苦楝水提取液對兔球蟲卵囊孢子化率的影響觀察

李 波 ，游 浩 ，沈昆偉 ，周春雷 ，趙汝放

（1.四川省綿陽市動物疫病預防控制中心，四川 綿陽 621000；2.重慶市合川區(qū)畜牧站，重慶 合川 401520；3.四川省綿陽市涪城區(qū)動物疫病預防控制中心，四川 綿陽 621000；4.四川農(nóng)業(yè)大學，四川 溫江 611130）

兔球蟲病是由艾美耳屬的多種球蟲寄生于家兔肝膽管及腸上皮細胞內(nèi)引起的一種常見的寄生性、多發(fā)性原蟲病[1]，具有很高的發(fā)病率和死亡率，是養(yǎng)兔場及散養(yǎng)戶最常見的危害最大的流行性寄生蟲病之一[2]。目前對兔球蟲病的防治多以抗球蟲化學藥物為主[3]，如新潔爾滅、氯苯胍、10%福爾馬林、地克珠利、莫能菌素等[4]。雖然這些藥物在短期內(nèi)對球蟲病有一定的治療效果，但長期使用會使球蟲產(chǎn)生抗藥性，而患病耐過家兔的糞便也會污染環(huán)境，使得感染反復循環(huán)[5]。

與化學藥物的作用效果比較，中藥對兔球蟲病的治療就比較獨特。因為中草藥長期使用不會出現(xiàn)抗藥性，毒副作用較小，具有殺毒抑菌、促進機體生長和提高機體免疫力的作用[6]。已有研究發(fā)現(xiàn)這些中草藥對兔球蟲卵囊的發(fā)育有影響：川楝子、魚腥草、皂角、大蒜、洋蔥、葫蘆茶、石榴皮、常山、穿心蓮、白頭翁、側(cè)柏葉、苦參、山楂、鵝膽子、甘草等?？嚅訛殚浦参镩瑯涞母稍锍墒旃麑??？嚅优c川楝子為同科同屬不同種植物，兩種果實的性狀、成分、藥效略有不同，應(yīng)分別入藥，不宜混淆。據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》和《本草綱目》記載，苦楝子有驅(qū)蟲作用，其乙醇提取物的作用強，緩慢而持久。本試驗研究了苦楝子提取物對兔球蟲卵囊的殺滅效果，為中藥治療兔球蟲病提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗中藥 苦楝子，由綿陽市涪城區(qū)動物疫病預防控制中心提供。

1.1.2 球蟲卵囊 兔球蟲卵囊從感染了球蟲病的家兔糞便中提取。

1.1.3 試驗動物 3個月健康家兔，由綿陽市涪城區(qū)某公司提供。

1.1.4 試驗試劑 苦楝子、乙醇、飽和食鹽水、重鉻酸鉀、次氯酸鉀。

1.1.5 所用儀器 顯微鏡、電熱恒溫培養(yǎng)箱、粉碎機、離心機、電子天平。

本次試驗于2014年5月在四川農(nóng)業(yè)大學國家級動物實驗教學中心進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 對苦楝水提取物的試驗觀察 先在小平皿內(nèi)加入預先稀釋好的球蟲卵囊懸液4mL，再分別加入質(zhì)量濃度為 1、0.5、0.25 g/mL的苦楝水提取物4mL，另外加入4mL 2.5%重鉻酸鉀溶液作陰性對照和4mL次氯酸鉀作陽性對照。將每組混勻，于28～30℃下恒溫培養(yǎng)，第24、48h和72h時分別檢查計數(shù)每組的卵囊孢子化率。

1.2.2 中藥成分的提取 選取表面光滑、形狀規(guī)則的苦楝子作原料，用毛刷刷洗干凈，去蒂、籽和瓤，切成薄片，晾干，用烤箱烘干（80℃）至干透后，冷卻至室溫，用粉碎機粉粹，過篩制成20g的苦楝子粉。將苦楝子粉加純水適量（以水面浸沒苦楝子粉為宜），浸提2次：分別浸泡 12、24 h，沸水開 30 min后，放冷，過濾，合并濾液，然后水浴濃縮至中藥濃度為2g/mL[7]。

1.2.3 兔球蟲卵囊的收集 利用兔球蟲進行培養(yǎng)，使其孢子化，然后將孢子化卵囊感染正常家兔，觀察家兔的生理變化，用飽和食鹽水漂浮法從家兔糞便中檢測是否含有球蟲。具體方法如下：

電子天平上稱取100g含有兔球蟲卵囊的新鮮兔糞于燒杯中，加入飽和食鹽水浸泡搗爛，用過濾網(wǎng)將糞便殘渣濾去，濾液倒入離心管中，2500r/min離心7min，棄去上清液，保留沉淀物（卵囊）；再向離心管中加入飽和食鹽水，3500r/min離心20min，得沉淀物；將沉淀物置于適量的含2.5%重鉻酸鉀溶液的平皿內(nèi)，然后將其平均分成25份，分別倒入5個6孔細胞培養(yǎng)皿的孔內(nèi)，做好標記。

1.2.4 不同濃度中藥提取液對兔球蟲卵囊孢子化率的影響 用2.5%重鉻酸鉀溶液將苦楝子中藥配制成1、0.5、0.25 g/mL的濃度梯度，同時以2.5%重鉻酸鉀溶液作陰性對照，次氯酸鉀作陽性對照。于上述1.2.3的細胞培養(yǎng)皿孔內(nèi)加入中藥及對照溶液（4 mL/孔），搖勻，然后放入27℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于0、24、48h及72h時進行球蟲卵囊計數(shù)，并計算出每組的卵囊孢子化率。

1.3 數(shù)據(jù)處理采用麥氏計數(shù)法計算出每克糞便中未孢子化和已孢子化的球蟲卵囊數(shù)個數(shù)（OPG）。

OPG=（A 片+B 片）÷2×100（國標，2003）[8]

孢子化率（%）=孢子化卵囊/（孢子化卵囊+未孢子化卵囊）×100%。

1.4 數(shù)據(jù)分析運用SPSS 20.0 for Windows軟件對所得試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，觀察結(jié)果采用X±SD表示，用卡方檢驗判斷差異的顯著性。

2 結(jié)果

2.1 相同時間不同濃度的藥物對球蟲卵囊孢子化率的影響（見表1）在24h時，1g/mL的苦楝水提取物對兔球蟲卵囊孢子化的影響大于其他組，0.5g/mL和0.25g/mL苦楝水提取物的效果一樣，且大于陰性對照組；在48h時，1g/mL的苦楝水提取物對兔球蟲卵囊孢子化的影響大于其他組，0.5 g/mL的效果大于0.25g/mL和陰性對照組，0.25g/mL和陰性對照組的效果一樣；72h時的效果和48h的效果一樣。

表1 不同時間不同濃度藥物對兔球蟲卵囊孢子化率的影響結(jié)果（ΔX±SD）

2.2 相同濃度藥物在不同時間對球蟲卵囊孢子化率的影響從表1可見，在不同時間，1g/mL的苦楝水提取物對兔球蟲卵囊孢子化率的影響最大，效果好于陰性對照組，看圖1可以說明效果最好；0.5g/mL的苦楝水提取物對兔球蟲卵囊孢子化率的效果好于陰性對照組，看圖2可以說明效果一般；0.25g/mL的苦楝水提取物對兔球蟲卵囊孢子化率的影響最小，看圖3可以說明效果幾乎沒有。

圖1 1g/mL苦楝水提取物與對照組的對比

圖2 0.5g/mL苦楝水提取物與對照組的對比

圖3 0.25g/mL苦楝水提取物與對照組的對比

3 討論

球蟲卵囊經(jīng)病兔糞便排出后，需在外界適宜的環(huán)境中進行孢子生殖，發(fā)育為孢子化卵囊后才具有致病性。所以球蟲卵囊體外孢子化率的高低直接影響球蟲卵囊的致病力。本病的傳染多數(shù)因家兔食入被球蟲卵囊污染的飼料或飲用水，或者家兔排出的糞便中帶有球蟲卵囊，對兔舍清掃消毒不徹底而致病[9]。兔球蟲病一年四季均可發(fā)生和流行，特別是在溫暖、雨水較多的春、夏季節(jié)，該病常呈地方性流行[10]。當溫度在20～28℃范圍內(nèi)，相對濕度在55%～75%范圍內(nèi)，并且氧氣充足的時候，兔球蟲卵囊經(jīng)過2～3 d便可以發(fā)育成熟并且具有一定的感染力。

現(xiàn)階段，有人用苦楝子作為豬的驅(qū)蟲藥，并在用藥量方面作了探討?？嚅拥闹饕煞钟锌嚅亍]發(fā)性脂肪酸、山茶酚、樹脂、鞣質(zhì)等?？嚅泳哂序?qū)豬蛔蟲的作用，豬對苦楝子的敏感性比其他動物更強，但用苦楝子驅(qū)豬蛔蟲，易發(fā)生中毒，這主要是因為未按照體重計算用藥量。試驗表明，采用苦楝子驅(qū)豬蛔蟲的最適劑量為每千克體重6.0～11.79 g，有效率可達75%。還有人做了苦楝子對釘螺殺滅作用的研究，結(jié)果也證明苦楝子提取液對釘螺有較強的殺滅作用，且以70%乙醇提取的藥液的效果最好，其半數(shù)致死濃度只有381.2mg/L。

[1] 王璽德，盛書娟，祝建平，等.石榴皮提取物對離體培養(yǎng)兔球蟲卵囊的殺滅作用[J].中國畜牧獸醫(yī)，2012，39（2）:212.

[2] 代德華，楊增岐.兔球蟲病流行特點及其防控[J].畜牧與飼料科學，2012，33（1）：96-97.

[3] 朱樓英，何忠平，余建國.兔球蟲病藥物防治的進展[J].福建畜牧獸醫(yī)，2010，32（3）：35.

[4] 郭明生.不同化學藥物抑殺兔球蟲卵囊試驗[J].中國養(yǎng)兔雜志，1994（4）：8-9.

[5] 郭莉，毛光瓊，陽愛國，等.兔球蟲病的危害及防治進展[J].四川畜牧獸醫(yī)，2011，38（10）：29-30.

[6] 張國.中草藥對兔球蟲卵囊孢子化的影響[J].新疆畜牧業(yè)，2012（7）：16-18.

[7] 曾灶昌，鐘超.苦楝子中有效成分的提取分離及促進膽固醇流出作用研究[J].中外醫(yī)療，2008（16）：12-13.

[8] 秦建華，李國清.動物寄生蟲病學實驗教程[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2007.

[9] 賈路，王彥，石清來.球蟲病對兔的危害與防治[J].中國畜禽種業(yè)，2012（5）：114.

[10]方宗敏，兔球蟲病的發(fā)病機制、診斷和綜合防制[J].中國動物檢疫，2012，9（7）：55.