急性持續(xù)熱應(yīng)激對(duì)兔血漿補(bǔ)體C3、溶菌酶含量及抗菌活性的影響

趙 川，黃光遠(yuǎn)，熊權(quán)鑫，楊曉煉，黃慶洲

（西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶 榮昌 402460）

為探討急性持續(xù)熱應(yīng)激對(duì)肉兔抗病機(jī)能的影響，本試驗(yàn)觀察了急性持續(xù)高溫對(duì)肉兔血漿補(bǔ)體C3、溶菌酶含量及血漿抗菌活性的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下：

1 材料與方法

1.1 主要藥品 補(bǔ)體C3含量測(cè)定藥盒（批號(hào)：20141117），測(cè)試盒主要包括Tris緩沖液、PEG6000、C3抗血清；溶菌酶含量測(cè)定藥盒（批號(hào)：20140917），測(cè)試盒包括菌粉、菌粉溶劑、溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品等。以上藥盒均由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)腸桿菌 ATCC25922株，購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 主要儀器 紫外可見分光光度計(jì)，電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱，立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器，超聲波清洗機(jī)，電熱恒溫水槽，低溫離心機(jī)，-40℃低溫冰箱，格力空調(diào)，微量移液器，肝素鋰一次性真空采血管、干濕溫度計(jì)、玻璃勻漿器。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物 70～80日齡成年新西蘭健康肉兔16只，雄性，體重2～2.5kg/只。由西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物科提供。

1.5 動(dòng)物飼料 精深兔料860ZQA兔配合飼料，由成都某農(nóng)牧發(fā)展有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為20140624。其中粗蛋白質(zhì)≥16.0%、粗纖維10.0%～12.0%、粗灰分≤10.0%、粗脂肪≥2.0%、鈣0.5%～1.0%、鈣磷比（%）2∶1、氯化鈉 0.5%、水分≤12.5%、賴氨酸≥0.7%、消化能≥10.47MJ/kg。每千克飼料中主要微量元素的含量：銅（Cu）≤40mg、鐵（Fe）≥80mg、鋅（Zn）≥60mg；每千克飼料中主要維生素的含量：維生素A≥9000IU、維生素D≥900IU、維生素E≥40IU。

2 試驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組 試驗(yàn)于2014年7月7日至20日在西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物房?jī)?nèi)進(jìn)行。將健康肉兔16只移入普通立體兔籠飼養(yǎng)，每籠兩只，自由采食和飲水。試驗(yàn)期間外界環(huán)境溫度為27～32℃，在常規(guī)飼養(yǎng)一周，采食、飲水無異常情況后，轉(zhuǎn)入正式試驗(yàn)。將肉兔隨機(jī)分為熱應(yīng)激組（舍溫控制在35±1℃）和適溫組（舍溫控制在24±1℃），每組8只，每組單獨(dú)飼養(yǎng)。

2.2 飼舍溫度控制及熱應(yīng)激處理時(shí)間 熱應(yīng)激組：用200W紅外線保溫?zé)襞菁訜?，于試?yàn)當(dāng)天8：00開始逐漸升溫，至當(dāng)日12：00飼舍溫度達(dá)到35±1℃（空氣濕度變化范圍為65%～75%），高溫持續(xù)時(shí)間為72h；適溫組：用空調(diào)降溫，于試驗(yàn)當(dāng)天8：00開始逐漸降溫，至當(dāng)日12：00飼舍溫度達(dá)到24±1℃（空氣濕度變化范圍為65%～75%），適溫持續(xù)時(shí)間也是72h。

2.3 飼養(yǎng)方式 肉兔自由采食和飲水，每日上午8：00、18：00各飼喂1次。試驗(yàn)期間測(cè)定兔采食、呼吸、心率、體溫等常規(guī)生理指標(biāo)。

2.4 血漿的收集及保存 正式試驗(yàn)從早上8：00開始，每隔 24 h后（即第 2 d早上 8：00），用肝素鋰真空采血管于兔的后肢外側(cè)靜脈采抗凝血5 mL，4℃、3000r/min離心5min，收集血漿，分裝于1.5mL指形管（0.5mL/管），-40℃保存，1月內(nèi)待測(cè)。

2.5 血漿抗菌活性的測(cè)定 血漿抗菌活性測(cè)定采用王雷等[1]的改進(jìn)方法進(jìn)行。將標(biāo)準(zhǔn)腸桿菌用0.1mmol/L的磷酸鉀鹽緩沖液（pH 6.4）配成一定濃度的懸濁菌液（D570nm=0.3～0.5）。取 3mL該菌液與 50μL待測(cè)血漿于試管中混勻，測(cè)定其保溫前在570nm處的光密度值（D0），然后置于 37℃水浴 30 min，取出后立刻置冰浴中10min終止反應(yīng)，測(cè)定其保溫后在570nm處的光密度值（D）?？咕盍按下式計(jì)算：U=[（D0-D）/D]1/2，菌液OD值每分鐘下降0.001定義為一個(gè)活性單位。

2.6 血漿溶菌酶含量的測(cè)定

2.6.1 試劑配制 （1）貯備菌液的配制。取5mg/支菌粉1支，倒入勻漿管中，加菌粉溶劑1 mL，用玻璃勻漿器輕輕緩慢旋轉(zhuǎn)研磨3min（切勿濺出），即得貯備菌液。將其取出后置2～8℃冰箱密封保存，一周左右內(nèi)備用。

（2）應(yīng)用菌液的配制。按貯備菌液與菌粉溶劑比例1∶19進(jìn)行配制，現(xiàn)用現(xiàn)配，用時(shí)搖勻。

（3）溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品的配制。溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品貯備液的配制：在每支溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品內(nèi)準(zhǔn)確加入1.0mL雙蒸水，即配成2 mg/mL溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品貯備液（2～8℃保存）。標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液的配制：先將溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品貯備液用雙蒸水10倍稀釋至20μg/mL后，再倍比稀釋至2.5μg/mL，即得溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液，現(xiàn)用現(xiàn)配（2～8℃保存）。

2.6.2 溶菌酶含量測(cè)定 采用空白對(duì)照法測(cè)定溶菌酶含量，操作步驟見表1。

表1 空白對(duì)照法測(cè)定溶菌酶含量 mL

將表1中各管溶液分別混勻，37℃準(zhǔn)確水浴15min，立即取出置于0℃以下的冰水浴中3min，逐管取出倒入1mL光徑比色皿中，530nm處以雙蒸水調(diào)透光度100%，比色，測(cè)各管透光度T15（T15即37℃水浴15min后的透光度值）。按下面公式計(jì)算溶菌酶含量：

溶菌酶含量（μg/mL）=[（測(cè)定透光度UT15-空白透光度OT15）/（標(biāo)準(zhǔn)透光度ST15-空白透光度OT15）]×2.5。2.5為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/mL）。

2.7 補(bǔ)體C3含量的測(cè)定 采用免疫比濁法進(jìn)行，具體操作方法見補(bǔ)體C3含量測(cè)定藥盒的使用說明書。

2.7.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將低溫保存的特種蛋白校準(zhǔn)品室溫下平衡20min，準(zhǔn)確加入生理鹽水1mL溶解，即為1mg/mL蛋白校準(zhǔn)液，再用生理鹽水按表2稀釋比例配成不同濃度的特種蛋白溶液。在波長(zhǎng)340nm處用分光光度計(jì)測(cè)定OD值，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為X軸，吸光度OD值為Y軸，通過ELISACalc軟件建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表2 校準(zhǔn)程序

2.7.2 樣品C3含量的測(cè)定 將低溫保存的樣品常溫解凍，3h內(nèi)進(jìn)行。操作步驟按表3進(jìn)行。

表3 C3含量的測(cè)定步驟

2.8 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPASS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 急性持續(xù)熱應(yīng)激下肉兔心率、呼吸頻率、體溫的變化 與適溫組比較，熱應(yīng)激24h后心率呈增高趨勢(shì)，但差異不顯著（P＞0.05），48h后極顯著高于適溫組（P＜0.01），72 h后組間差異不顯著（P＞0.05）；呼吸頻率和體溫的變化趨勢(shì)基本一致，熱應(yīng)激24、48、72h后，組間差異顯著或極顯著。熱應(yīng)激組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的比較：熱應(yīng)激24h后的呼吸頻率與48、72h后比較差異極顯著（P＜0.01），24、48h的體溫與72h比較差異極顯著（P＜0.01）。具體變化見表4。

表4 各組肉兔的心率、呼吸頻率、體溫變化情況（±S）

表4 各組肉兔的心率、呼吸頻率、體溫變化情況（±S）

注：肩標(biāo)*表示同一時(shí)間點(diǎn)組間比較（**表示P﹤0.01，*示P＜0.05）；肩標(biāo)字母表示組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)比較（不同字母表示差異顯著或極顯著，相同字母表示差異不顯著P＞0.05）。 下同。

組別 測(cè)定指標(biāo)24h 48h 72h熱應(yīng)激組218.67±9.45232.56±4.41**216.33±11.42適溫組心率（次數(shù)/min）205.20±3.68202.20±11.12205.29±13.53熱應(yīng)激組239.18±8.87a**206.25±5.21b**208.33±14.26b*適溫組呼吸頻率（次數(shù)/min）153.58±8.67167.44±5.26161.57±5.94熱應(yīng)激組41.58±0.15a**41.13±0.25a**40.75±0.11b**體溫（℃）適溫組39.98±0.0639.74±0.1139.77±0.22

3.2 不同急性持續(xù)熱應(yīng)激時(shí)間對(duì)肉兔采食量的影響熱應(yīng)激組采食量在24、48、72h時(shí)均極顯著低于適溫組（P＜0.01），組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)肉兔采食量的差異均不顯著（P＞0.05）。具體結(jié)果見表 5。

表5 各組肉兔試驗(yàn)期間的采食量變化 g/d

3.3 肉兔血漿抗菌活性的變化情況 與適溫組比較，熱應(yīng)激 24h后差異極顯著（P<0.01），48、72h時(shí)差異不顯著；熱應(yīng)激24h后與熱應(yīng)激48、72h后相比差異顯著（P<0.05）。具體結(jié)果見表6。

表6 各組肉兔試驗(yàn)期間的血漿抗菌活性變化 U

3.4 肉兔血漿溶菌酶含量變化 與適溫組比較，熱應(yīng)激組在熱應(yīng)激24 h后差異極顯著（P<0.01），熱應(yīng)激 48、72h后差異不顯著（P＞0.05），但均值均高于適溫組；熱應(yīng)激組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)比較，熱應(yīng)激后24、48、72h，溶菌酶含量呈降低趨勢(shì)，但不同時(shí)間點(diǎn)間差異不顯著（P＞0.05）。具體結(jié)果見表7。

表7 各組肉兔試驗(yàn)期間的血漿溶菌酶含量變化 μg/mL

圖1 C3含量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

3.5 肉兔血漿補(bǔ)體C3含量的變化

3.5.1 補(bǔ)體C3含量標(biāo)準(zhǔn)曲線 以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為X軸，吸光度OD值為Y軸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

3.5.2 補(bǔ)體C3含量的變化 與適溫組比較，熱應(yīng)激24、48 h 后組間差異均不顯著（P＞0.05），熱應(yīng)激 72 h后差異顯著（P＜0.05）；熱應(yīng)激組內(nèi)比較，熱應(yīng)激24h后與48h后差異不顯著（P＞0.05），48h后與72h后差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果見表 8。

表8 各組肉兔各時(shí)間點(diǎn)的血漿補(bǔ)體C3含量變化（±S）

表8 各組肉兔各時(shí)間點(diǎn)的血漿補(bǔ)體C3含量變化（±S）

g/L組別 24h 48h 72h熱應(yīng)激組 0.19±0.03a 0.18±0.04a 0.15±0.02*b適溫組 0.18±0.04 0.19±0.04 0.18±0.06

4 分析與討論

4.1 本試驗(yàn)表明，35℃急性持續(xù)熱應(yīng)激下肉兔的心率、呼吸頻率、體溫整體呈升高變化，但采食量明顯減少。其發(fā)生原因與動(dòng)物熱應(yīng)激時(shí)中樞神經(jīng)及外周交感神經(jīng)興奮性增強(qiáng)，中樞及外周血液中去甲腎上腺素及腎上腺素分泌迅速增加，導(dǎo)致攝食中樞抑制、胃腸運(yùn)動(dòng)減弱、心率加快有關(guān)[2]。

4.2 血漿溶菌酶含量、防御素、抗菌活性等是機(jī)體抗病力高低的重要指標(biāo)，其中溶菌酶因其能非特異性地破壞或溶解進(jìn)入機(jī)體微生物細(xì)胞壁而得名，這些物質(zhì)含量或活性的變化與機(jī)體抗病能力密切相關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，兔熱應(yīng)激24h后，血漿抗菌活性及溶菌酶活性均呈增高變化，而熱應(yīng)激48、72h后又基本恢復(fù)正常，提示肉兔熱應(yīng)激早期可能處于防御機(jī)制的快速動(dòng)員期，表現(xiàn)為抗應(yīng)激能力及抗病力迅速增強(qiáng)，但隨著熱應(yīng)激持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)，血漿抗菌活性及溶菌酶活性變化呈恢復(fù)趨勢(shì)，可能與動(dòng)物熱適應(yīng)或抗病力減弱有關(guān)。關(guān)于熱應(yīng)激對(duì)血漿溶菌酶及抗菌活力變化的影響，國(guó)內(nèi)外報(bào)道得較多，但結(jié)果不盡相同。本試驗(yàn)與陳昌福等[3]、趙萌等[4]的研究結(jié)果基本類似，即：血漿抗菌活性及溶菌酶含量呈先升高后降低的變化趨勢(shì)。

4.3 補(bǔ)體是存在于血清中的一組具有酶樣活性的球蛋白，正常情況下補(bǔ)體蛋白多以非活化的蛋白前體存在于血清[5]。補(bǔ)體系統(tǒng)在體內(nèi)具有一套有效的免疫效應(yīng)機(jī)制，具有殺菌、溶菌作用，并輔助和加強(qiáng)吞噬細(xì)胞和抗體的防御功能，是重要的非特異性免疫因子[6]。補(bǔ)體C3是補(bǔ)體系統(tǒng)的核心，血清中C3含量變化常與補(bǔ)體總量相平行，臨床上常作為檢測(cè)補(bǔ)體系統(tǒng)功能的主要指標(biāo)，補(bǔ)體C3水平降低常反映機(jī)體免疫功能受損[7]。本試驗(yàn)表明，在熱應(yīng)激早期補(bǔ)體C3含量基本穩(wěn)定，但中后期迅速降低。本試驗(yàn)結(jié)果與張崇英等[8]報(bào)道的熱應(yīng)激對(duì)錦鯉血清中C3含量的影響基本一致。

5 結(jié)論

肉兔在急性熱應(yīng)激早期，抗病力會(huì)迅速增強(qiáng)，但中、后期抗病力或非特異性免疫力呈逐漸降低之勢(shì)。

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