上轉換熒光探針的制備及其植物細胞成像

吳笑峰,陳增輝

(1.湖南科技大學信息與電氣工程學院，湖南湘潭,411201；2.湖南科技大學物理與電子科學學院,湖南湘潭,411201)

0 引言

近些年來，稀土離子摻雜的發(fā)光材料已經(jīng)在發(fā)光照明、催化、信息存儲等領域得到廣泛的研究和應用。隨著時代地不斷發(fā)展，人類對自身健康和周圍環(huán)境的和諧的關注，生物醫(yī)學和動植物學成為廣大科學研究的主題。早期的下轉化納米晶主要以研究有機染料和量子點為中心而展開，但是由于有機染料和量子點的生物毒性導致在生物領域的應用得到嚴重的限制，使其失去生物和醫(yī)學的研究價值。并且，下轉換納米晶是吸收波長較短的紫外光而發(fā)出能量較低的可見光，紫外光由于具有高能量對組織和細胞具有殺傷能力、短波長穿透力弱等缺陷，使得由低能量紅外光子激發(fā)的上轉化發(fā)光材料的發(fā)展成為必然。紅外光具有很強的組織穿透性、缺乏標簽的自動熒光、高的性噪比等優(yōu)點。因此，上轉化發(fā)光納米晶有望成為組織細胞標記應用于動植物細胞成像。最近，Li 組應用NaYF4:Yb,Er 上轉化熒光納米探針注射老鼠的組織，對細胞進行成像研究。這些應用都為之后的生物醫(yī)學、動植物學的研究提供了基礎。

本文主要是應用NaLuF4:Yb/Er 上轉化納米晶對西紅柿細胞進行標記，通過熒光信號觀察其細胞的形態(tài)和結構，進一步地對西紅柿生物結構研究。

1 實驗制備與結構表征

1.1 試劑與儀器

實驗中使用的氯化镥（99.9%）， 氯化鐿（99.9%）， 氯化鉺（99.9%），氫氧化鈉 （≥98%）， 氟化銨（≥98%），甲醇（99.5%），十八烯（90%），油酸（90%）是從 Sigma Aldrich 購買。所有的試劑都直接用于化學反應，未經(jīng)進一步的提純處理。

1.2 樣品制備

采用熱溶劑法制備稀土離子Yb3+和Er3+摻雜的NaLuF4納米晶：2 mL RECl3（0.2 M,RE= Lu,Yb and Er/Tm）的水溶液被添加到12 ml 十八烯和4 ml 油酸的混合液中?；旌衔镌诩訜?0min后被加入5 ml NH4F (1.5 mmol)和NaOH (1 mmol)甲醇溶液，隨后加熱蒸發(fā)掉甲醇和水，再加熱到310°C 持續(xù)加熱60min 后冷卻。將產(chǎn)物用乙醇清洗3 次后分散在環(huán)己烷溶液中保存。

1.3 結構表征

采用H-7650c 型透射電子顯微鏡來觀察納米顆粒的大小和形貌；采用Hitachi F-2700 熒光光譜儀測試上轉化發(fā)光性能；用Sony 單反相機拍攝西紅柿表皮細胞成像，測試所用的光源是波長為980 nm、功率可調節(jié)的激光器。所有的測試均在室溫下進行的。

2 結果與討論

2.1 發(fā)光特性

熱熔劑方法能夠合成大小一致，形貌均勻的納米晶，這主要是由于摻雜的成分的改變使納米晶的尺寸可控。為了揭示樣品的結構，利用透射電鏡測試了樣品的形貌像如圖1 所示。從圖2可以看出，幾乎所有的納米晶都為球形的顆粒，其直徑大約為20 nm 左右。NaLuF4:Yb/Er 顆粒的尺寸均勻性、納米晶的大小和良好的生物相容性為西紅柿細胞成像提供了良好的熒光納米探針。

圖2 是Yb/Er 共摻NaLuF4納米顆粒的上轉化熒光光譜圖。在980 nm 的紅外光子激發(fā)之下，很強的綠色發(fā)射光能被觀察到。通過對圖2 的觀察，我們可以清楚地看到主要有兩個發(fā)射帶，位于541 nm 和662 nm，其中541 nm 和662 nm 發(fā)射光譜分別是由于Er3+的4S3/2-4I15/2和4F9/2-4I15/2能級躍遷。在可見光范圍之內，～541 nm 發(fā)射帶主要是綠色光波長，而～662 nm 是典型的紅色光波長，但是相對紅光帶綠光帶明顯光譜帶更高更強，所以樣品在激發(fā)時肉眼可見的是綠色光。

圖1 NaLuF4:Yb/Er 樣品的透射電鏡圖。Fig. 1 TEM images of NaLuF4 nanoprobes doped with 18%Yb3+/2%Er3+.

圖3 為NaLuF4:Yb/Er 納米顆粒的能級圖，

圖2 NaLuF4:Yb/Er 樣品在波長為980 nm 的紅外光激發(fā)下的上轉換熒光光譜圖。Fig. 2 Room-temperature upconversion fluorescent spectra of NaLuF4 doped with 18%Yb3+/2%Er3+ under the excitation of a 980 nm laser diode.

圖3 Er3+離子在Yb3+離子敏化下的發(fā)光機制。Fig. 3 Luminescent mechanism of Er3+ ions under the sensitization of Yb3+.

圖4 （a）用NaLuF4:Yb/Er 樣品標記的洋蔥表皮細胞熒光顯微成像，（b）500 倍放大的傳統(tǒng)的切片透射光成像。Fig. 4 (a) Fluorescence microscope imaging of tomato epidermal slices under the excitation of a 980 nm laser diode loaded with NaLuF4 nanocrystals doped with 18%Yb3+/2%Er3+ (b) conventional slice transmission imaging. Enlarged by 500×.

揭示其在980 nm 波長紅外光激發(fā)下的上轉化發(fā)光機制。通過Yb 離子吸收980 nm 光子，把吸收的光子轉移給附近的Er 離子的4I11/2能級，然后通過此能級多次吸收光子進行積累，部分光子躍遷到更高能級（4F7/2，4F5/2），之后通過無輻射弛豫到2H11/2、4S3/2和4F9/2能級，然后這些能級上的粒子分別向基態(tài)能級躍遷發(fā)出～521 nm， ～541 nm，～662 nm 的可見光。

3.2 植物細胞成像

圖4 分別是西紅柿表皮細胞的普通成像和用NaLuF4:Yb/Er 納米顆粒標記的西紅柿表皮細胞的熒光成像圖。實驗合成的NaLuF4:Yb/Er 納米顆粒經(jīng)過聚乙二醇進行表面修飾使其具有良好的生物相容性。把小片西紅柿表皮細胞浸泡于NaLuF4:Yb/Er納米顆粒的水溶液中，5 min 取出進行成像。如圖4a 所示，西紅柿表皮細胞在普通成像時，細胞呈現(xiàn)方球狀，細胞之間的空隙比較大，厚度比較薄。當用980 nm 紅外激光激發(fā)時，用NaLuF4:Yb/Er 納米探針標記的西紅柿表皮細胞成綠色，細胞輪廓和分布情況被清晰地顯示出來。相比普通的透射光成像，熒光成像能夠直接應用于活體，免除了切片過程，而且其成像清晰，方便，對活體組織可以進行局部的顯微觀察。活體組織或者細胞成像有望在生物醫(yī)學，臨床診斷等領域得到廣泛的應用。

3 結論

本文采用熱熔劑法制備了Yb3+和Er3+共摻雜的NaLuF4納米晶。由于優(yōu)良的發(fā)光性能及經(jīng)過表面修飾后很好的生物相容性，NaLuF4納米晶被應用對西紅柿細胞進行標記，進行熒光成像，結果表明，上轉化納米探針能很好地吸附在西紅柿細胞的細胞壁，對細胞的形貌進行清晰的成像，而且相比傳統(tǒng)的切片透射光成像，熒光成像能夠應用于活體，免除切片過程，這為生物醫(yī)學的研究提供了新的成像途徑。

[1] Qi Yu,Kenneth Yin Zhang,Hua Liang,Qiang Zhao, Tianshe Yang,Shujuan Liu,Chuanqi Zhang,Zhengjian Shi,Wenjuan Xu,and Wei Huang,Dual-Emissive Nanohybrid for Ratiometric Luminescence and Lifetime Imaging of Intracellular Hydrogen Sulfide[J].ACS Appl.Mater.Interfaces,2015,7(9): 5462-5470.

[2] Stefan Schietinger,Thomas Aichele,Hai-Qiao Wang, Thomas Nann and Oliver Benson, Plasmon-Enhanced Upconversion in Single NaYF4:Yb3+/Er3+ Codoped Nanocrystals[J].Nano Lett.,2010,10(1):134-138.

[3] Qingjun Liu,Chunsheng Wu, Hua Cai,Ning Hu,Jun Zhou, and Ping Wang,Cell-Based Biosensors and Their Application in Biomedicine[J].Chem.Rev.,2014, 114(12): 6423-6461.

[4] A.Venkateswararao,K.R.Justin Thomas,Chuan-Pei Lee,Chun-Ting Li,and Kuo-Chuan Ho,Organic Dyes Containing Carbazole as Donor and π-Linker: Optical,Electrochemical,and Photovoltaic Properties[J].ACS Appl.Mater.Interfaces,2014, 6(4):2528-2539.