell 等［11］發(fā)現(xiàn)，小分子化合物愛拉斯汀可通過抑制胱氨酸/谷氨酸逆轉(zhuǎn)運(yùn)體減少半胱氨酸依賴的谷胱甘肽合成，從而導(dǎo)致一種不同于細(xì)胞凋亡、壞死、自噬、焦亡等的新型細(xì)胞死亡模式，并將其命名為“鐵死亡”，目前它正參與腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、缺血再灌注損傷、潰瘍性結(jié)腸炎等疾病的發(fā)生發(fā)展［12-15］。中藥治療潰瘍性結(jié)腸炎由來已久，療效確切，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種中藥成分可調(diào)控鐵死亡，并且與經(jīng)典相關(guān)干預(yù)劑相比具有價(jià)格低廉、來源廣、療效可靠等優(yōu)勢［16］，故挖掘該類中藥并研究其用藥規(guī)律對相關(guān)診療具有重大意義。

通過生信預(yù)測發(fā)現(xiàn)，丹參、人參、黃芩、黃芪治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制可能與鐵死亡相關(guān)，近年來研究表明含上述4 味中藥的方劑對潰瘍性結(jié)腸炎有治療作用，與本研究預(yù)測結(jié)果相符。中醫(yī)認(rèn)為，潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病與“濕熱” “熱毒” 相關(guān)，其病機(jī)主要為濕熱蘊(yùn)結(jié)腸道［17-18］。黃芩入心、肺、膽、大腸經(jīng)，有清熱祛濕、瀉火解毒功效，常用于治療濕熱瀉痢、諸熱腸澼等病，其符合該病證的治法要求，現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，其主要成分黃芩素可直接螯合人體內(nèi)鐵離子，減少鐵離子沉積，抑制芬頓反應(yīng)，具有顯著的抗鐵死亡活性，并且對其抑制作用優(yōu)于傳統(tǒng)抑制劑Ferrostatin-1［19-20］，故選用該中藥進(jìn)行后續(xù)研究。通過數(shù)據(jù)挖掘得到含黃芩方劑共363 首，涉及209 味中藥，發(fā)現(xiàn)以清熱、補(bǔ)虛、理氣類為主，并且黃芩與黃連、甘草、白芍、木香為核心中藥組。黃芩配伍清熱類中藥黃連時(shí)，前者善清上焦火，后者善清中焦火，兩者性味相投，功效相似，相須為用，可增強(qiáng)清熱解毒燥濕之功，有助清胃腸之濕熱；配伍補(bǔ)虛類中藥白芍、甘草時(shí)，白芍?jǐn)筷幒蜖I、緩急止痛，芩芍相配，酸苦相濟(jì)，調(diào)中存陰，而甘草益氣和中、調(diào)補(bǔ)正氣，與黃芩一瀉一補(bǔ)、相互制約，可減弱前者瀉下之力，使其瀉熱而存陰、祛邪不傷正； 與理氣類中藥木香配伍時(shí)，可得后者行而不滯，而后者得前者溫而不燥，寒熱并有，相反相成，共奏清熱燥濕、行氣止痛之功效。另外，黃芩、白芍、甘草也是治療里熱下痢之祖方黃芩湯的重要組方藥材，而且課題組前期發(fā)現(xiàn)，黃芩湯作用潰瘍性結(jié)腸炎的機(jī)制可能與鐵死亡相關(guān)［21］，與本研究結(jié)論相符。

綜上所述，本研究以鐵死亡為切入點(diǎn)，通過生物信息學(xué)、數(shù)據(jù)挖掘方法分析中藥通過調(diào)節(jié)鐵死亡作用治療潰瘍性結(jié)腸炎的用藥規(guī)律，發(fā)現(xiàn)丹參、人參、黃芩、黃芪4 味中藥治療作用可能與鐵死亡相關(guān)，從病機(jī)、藥理方面考慮選擇黃芩進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)它治療本病時(shí)常與清熱、補(bǔ)虛、理氣類中藥配伍，其中黃芩、黃連、甘草、白芍、木香為核心中藥組。上述結(jié)果可為潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)治療及其作用機(jī)制探索提供參考。