染色蒲黃中檸檬黃的檢測方法研究

翟 清 楊志偉 石鑫磊 范純玲

吉林省松原市食品藥品檢驗(yàn)所，吉林松原 138000

蒲黃收載于《中國藥典》2010年版一部，為香蒲科植物水燭香蒲Typha angustifolia L.、東方香蒲Typha orientalis Presl或同屬植物的干燥花粉。具有止血，化瘀，通淋的功效，用于吐血，衄血，咯血，崩漏，外傷出血，經(jīng)閉痛經(jīng)，胸腹刺痛，跌撲腫痛，血淋澀痛［1］。為中醫(yī)臨床常用中藥，也是多種中成藥的原料藥。現(xiàn)代研究證明具有鎮(zhèn)痛、抗凝促凝（與濃度有關(guān)）、促進(jìn)血液循環(huán)、降低血脂、防止動脈硬化、保護(hù)高脂血癥所致的血管內(nèi)皮損傷、興奮收縮子宮、增強(qiáng)免疫力等作用，還有促進(jìn)腸蠕動、抗炎、抗低壓低氧、抗微生物等藥理作用，臨床有廣泛的用途［2-4］。由于中藥材市場經(jīng)營比較混亂，摻雜使假現(xiàn)象比較嚴(yán)重，經(jīng)過市場調(diào)查發(fā)現(xiàn)，蒲黃偽品多為該植物非藥用部位的粉末，經(jīng)過染色按正品銷售使用，染色多用化工原料金胺O進(jìn)行非法染色［5-8］，但由于近年來藥監(jiān)部門加大了中藥非法染色的打擊力度，金胺O染色現(xiàn)象有所減少，但仍有一些不法商販將蒲黃偽品用檸檬黃非法染色。檸檬黃，又稱酒石黃、酸性淡黃、肼黃?；瘜W(xué)名稱為1-（4-磺酸苯基）-4-（4-磺酸苯基偶氮）-5-吡唑啉酮-3-羧酸三鈉鹽，為水溶性合成色素。呈鮮艷的嫩黃色，是單色品種。多用于食品、飲料、化妝品、飼料、煙草、玩具、食品包裝材料等的著色，也用于羊毛、蠶絲的染色及制造色淀［9］。檸檬黃不是蒲黃應(yīng)有的化學(xué)成分，在藥學(xué)領(lǐng)域主要用于膠囊殼的著色劑［10］。筆者通過TLC法，HPLC-PAD法，鑒定證明蒲黃所用染料除金胺O外，還有用檸檬黃染色問題，并建立了檢查方法，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

昆山市超聲儀器有限公司KQ-400KDB型超聲波清洗機(jī)；Linomat 5卡瑪半自動點(diǎn)樣儀；Waters2695-2988，PAD檢測器，Empower 2色譜工作站。

1.2 試藥

檸檬黃對照試劑購自中國計量科學(xué)研究院，批號：10002，蒲黃對照藥材購自中國食品藥品檢定研究院，批號121225-201003。蒲黃藥材、飲片購自吉林省各地區(qū)的市售樣品。薄層色譜板為硅膠G薄層色譜板，購自青島海洋化工廠分廠；水為超純水，經(jīng)檢驗(yàn)合格，甲醇為色譜純，醋酸銨為分析純。

2 方法

2.1 TLC檢查

2.1.1 對照試劑溶液的制備 取檸檬黃對照試劑適量，加甲醇制成0.2mg/mL的溶液，作為對照試劑溶液Ⅰ（TLC用）。取檸檬黃對照試劑溶液Ⅰ適量，加甲醇制成50μg/mL的溶液，作為對照試劑溶液Ⅱ（HPLC用）。

2.1.2 供試品溶液的制備 取蒲黃粉末1g，加甲醇20mL，密塞，超聲處理20min，濾過，取濾液作為供試品溶液。

2.1.3 陰性對照溶液的制備 取蒲黃對照藥材1g，加甲醇20mL，密塞，超聲處理20min，濾過，取濾液作為陰性對照溶液。

2.1.4 TLC試驗(yàn) 取上述對照試劑溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-氨水-水（1︰3︰3︰1︰1）為展開劑，展開，取出，晾干，日光下檢視。供試品色譜中，陽性樣品在與對照試劑色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對照在與對照試劑色譜相應(yīng)的位置上，則不顯相同顏色的斑點(diǎn)（圖1）。

圖1 蒲黃樣品薄層色譜圖

2.2 金胺O的HPLC-PAD法確認(rèn)

2.2.1 色譜條件 色譜柱為以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-0.05mol/L醋酸銨溶液（20︰80）為流動相；采用二極管陣列檢測器，檢測波長為423nm。理論塔板數(shù)按檸檬黃對照試劑色譜中的主峰計算，應(yīng)不低于2000。

2.2.2 測定法 吸取供試品溶液與對照試劑溶液及陰性對照溶液各10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖（圖2）。

2.2.3 專屬性檢查 為了證明該方法具有專屬性，將對照試劑溶液，含金胺O樣品、陰性樣品溶液，分別進(jìn)樣，進(jìn)行液相色譜的考察，結(jié)果薄層色譜含有檸檬黃的樣品溶液呈現(xiàn)與檸檬黃對照試劑保留時間相同的色譜峰；比較200～600nm波長范圍的紫外-可見吸收光譜，吸收光譜相同。陰性樣品溶液未檢出與檸檬黃對照試劑相同的色譜峰。從而證明該補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目具有專屬性。

圖2 蒲黃樣品液相色譜及光譜圖

2.3 HPLC檢查方法的建立與驗(yàn)證

2.3.1 線性范圍考察 精密稱取檸檬黃對照試劑適量，加甲醇制成5.49、10.98、21.96、43.92、87.84μg/mL的溶液，分別精密吸取10μL進(jìn)樣測定，以對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程Y=4051375.3501X-731.5417（r=1.0000），結(jié)果表明檸檬黃在0.0549～0.8784μg范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，符合外標(biāo)法測定的要求。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，在同一色譜條件下，重復(fù)6次，每次10μL，注入液相色譜儀，測定其檸檬黃色譜峰面積值，計算RSD=0.1％。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，在同一色譜條件下，24h內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10μL，測定檸檬黃色譜峰面積，RSD=0.1％，結(jié)果表明24h內(nèi)供試品溶液中檸檬黃基本穩(wěn)定。

2.3.4 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一供試品6份，分別按供試品溶液制備的方法制成供試品溶液，取對照試劑溶液及上述供試品溶液分別進(jìn)樣，結(jié)果6份樣品均檢出檸檬黃。確定所采用的檢查方法具有重現(xiàn)性。

2.3.5 耐用性 通過用同一供試品溶液的3支色譜柱進(jìn)樣，證明了采用的方法在實(shí)驗(yàn)條件有所改變時，該方法仍然適用。

2.3.6 回收率 精密稱取已知含量的供試品粉末（檸檬黃含量為0.03％）6份，每份約0.5g，分別精密加入檸檬黃對照試劑溶液（0.1098mg/mL）1.4mL，依法測定，計算回收率，測得檸檬黃的平均回收率為98.61％，RSD=0.5％。見表1。

表1 檸檬黃回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3.7 樣品測定 取市售姜黃樣品10批，按上述方法測定檸檬黃含量，結(jié)果有6批含有檸檬黃，含量在0.05～0.50mg/g。見表2。

表2 54批市售樣品測定結(jié)果

3 結(jié)果

薄層色譜試驗(yàn)中，陽性樣品在與對照試劑色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對照在與對照試劑色譜相應(yīng)的位置上，則不顯相同顏色的斑點(diǎn)。經(jīng)過HPLC-PAD法確認(rèn)，陽性樣品色譜圖中，在與對照試劑相同保留時間有相同的色譜峰，陰性對照無相應(yīng)的色譜峰，進(jìn)一步證明方法的準(zhǔn)確性。

4 討論

檸檬黃，為水溶性合成色素，是食品常用的染色劑之一，在不同食品中的使用限量不同，最高使用向量均為0.5mg/g，通常情況下，在常規(guī)用量下使用是安全的［9］，但不是蒲黃應(yīng)有的化學(xué)成分，而是個別商販為了銷售蒲黃偽品而染的色素，并且檸檬黃對敏感人群而言，少量即可產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)（包括支氣管哮喘）［11］。本實(shí)驗(yàn)所測得的檸檬黃含量雖未超出使用的最高限量，但在臨床使用仍純在一定風(fēng)險。

染色的樣品均為偽品蒲黃，經(jīng)過顯微鑒定可以確定為該植物非藥用部位的粉末加部分沙土組成［12-13］，甚至不含或少含蒲黃花粉粒，經(jīng)過染色使其近似蒲黃的顏色，原來多用金胺O進(jìn)行染色，由于藥監(jiān)部門加大了打擊力度，又開始使用檸檬黃對藥材非法染色。

在制備供試品溶液時，對甲醇、乙醇提取分別進(jìn)行了考察，結(jié)果根據(jù)薄層色譜法所顯斑點(diǎn)顏色深淺和液相色譜峰的大小，判斷用甲醇提取，提取率較高；提取方法采用加熱回流和超聲處理兩種方法進(jìn)行考察，結(jié)果超聲處理優(yōu)于回流提取。

從表2可以看出，10批樣品中有6批檢出檸檬黃，TLC法和HPLC法測定結(jié)果一致，沒有誤判現(xiàn)象。

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