一對2型糖尿病老年雙生子基因表達譜動態(tài)變化比較

一對2型糖尿病老年雙生子基因表達譜動態(tài)變化比較

譚從娥馮文哲1王米渠2

(陜西中醫(yī)學院中醫(yī)診斷學教研室，陜西咸陽712046)

摘要〔〕目的分析一對老年同卵雙生子2型糖尿病(T2DM)隨病程延長而穩(wěn)定表達的基因功能特征。方法連續(xù)2年分6次調查一對老年雙生子的T2DM病情變化并作基因芯片實驗，篩選出表達量隨病程延長而連續(xù)升高的基因為雙生子的共表達基因，通過FatiGO Compare工具比較兩組共表達基因功能注釋的異同。結果分別篩選到大、小雙的共表達基因473和529個，其中相同的共表達基因功能富集于“T細胞活化調節(jié)” 基因本體(GO)類，不同的共表達基因功能差異體現(xiàn)在分子功能調節(jié)及刺激反應2個GO類別。結論免疫功能基因的異常表達是該對雙生子T2DM隨病程延長而穩(wěn)定出現(xiàn)的共性特征。

關鍵詞〔〕2型糖尿病；同卵雙生子；共表達基因；基因表達譜

中圖分類號〔〕R587.1〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學基金(No.81473559)；陜西省自然科學基礎研究計劃(No.2011JM4024)

1陜西中醫(yī)學院附屬醫(yī)院2成都中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院

第一作者：譚從娥(1972-)，女，副教授，博士，主要從事證侯的分子調控機制研究。

同卵雙生子間一致的表征可認為與遺傳因素有關，不一致的表征則大多數(shù)與環(huán)境因素有關〔1〕?；虻谋磉_會受到時空因素的影響，不同的外在環(huán)境會導致基因的表達量不同，本研究分析2型糖尿病(T2DM)同卵雙生子功能基因表達的異同，探討雙生子T2DM隨時間延長而穩(wěn)定表達的功能基因特征。

1對象與方法

1.1對象雙生子，女性，69歲，均出生并居住于四川省成都市。根據世界衛(wèi)生組織1999頒布的糖尿病診斷標準，雙生子均為T2DM患者。大雙病史7年，小雙病史9年。理化檢查提示大、小雙目前無明顯的糖尿病并發(fā)癥。采用微衛(wèi)星DNA基因分型技術〔2，3〕鑒定雙生子卵型(同卵或異卵)，結果雙生子的15個基因座完全相同，說明這對雙生子為同卵雙生子。實驗前均簽署知情同意書。

1.2理化檢查于2011年1月至2012年8月內，每4個月一次完成雙生子T2DM患者全身體檢，每年3次，共6次。雙生子體檢于成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院體檢中心完成，項目包括一般情況、物理檢測、生化常規(guī)及糖化血紅蛋白等內容。每次采取外周血以備完成基因芯片實驗。

1.3基因芯片實驗方法以大雙和小雙為實驗組，以大雙的女兒為正常對照，每4個月一次共6次采取雙生子外周血，基因芯片實驗于上海生物芯片有限公司完成。實驗流程：取實驗組和正常對照每人外周血10 ml，提取總RNA，反轉錄為cDNA，采用上海生物芯片有限公司制備的cDNA人類全基因組表達譜芯片，實驗組和對照分別用cy3和cy5標記，進行基因芯片雜交。芯片用ScanArray Express雙通道激光掃描儀(Packard Bioscience公司)掃描，軟件讀取數(shù)據，采用Genespring進行Normalize處理分析，最后ratio值為實驗/對照。

1.4基因芯片數(shù)據分析共表達基因的篩選標準為6次檢測的差異基因中表達量連續(xù)升高的基因。采用FatiGO Compare數(shù)據庫實現(xiàn)雙生子之間共表達基因的GO和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路注釋比較。

1.5統(tǒng)計學分析組間比較行Fisher精確檢驗。

2結果

2.1雙生子實驗室檢測結果雙生子但T2DM病情的輕重程度差異較大，小雙重于大雙。大雙糖化血紅蛋白值介于6.0%～8.0%之間，血糖控制較為理想，小雙糖化血紅蛋白值在8.0%～9.0%之間，說明對血糖的控制較差。小雙的甘油三酯輕度升高，而且在2011年5月的體檢中發(fā)現(xiàn)血尿素氮(BUN)增高，大雙在3次體檢中這兩項指標正常，提示大雙和小雙目前均無嚴重的肝腎功能損害。見表1。

2.2雙生子共表達基因篩選結果根據共表達基因的篩選標準得到大雙共表達基因473個，小雙共表達基因529個，兩組共表達基因中相同的為15個，大電導鈣激活鉀通道，M亞族β鏈成員4(KCNM)、Lysosomal相關的膜蛋白(LAMP)3、白介素(IL)-18、核孔蛋白210 kD(NUP210)、IL-12A、聚合酶(POLE4)、IL-1R1、環(huán)指蛋白(RNF)122、干擾素調節(jié)因子(IRF)4、溶質攜帶物家族38，成員(SLC38A)1、載脂蛋白L域含1(APOLD1)、早期反應(IER)5、人白細胞抗原(HLA-DPA)1、賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶(KDM)3A、人鳥苷酸核苷酸結合蛋白(GBP)4。

表1雙生子3年血生化及糖化血紅蛋白檢查結果(大雙/小雙)

2010-6-252011-6-72012-4-26空腹血糖7.35/13.68.09/13.7217.8/18.40餐后2h血糖9.90/16.7211.26/13.4210.54/18.74甘油三酯1.38/2.251.36/3.541.12/2.74血尿素氮(mmol/L)4.33/5.423.91/8.165.12/6.46糖化血紅蛋白(%)6.90/8.607.60/9.507.60/8.90

2.2.1雙生子相同的共表達基因功能注釋將相同的15個基因輸入FuncAssociate芯片數(shù)據網絡分析平臺，結果基因功能注釋只有1個顯著性GO類(P<0.05)，即T細胞活化的調節(jié)，有3個基因(IL-18、IL-12A、IRF4)被注釋到該GO術語。KEGG通路注釋發(fā)現(xiàn)，15個基因被注釋到19條分子通路，其中細胞因子-細胞因子受體相互作用通路具有顯著性，3個基因IL-18、IL-12A、IL-1R1在該通路中得到注釋。

2.2.2雙生子不同共表達基因的功能注釋比較將雙生子共表達基因輸入FatiGO Compare數(shù)據庫進行基因功能注釋比較，移去兩組基因中相同的基因，大雙473個共表達基因中有321個基因獲得注釋，小雙529個共表達基因中有206個基因獲得注釋。在GO生物學過程、分子功能及細胞成分3個層次，分別有2、3和3個GO術語在雙生子間有顯著性差異(P<0.05)，見表2。在KEGG通路注釋比較差異沒有顯著性(P>0.05)。

表2雙生子不同共表達基因功能注釋比較〔n(%)〕

GO術語GO類別/水平小雙基因數(shù)目大雙基因數(shù)目P值分子功能調節(jié)(GO:0065009)生物學過程/35(29.2)0(71.8)0.01生物刺激反應(GO:0009607)生物學過程/30(0)8(100)0.02RNA結合(GO:0003723)分子功能/42(18.4)13(81.6)0.03核糖核蛋白復合體(GO:0030529)細胞成分/60(0)7(100)0.04

3討論

T2DM是由遺傳和環(huán)境因素共同作用所形成的復雜疾病。研究〔4，5〕表明，T2DM在同卵雙生子中具有高度的患病一致性，但是即便是同卵雙生子，T2DM的患病仍然具有差異性和非同步性的特點，具體表現(xiàn)為發(fā)病時間的不一致性、病情輕重程度的差異性以及并發(fā)癥出現(xiàn)的不同性等。本研究選擇的雙生子姐妹為同卵雙胞胎，雖然都確診患T2DM，但二者病程、輕重程度及兼癥等都有很大的不同。和大雙相比，小雙T2DM發(fā)病時間早、病情程度重，在連續(xù)2年的6個觀測點上，空腹血糖值均明顯高于大雙，血糖控制不理想。隨著病程的延長，二者的病情程度均有加重，但是加劇的程度不一致，小雙出現(xiàn)腎功的輕度損傷。說明同卵雙生子雖然遺傳基礎相同，所患疾病名稱相同，但是疾病的具體表現(xiàn)形式仍存在很大的差異。 通過對雙生子連續(xù)2年6個時間點基因表達譜數(shù)據的綜合分析，篩選出了大雙和小雙跟病情發(fā)展相關的共表達基因473和529個。這些共表達基因的表達量均隨著病程的延長而逐漸增加，因此可認為這些基因和T2DM的病情加劇密切相關。雙生子兩組共表達基因中有15條相同的基因，GO功能注釋“T細胞活化調節(jié)”出現(xiàn)顯著性。T細胞在特異性免疫應答中起關鍵性作用，不僅負責細胞免疫，對體液免疫也起重要的輔助和調節(jié)作用〔6〕，而且在老年T2DM患者中，T細胞亞群數(shù)量和各亞群之間的比例和患者的血糖水平明顯相關〔7〕，提示免疫功能紊亂是這對雙生子T2DM隨病程延長而穩(wěn)定出現(xiàn)的共性特征。雙生子之間不同的共表達基因在多個GO術語得到注釋，這些術語中有顯著性差異的GO主要為分子功能調節(jié)和生命刺激兩類，說明同卵雙生子T2DM患病分子基礎的差異性，差異的形成主要與雙生子間的個體因素及生活環(huán)境的不同有關，值得深入研究。

本研究發(fā)現(xiàn)這對老年雙生子T2DM患病分子基礎既存在共性又存在差異，共性特征是都存在免疫功能的異常，差異性主要體現(xiàn)在二者分子功能調節(jié)及刺激反應等方面的調節(jié)不同。

4參考文獻

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7符琳琳,張消克.老年2型糖尿病患者細胞免疫狀態(tài)及T細胞亞群的觀察〔J〕.中國老年學雜志，2011；31(11)：2099-100.

〔2013-09-12修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)