308nm準(zhǔn)分子激光聯(lián)合胡椒堿對毛囊外根鞘無色素黑素細(xì)胞黑素合成及酪氨酸酶相關(guān)蛋白酶-1、-2蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用

308 nm準(zhǔn)分子激光聯(lián)合胡椒堿對毛囊外根鞘無色素黑素細(xì)胞黑素合成及酪氨酸酶相關(guān)蛋白酶-1、-2 蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用

吳一菲曹萍王曉川高飛薛琴

(云南省第一人民醫(yī)院皮膚科，云南昆明650032)

摘要〔〕目的研究308 nm激光聯(lián)合胡椒堿對毛囊外根鞘無色素黑素細(xì)胞(AMMC)黑素合成及酪氨酸酶相關(guān)蛋白酶(TRP)-1、TRP-2 蛋白表達(dá)的影響。方法體外培養(yǎng)的AMMC細(xì)胞分別以聯(lián)合療法組、308 nm激光組、胡椒堿組、陽性對照組及空白對照組作用24、72及120 h，測定黑素含量，激光共聚焦顯微鏡觀察并定量分析熒光染色后細(xì)胞內(nèi)TRP-1、TRP-2的表達(dá)情況。結(jié)果4組均能促進(jìn)AMMC細(xì)胞黑素量生成。聯(lián)合治療組、308 nm激光組、胡椒堿組、陽性對照組均不同程度的促進(jìn)黑素含量的增加，其中以聯(lián)合治療組促進(jìn)作用最強(qiáng)。胡椒堿呈濃度依賴性促進(jìn)黑素合成且作用72 h時(shí)效果最明顯。0.5 mmol/L胡椒堿作用72 h可促進(jìn)表皮黑素細(xì)胞TRP-1表達(dá)，而對TRP- 2的表達(dá)無明顯影響。308 nm激光對TRP-1、TRP-2均有促進(jìn)作用。結(jié)論308 nm激光聯(lián)合胡椒堿能促進(jìn)AMMC細(xì)胞的黑素合成。

關(guān)鍵詞〔〕308 nm激光；胡椒堿；黑素細(xì)胞，無色素；毛囊外根鞘；黑素合成

中圖分類號〔〕R739.5〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項(xiàng)目：云南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2010ZC207)；云南省第一人民醫(yī)院“昆華·奧新”科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014DS003)

通訊作者：王曉川(1978-)，女，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，主要從事色素障礙性皮膚病研究。

第一作者：吳一菲(1968-)，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事色素障礙性皮膚病研究。

308 nm激光聯(lián)合胡椒堿有較強(qiáng)的促黑素合成作用。本文繼續(xù)深入研究聯(lián)合治療組對毛囊外根鞘無色素黑素細(xì)胞(AMMC)黑素合成及酪氨酸酶相關(guān)蛋白酶(TRP)-1、TRP-2 蛋白表達(dá)的影響，并對其可能機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1材料與方法

1.1試劑和儀器二甲基亞砜(DMSO)、胰蛋白酶(均為美國Sigma公司產(chǎn)品)，脫氧膽酸鈉(美國Amersco公司)，RMPI1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，新小牛血清(杭州四季青生物材料有限公司)，其他試劑均為分析純。722分光光度計(jì)(上海精密分析儀器有限公司)，Clinibio 128C酶聯(lián)免疫檢測儀(澳大利亞Clinibio公司)，96孔培養(yǎng)板(美國,Corning公司)。蘑菇酪氨酸酶，左旋多巴(DL-Dopa)購自美國Sigma公司。三蒸水將DL-Dopa配成2.5 ml溶液，蘑菇酪氨酸酶配成25 IU/ml備用。治療儀器為Xtrac巔峰準(zhǔn)分子激光系統(tǒng)(美國photomedex公司)，工作物質(zhì)為氯化氙氣體，產(chǎn)生激光波長為308 nm。

1.2藥品胡椒堿由中國藥品生物檢定所提供，DMSO配制成20 mg/ml的原液，-20℃保存，臨時(shí)用新鮮培養(yǎng)液調(diào)至終濃度為0.1、0.5、1.0 mmol/L。陽性對照藥8-甲氧補(bǔ)骨脂素(8-Mop，江蘇潥陽制藥廠)，以DMSO溶解。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)將首次傳代培養(yǎng)，70%～80%融合狀態(tài)的AMMC作為研究對象。用含10%小牛血清的1640培養(yǎng)基37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，待生長至融合狀態(tài)，以0.25%胰酶和0.02%EDTA消化，錐蟲藍(lán)染色法計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，然后接種至250 ml玻璃培養(yǎng)瓶，接種密度為104/cm2，液體量15 ml/瓶。細(xì)胞接種24 h后，用含藥物的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)孵育72 h后收獲細(xì)胞，計(jì)數(shù)，將細(xì)胞分為2份分別用于黑素含量測定和激光共聚焦熒光定量分析。為減少AMMC細(xì)胞培養(yǎng)基中其他添加成分可能對試驗(yàn)的影響，試驗(yàn)前3 d用不含F(xiàn)CS的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基給細(xì)胞換液1次。

1.3.2實(shí)驗(yàn)分組 分5組。聯(lián)合治療組：308 nm準(zhǔn)分子激光以能量300 mJ/cm2照射并聯(lián)合0.5、1.0、0.1 mmo/L 胡椒堿；308 nm激光組:僅以能量300 mJ/cm2照射AMMC細(xì)胞；胡椒堿組：以0.5、1.0、0.1 mmol/L胡椒堿作用于AMMC細(xì)胞；陽性對照組：308 nm激光(能量參數(shù)同前)聯(lián)合8-Mop(0.1 mmol/L)；空白對照組：僅加入等量相應(yīng)溶媒，不照射。

1.3.3黑素含量測定黑素量的測定參照Ando等〔1〕的方法并加以改良，收獲細(xì)胞，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)(重復(fù)4次取均值)，PBS液洗2次，加入200 μl的雙蒸水使細(xì)胞懸浮，加入1 ml的乙醇、乙醚混合液(1∶1)室溫下放置15 min，然后離心5 min(3000 r/min)，沉淀加入1 mol/L NaOH(含10%DMSO)1 ml，置80℃30 min溶解黑素，加入4 ml雙蒸水將NaOH稀釋成0.2 mol/L，用分光光度計(jì)測定黑素的吸光度(A475 mm)。黑素含量以(藥物處理組A475/細(xì)胞數(shù))/(空白對照組A475/細(xì)胞數(shù))×100來表示。每一實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.3.4激光共聚焦熒光定量分析按照文獻(xiàn)〔2〕的方法,激光共聚焦顯微鏡觀察和熒光定量分析取6孔培養(yǎng)板內(nèi)各組作用3、5、7 d的蓋玻片上的AMMC，PBS 洗3次，每次5 min，浸入4%多聚甲醛液中室溫固定20 min，把蓋玻片的細(xì)胞面朝上置于一張濾紙上，放入有蓋平皿中。用封閉羊血清覆蓋細(xì)胞封閉10 min，以減少蓋玻片上非特異抗體的影響。吸掉封閉羊血清，分別滴加一抗溶液：兔抗人酪氨酸酶抗體(1∶150)、兔抗人TR-P1抗體(1∶150)、兔抗人TRP2抗體(1∶150)，37℃孵育60 min。PBS 沖洗5 min 共3次，加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗溶液(1∶100)，37℃孵育30 min。將蓋玻片在PBS緩沖液中洗3次，用濾紙吸掉周邊水分，每待測樣品加入0.2 ml PBS后，分別置于聯(lián)結(jié)電腦的激光共聚焦顯微鏡下，選擇×40物鏡，×10目鏡，7%濾光片，激發(fā)光波長為488 nm，預(yù)掃描后選定最佳細(xì)胞掃描參數(shù)，鎖定參數(shù)。每個(gè)觀察指標(biāo)選取3個(gè)視野，激光掃描2次后，記錄胞質(zhì)、胞核中的平均熒光強(qiáng)度，存儲所采集的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。本實(shí)驗(yàn)以胞質(zhì)中的平均熒光灰度為判斷TRP1、TRP2表達(dá)的指標(biāo)，選取3個(gè)視野中的10個(gè)細(xì)胞進(jìn)行熒光灰度定量分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS10.0軟件行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1308 nm激光及胡椒堿對AMMC形態(tài)的影響傳代培養(yǎng)的AMMC細(xì)胞呈紡錘形，主要有兩極；細(xì)胞經(jīng)308 nm激光照射及胡椒堿作用后，細(xì)胞胞體增大，樹突增多并延長(圖1)。

2.2不同觀察組對AMMC細(xì)胞黑素合成及酪氨酸相關(guān)蛋白酶的影響表1顯示，聯(lián)合治療組作用最強(qiáng)。胡椒堿能以濃度依賴方式促進(jìn)黑素量增加。其中當(dāng)聯(lián)合治療組胡椒堿濃度為0.5 mmol/L、72 h時(shí)作用最明顯，較陽性對照組8-MOP濃度0.1 mmol/L、作用120 h及空白對照組黑素生成明顯增加(t= 3.50，P<0.05；t=4.32，P<0.01)；陽性對照組在8-MOP濃度為0.1 mmol/L、120 h時(shí)作用最強(qiáng)，較空白對照組黑素含量明顯增加(t=4.45,P<0.01)；激光組作用72 h及120 h時(shí)黑素含量較空白對照組明顯增強(qiáng)(t= 5.62,P<0.01;t= 5.77,P<0.01)；胡椒堿組在濃度為0.5 mmol/L、72 h時(shí)較空白對照黑素含量明顯增加(t=7.52,P<0.01)。對酪氨酸相關(guān)蛋白酶作用結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組在胡椒堿濃度為0.5 mmol/L、72 h時(shí)對TRP-1較陽

組別濃度(mmol/L)黑素含量24h72h120h酪氨酸相關(guān)蛋白酶-1酪氨酸相關(guān)蛋白酶-2聯(lián)合治療組胡椒堿0.5310.13±52.411)2)510.25±12.552)3)487.20±56.332)3)330.77±71.26220.33±11.551.0330.22±10.56430.22±30.12400.00±10.52250.12±35.62220.86±78.960.1336.30±15.27410.05±30.22395.26±37.15230.75±19.22219.33±6.37陽性對照組8-MOP濃度0.1274.18±31.651)375.70±78.252)408.44±15.332)270.88±11.56285.66±11.330.5245.66±10.87347.23±40.32370.33±71.65250.77±13.92230.56±3.23激光組-287.55±89.32330.33±20.882)368.32±15.872)235.55±76.22218.77±6.37胡椒堿組胡椒堿0.5140.56±67.88300.72±11.852)270.10±82.172)158.96±30.2238.75±31.531.0130.57±11.62250.52±81.332)200.77±91.342)102.44±70.5637.33±41.860.1110.11±18.24146.75±15.36178.26±36.141)98.57±30.1236.52±10.57空白對照組100.00±0.00100.00±0.00100.00±0.0041.22±10.5545.12±18.97

空白對照組相應(yīng)值設(shè)定為100%；與空白對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與0.1 mmol/L 8-MOP組比較：3)P<0.05

性對照組及空白對照組有明顯促進(jìn)作用(t=11.43，P<0.05；t=6.34,P<0.01)；對TRP-2較空白對照組比較有明顯差異(t= 9.56，P<0.01)；陽性對照組對TRP-1、TRP-2均有明顯促進(jìn)作用，較空白對照組明顯增高(t=5.23,P<0.01；t=6.52，P<0.01)；激光組對TRP-1、TRP-2較空白對照組有明顯促進(jìn)作用(t=10.64，P<0.05；t=9.32，P<0.01)；0.5 mmol/L胡椒堿作用后AMMC細(xì)胞內(nèi)TRP-1的表達(dá)量較空白對照組高(t=6.34，P<0.01)；對TRP-2表達(dá)無明顯促進(jìn)作用。與空白對照組比較無差異(P>0.05)。見圖1。

圖1　308 nm激光聯(lián)合胡椒堿對AMMC細(xì)胞形態(tài)的影響 (激光共聚焦顯微鏡,×100)

3討論

白癜風(fēng)是最常見的皮膚色素脫失性疾病，嚴(yán)重影響患者容貌。盡管不斷有新療法出現(xiàn)，但整體而言，白癜風(fēng)治療效果仍極不令人滿意，迫切需要新的更有效的治療方案、手段和理論。黑素細(xì)胞(MC)缺失是發(fā)病的關(guān)鍵。MC發(fā)育學(xué)研究已證實(shí)：位于毛囊外根鞘的無色素黑素細(xì)胞是表皮MC的主要來源，在多種因素作用下，休眠狀態(tài)毛囊外根鞘無色素黑素細(xì)胞被活化，經(jīng)過黏附等一系列環(huán)節(jié)遷移到表皮并進(jìn)一步增殖、活化，完成表皮著色過程〔3〕。這一過程也同樣存在于白癜風(fēng)復(fù)色中。臨床現(xiàn)象也支持上述觀點(diǎn)。白癜風(fēng)白斑的復(fù)色往往先起自毛囊口，在毛囊口周圍首先形成色素性皮島，繼而逐漸擴(kuò)大。因此促進(jìn)AMMC的活化、黏附因素對增加白癜風(fēng)皮損區(qū)MC的數(shù)量和功能極為關(guān)鍵。308 nm準(zhǔn)分子激光是近年來出現(xiàn)的治療白癜風(fēng)的一種新型治療方法，其治療的主要光源是由氙原子和氯原子組成的二聚體。其發(fā)出的連續(xù)的脈沖氣體激光，屬UVB波長范圍〔4〕。EL是白癜風(fēng)治療領(lǐng)域最新的手段之一，其有效率高于其他方法已得到國內(nèi)外研究的公認(rèn)〔5〕。但EL作用機(jī)制研究主要集中于它促進(jìn)T細(xì)胞凋亡和干預(yù)角質(zhì)形成細(xì)胞對MC的抑制〔6〕，是否可以直接作用于AMMC細(xì)胞，促進(jìn)黑素生成的作用研究較為缺乏。

整體而言，白癜風(fēng)治療有效率仍不令人滿意〔7〕。胡椒堿具有較強(qiáng)的MC活化作用，是較理想的白癜風(fēng)備選外用藥物。本研究結(jié)果表明：EL及胡椒堿均有促進(jìn)AMMC細(xì)胞活化，黑素形成的作用。其中，胡椒堿呈濃度依賴性，在0.5 mol/L作用72 h對黑素量生成影響作用最強(qiáng)，這與馬慧軍等〔8〕結(jié)論一致。

黑素細(xì)胞合成黑素是一種多步驟多酶參與的復(fù)雜過程。酪氨酸酶是黑素合成中最為關(guān)鍵的一種限速酶，許多種藥物都是通過上調(diào)該酶的生物合成或?qū)υ撁傅姆肿咏Y(jié)構(gòu)進(jìn)行翻譯后的重修飾，增強(qiáng)其生物學(xué)活性來發(fā)揮作用的〔9〕。TRP-1和TRP-2同屬于酪氨酸酶基因超家族成員，二者催化黑素生化合成過程中的后續(xù)步驟，在黑素細(xì)胞內(nèi)它們與酪氨酸酶一起以多酶復(fù)合體形式存在，并對該復(fù)合體起穩(wěn)定作用。 TRP-1催化活性較弱，研究發(fā)現(xiàn)TRP-1 mRNA 只在含有優(yōu)黑素的細(xì)胞中出現(xiàn),表明TRP-1在優(yōu)黑素生成過程中具有重要作用〔10〕。TRP-2功能是催化多巴色素轉(zhuǎn)變?yōu)?、6-二羥基吲哚-2-羧酸(DHICA),控制著DHICA/DHI的比例,具有加速黑素生成作用。激光共聚焦定量分析熒光染色后的AMMC細(xì)胞TRP-1和TRP-2的表達(dá)發(fā)現(xiàn)胡椒堿作用后TRP-1的表達(dá)量較空白對照高，而TRP-2的表達(dá)量與空白對照組無差異，這與馬慧軍等〔11〕所作觀察結(jié)論一致。提示胡椒堿的促表皮黑素細(xì)胞黑素合成的作用可能通過上調(diào)TRP-1的表達(dá)發(fā)揮作用而與TRP-2無明顯關(guān)系。由于TRP-1主要與優(yōu)黑素的生成密切相關(guān)，我們推測胡椒堿可能主要促進(jìn)了黑素細(xì)胞中優(yōu)黑素的合成。另外，觀察結(jié)果顯示，EL對TRP-1、TRP-2均有促進(jìn)作用，對黑素合成有明顯促進(jìn)作用。

本研究明確了EL對AMMC細(xì)胞直接的活化和促進(jìn)黑素生成的作用，為今后的進(jìn)一步研究提供了更好的理論基礎(chǔ)。

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〔2014-04-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)