八月札水提物對(duì)H22肝癌荷瘤鼠免疫功能的影響

八月札水提物對(duì)H22肝癌荷瘤鼠免疫功能的影響

白雪關(guān)寶生孫艷男張麗穎紀(jì)漢庭張濤

(佳木斯大學(xué)，黑龍江佳木斯154007)

摘要〔〕目的探討八月札水提物對(duì)H22肝癌荷瘤鼠免疫功能的影響及其對(duì)化療藥物環(huán)磷酰胺(CTX)的增效減毒作用。方法通過計(jì)算腫瘤抑制率和胸腺(脾)重量指數(shù)以及應(yīng)用放射免疫法(RIA)檢測(cè)H22荷瘤鼠血清中腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細(xì)胞介素(IL)-2水平，觀察八月札水提物對(duì)H22荷瘤鼠免疫功能的影響及其對(duì)化療藥物CTX的增效減毒效果。結(jié)果CTX組、水提低組、水提高組、聯(lián)合用藥組與陰性對(duì)照組比較，荷瘤鼠腫瘤重量明顯降低，腫瘤組織生長的抑制率分別為44.0%、36.4%、38.0%、58.4%和60.0%；而且八月札水提組及聯(lián)合用藥組小鼠存活數(shù)量明顯高于CTX組；CTX組、水提低組、水提高組、聯(lián)合用藥組與陰性對(duì)照組比較，能夠顯著降低H22荷瘤鼠胸腺、脾重量指數(shù)；CTX組、水提低組、水提高組、聯(lián)合用藥組與陰性對(duì)照組比較，顯著提高荷瘤鼠血清中IL-2和TNF-α水平。結(jié)論八月札水提物對(duì)H22荷瘤鼠腫瘤生長有顯著抑制作用，能夠顯著提高荷瘤鼠血清中TNF-α和IL-2水平；同時(shí)，八月札水提物與CTX聯(lián)合應(yīng)用對(duì)荷瘤鼠血清中TNF-α和IL-2的提高效果更為明顯，明顯優(yōu)于單獨(dú)CTX組，推測(cè)八月札對(duì)CTX存在增效、減毒作用。

關(guān)鍵詞〔〕八月札；H22荷瘤鼠；白細(xì)胞介素；腫瘤壞死因子；胸腺(脾)重量指數(shù)

中圖分類號(hào)〔〕Q786〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：黑龍江省自然科學(xué)

通訊作者：張濤(1964-)，女，教授，博士，主要從事中藥抗腫瘤研究。

第一作者：白雪(1982-)，女，講師，博士，主要從事中藥抗腫瘤和痛風(fēng)病因?qū)W研究。

八月札又名預(yù)知子〔1〕，俗稱野香蕉，是一種無毒副作用的野生佳果，又是一種名貴的藥材，其種子、莖、葉、根均可入藥?！犊拱┲兴幋筠o典》中記載八月札對(duì)抗炎、抗腫瘤等方面有較好的治療作用。本研究通過建立體內(nèi)H22荷瘤鼠動(dòng)物模型，采用蘇木素-伊紅(HE)染色法、免疫組化法和放射免疫法探討八月札水提取物對(duì)H22荷瘤鼠的抗腫瘤作用及其對(duì)化療藥物的增效、減毒作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康昆明種小鼠95只，雌雄各半(5周齡，體重18~22 g)，由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)：SYXK黑20030014)，室溫環(huán)境中顆粒飼料分籠飼養(yǎng)，自由飲水，定期進(jìn)行紫外線消毒。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑八月札購自佳木斯大學(xué)中醫(yī)藥研究所，腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-2放射免疫試劑盒購于北京福瑞生物工程公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組共分成6組，每組15只，陰性對(duì)照組、環(huán)磷酰胺(CTX)陽性對(duì)照組(CTX組)、八月札水提低組(19.5 g·kg-1·d-1)、八月札水提高組(39 g·kg-1·d-1)、八月札水提低+CTX組、八月札水提高+ CTX組。

1.2.2腫瘤接種和八月札水提物的制備參照文獻(xiàn)〔2〕。

1.2.3接種實(shí)體瘤動(dòng)物的給藥方法腫瘤接種后24 h，各組開始給藥，連續(xù)給藥12 d，隔日稱體重1次，停藥次日摘眼球取血，處死動(dòng)物取瘤塊、胸腺、脾臟、肝臟和腎臟并稱重，計(jì)算腫瘤抑制率、胸腺和脾重量指數(shù)及增長率；腫瘤抑制率反映八月札提取物對(duì)腫瘤生長的抑制情況，胸腺、脾重量指數(shù)及增長率初步評(píng)估八月札提取物對(duì)小鼠免疫器官的影響。

1.2.4指標(biāo)觀察腫瘤抑制率(%)=(1-給藥組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重)×100%；胸腺(脾)重量指數(shù)(mg/10 g)=胸腺(脾)重量/去瘤鼠重量×100%

1.2.5肝腎組織病理檢測(cè)取各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肝臟和腎臟組織，用4℃磷酸緩沖液(PBS)(0.01 mmol/L,pH=7.3)清洗組織上的血液，后將肝臟和腎臟縱剖置于10%甲醛中固定，石蠟包埋，切片，用HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.6小鼠血清中IL-2、TNF-α含量測(cè)定小鼠摘眼球取血，離心分離血清備用。IL-2和TNF-α的檢測(cè)按放射免疫法(RIA)試劑盒說明書，γ-計(jì)數(shù)器檢測(cè)放射性。自動(dòng)γ-計(jì)數(shù)器預(yù)先編制程序，直接給出有關(guān)參數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品濃度。

2結(jié)果

2.1八月札水提物對(duì)H22荷瘤鼠的腫瘤抑制率水提低組、水提高組、聯(lián)合用藥組與CTX組比較，聯(lián)合用藥組荷瘤鼠的腫瘤重量明顯降低，腫瘤抑制率顯著高于CTX組；聯(lián)合用藥組與水提低組比較，荷瘤鼠腫瘤重量明顯降低，腫瘤抑制率顯著高于水提低組；而且八月札水提組及聯(lián)合用藥組小鼠存活數(shù)量明顯高于CTX組。見表1。

2.2八月札水提物對(duì)H22荷瘤鼠胸腺和脾重量指數(shù)的影響CTX組、水提低組、水提高組、聯(lián)合用藥組與陰性對(duì)照組比較，能夠顯著降低荷瘤鼠胸腺、脾重量指數(shù)；水提低組、水提高組、聯(lián)合用藥組與CTX組比較，聯(lián)合用藥組顯著提高荷瘤鼠胸腺、脾重量指數(shù)；聯(lián)合用藥組與水提低組比較，能夠顯著降低荷瘤鼠胸腺、脾重量指數(shù)。見表2。

2.3八月札水提組、CTX和聯(lián)合用藥組對(duì)H22荷瘤鼠腎臟和肝臟的毒性作用

2.3.1八月札水提組對(duì)荷瘤鼠腎臟和肝臟的毒性作用觀察

表1　八月札水提物對(duì)H22荷瘤鼠的腫瘤抑制率 ± s)

與陰性對(duì)照組比較：1)P<0.05；2)P<0.01；與CTX組比較：3)P<0.05；4)P<0.01；與水提低組比較：5)P<0.01；下表同

表2　八月札水提物對(duì)H22荷瘤鼠胸腺和

八月札水提低組、水提高組小鼠腎臟和肝臟，外觀呈鮮紅色，表面光滑，大小正常，質(zhì)地均勻。組織學(xué)觀察顯示，腎小球血管球與球囊界限清楚，近曲小管界限清晰，上皮輕度水腫；肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞條索排列規(guī)整，圍繞中央靜脈呈現(xiàn)放射狀排列，大體和顯微鏡下觀察均未發(fā)現(xiàn)明顯的病理學(xué)改變。見圖1。

2.3.2CTX對(duì)荷瘤鼠腎臟和肝臟的毒性作用觀察CTX組小鼠腎臟和肝臟，外觀呈鮮紅色，表面光滑，大小正常，質(zhì)地均勻。組織學(xué)觀察顯示，腎小球球囊腔變小，血管球與球囊界限不清楚，腎小球周圍近曲小管上皮細(xì)胞水腫，管壁增厚，管腔不規(guī)則，間質(zhì)有少許炎細(xì)胞；肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞排列不規(guī)則，肝細(xì)胞水腫，胞漿疏松化，氣球樣變性；顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)明顯的病理學(xué)改變。見圖1。

2.3.3八月札與CTX聯(lián)合用藥對(duì)荷瘤鼠腎臟和肝臟毒性作用的影響觀察八月札與CTX聯(lián)合用藥組小鼠腎臟和肝臟的外觀呈鮮紅色，表面光滑，大小正常，質(zhì)地均勻。組織學(xué)觀察顯示，腎小球體積輕度增大，血管球與球囊界限清楚，腎小球周圍近曲小管上皮細(xì)胞輕度水腫，管壁輕度增厚，管腔不規(guī)則，間質(zhì)有少許炎細(xì)胞；肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞條索排列規(guī)整，圍繞中央靜脈呈現(xiàn)放射狀排列，肝細(xì)胞輕度水腫；顯微鏡下觀察可見輕微的病理學(xué)改變。見圖1。

八月札水提組

CTX組

聯(lián)合用藥組

2.4八月札水提物對(duì)H22荷瘤鼠血清IL-2和TNF-α含量的影響CTX組、水提低組、水提高組、聯(lián)合用藥組與陰性對(duì)照組比較，顯著提高荷瘤鼠血清中IL-2和TNF-α水平；水提低組、水提高組、聯(lián)合用藥組與CTX組比較，聯(lián)合用藥組能夠顯著提高荷瘤鼠血清中IL-2和TNF-α水平；聯(lián)合用藥組與水提低組比較，顯著提高荷瘤鼠血清中IL-2和TNF-α水平。見表3。

表3　八月札水提物對(duì)H22荷瘤鼠血清IL-2和

3討論

八月札是一種名貴的藥材，主要成分為三萜或三萜皂苷，根據(jù)“抗癌中藥大辭典”中的記載，其對(duì)消化系統(tǒng)腫瘤和乳腺癌有較好的治療作用，但是在國內(nèi)外對(duì)其研究還僅限于化學(xué)成分，抗腫瘤作用研究的報(bào)道相對(duì)較少。

胸腺是哺乳動(dòng)物的中樞免疫器官，接受來自骨髓的淋巴干細(xì)胞在此發(fā)育分化為成熟的T淋巴細(xì)胞，并遷移至外周淋巴器官〔3〕。胸腺是免疫細(xì)胞產(chǎn)生、發(fā)育、接受抗原刺激、分化和成熟的重要場(chǎng)所；胸腺的大小、結(jié)構(gòu)與年齡相關(guān)，其重量大小在一定程度上反映了機(jī)體免疫細(xì)胞的數(shù)量和能力。胸腺能夠分泌多種細(xì)胞因子，具有促進(jìn)T細(xì)胞成熟的能力，在建立機(jī)體自身免疫耐受和維持免疫自穩(wěn)方面發(fā)揮著重要作用。脾臟是機(jī)體外周免疫器官，體內(nèi)最大的淋巴器官，富含脾淋巴細(xì)胞，尤其是T和B淋巴細(xì)胞，是合成免疫活性物質(zhì)的重要場(chǎng)所。研究中常用胸腺(脾)重量指數(shù)的改變來反映機(jī)體免疫功能的狀態(tài)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示八月札具有提高荷瘤鼠免疫功能的作用，而不是直接通過促使荷瘤鼠胸腺、脾臟代償性增大來提高免疫力從而抑制腫瘤的生長的。

CTX是目前應(yīng)用比較廣泛的一類抗癌化療藥物，其毒副作用主要表現(xiàn)為機(jī)體的免疫抑制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示八月札具有提高荷瘤鼠免疫功能的作用，而且較好地保持CTX的化療效果，八月札與CTX聯(lián)合應(yīng)用可降低CTX化療后的毒副反應(yīng)。

八月札為木通科木通屬植物木通、三葉木通和白木通成熟果實(shí)的總稱。其主要成分為三萜或三萜皂苷。八月札既是一種野生佳果，無毒副作用，又是一種名貴的藥材，并用于各種營養(yǎng)品和化妝品中，其種子、莖、葉、根亦可入藥，在公元八世紀(jì)左右陳士良所著的《食性本草》著作中就有記載〔4〕。民間多用于治小便赤澀、淋濁、水腫、胸中煩熱、喉痹咽痛、遍身拘痛、婦女經(jīng)閉、乳汁不通等疾病，具有抗癌、抗腫瘤、抗炎、抗菌、利尿、止痛、抗風(fēng)濕等功效〔5〕。

TNF-α是一種由細(xì)菌脂多糖活化的單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，在內(nèi)毒素性休克、炎癥、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞增生、細(xì)胞毒活性和抗病毒中起著重要作用，可以引起腫瘤組織出血壞死。TNF-α通過與靶細(xì)胞膜上TNF-R結(jié)合，實(shí)現(xiàn)其促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)功能。TNF-α的大多數(shù)生物活性是通過與TNF-R1結(jié)合完成的〔6~8〕，TNF-R1可通過激活半胱天冬酶和核因子-κB活性介導(dǎo)凋亡，引起炎性因子、趨化因子以及抗凋亡蛋白的轉(zhuǎn)錄。TNF-R存在于多種正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞表面，當(dāng)TNF-α與靶細(xì)胞膜上TNF-R的胞外區(qū)結(jié)合，引發(fā)不同的下游信號(hào)通路，促使腫瘤細(xì)胞程序性凋亡。TNF-α是迄今為止發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤作用最強(qiáng)的細(xì)胞因子，它能特異性地直接殺傷腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常細(xì)胞無不良影響，能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并促使其溶解，還可以激活機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。本研究結(jié)果提示八月札的抑制腫瘤作用可能是通過提高荷瘤鼠血清TNF-α水平進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的變性壞死，達(dá)到阻止其生長的作用。另外八月札與CTX聯(lián)合應(yīng)用對(duì)荷瘤鼠血清TNF-α水平的影響更為顯著，推測(cè)八月札對(duì)CTX存在增效、減毒作用。

腫瘤免疫主要是由細(xì)胞免疫來實(shí)現(xiàn)的，機(jī)體的細(xì)胞免疫功能主要有T淋巴細(xì)胞控制。IL-2能促進(jìn)活化T細(xì)胞、T輔助細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞等免疫效應(yīng)細(xì)胞的增殖、分化和細(xì)胞因子產(chǎn)生，增強(qiáng)NK和拉克細(xì)胞(LAK)的殺傷活性，促進(jìn)B細(xì)胞增殖、分化和抗體分泌，并能在體外誘導(dǎo)活化LAK細(xì)胞和腫瘤浸潤淋巴(TIL)細(xì)胞。而LAK細(xì)胞被證明能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，具有強(qiáng)大的抗腫瘤作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示八月札抗H22肝癌細(xì)胞可能通過IL-2發(fā)揮作用。另外八月札與CTX聯(lián)合用藥對(duì)荷瘤鼠血清IL-2含量的影響更為顯著，推測(cè)八月札對(duì)CTX存在增效、減毒作用。

4參考文獻(xiàn)

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2白雪,關(guān)寶生,魏曉東,等.八月札水提物對(duì)H22荷瘤鼠血清總抗氧化能力、超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量的影響〔J〕.社區(qū)醫(yī)學(xué)雜志,2010;8(11):4-5.

3Rothenberg EV,Moore JE,Yui MA.Launching the T-cell-lineage developmental programme〔J〕.Nature Rev Immunol,2008;8(1):9-21.

4江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典(上)〔M〕.上海:上?？萍汲霭嫔?1977：19.

5宋立人,洪恂,丁渚亮,等.現(xiàn)代中藥學(xué)大詞典(Ⅱ)〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社,2001:335-7.

6Schwabe RF,Brenner DA.Mechanisms of liver injury.I.TNF-alpha-induced liver injury:role of IKK,JNK,and ROS pathways〔J〕.Am J Phys Gastrointest Liver Physiol,2006;290(4):583-9.

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8楊季云,張思仲,郭紅,等.腫瘤壞死因子-α通過激活NF-кB信號(hào)通路加快肝細(xì)胞周期進(jìn)程〔J〕.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2007;34(6):604-10.

〔2014-03-19修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)