人乳頭瘤病毒液態(tài)芯片基因分型和人乳頭瘤病毒E6/E7mRNA檢測(cè)的應(yīng)用比較

人乳頭瘤病毒液態(tài)芯片基因分型和人乳頭瘤病毒E6/E7 mRNA檢測(cè)的應(yīng)用比較

陳勇周華蓉1黃玉秀2劉燦王文華陳永東馬躍飛

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建福州350005)

摘要〔〕目的研究人乳頭瘤病毒(HPV)液態(tài)芯片基因分型與HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)在宮頸癌早期篩查、預(yù)后、治療中的應(yīng)用。方法對(duì)680例患者進(jìn)行HPV基因分型及E6/E7 mRNA檢測(cè)，評(píng)價(jià)這兩種方法對(duì)宮頸癌早期診斷、病變程度的效能。結(jié)果HPV液態(tài)芯片基因分型陽(yáng)性檢出率為79.6%，HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)陽(yáng)性檢出率為35.3%，兩種方法陽(yáng)性檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在3個(gè)宮頸病理細(xì)胞學(xué)分級(jí)中，HPV液態(tài)芯片基因分型與HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的陽(yáng)性檢出率、敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論宮頸癌篩查中，結(jié)合HPV液態(tài)芯片基因分型和HPV E6/E7mRNA檢測(cè)對(duì)臨床診療、疾病預(yù)后具有很好的價(jià)值。

關(guān)鍵詞〔〕宮頸腫瘤；DNA；mRNA；人乳頭狀病毒；芯片分析技術(shù)

中圖分類號(hào)〔〕R737.33〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：福建省教育廳科技項(xiàng)目(JA10145)；福建省衛(wèi)生廳青年科研課題(2010-1-18)

1福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院血液科

2福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科

第一作者：陳勇(1977-)，男，副主任技師，碩士，主要從事分子生物學(xué)臨床診斷及法醫(yī)學(xué)鑒定研究。

宮頸癌是目前女性最常見的惡性腫瘤之一，近年來(lái)其發(fā)生率有明顯上升和年輕化的趨勢(shì)〔1〕。現(xiàn)研究已表明，人乳頭瘤病毒(HPV)是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的重要因素，在99.8%的宮頸癌患者中均可檢測(cè)到不同類別的HPV DNA〔2〕。迄今，已發(fā)現(xiàn)100多種HPV型，其中只有少數(shù)高危型的HPV易引起宮頸癌，高危型HPV(如HPV-16、18、31)與生殖道感染有關(guān)并且可以通過基因組整合入宿主細(xì)胞染色體中，引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，從而使生殖系統(tǒng)癌變。HPV基因組的早期區(qū)編碼干擾細(xì)胞周期調(diào)控的E6/E7癌蛋白，高危型HPV的E6/E7癌蛋白能夠與宿主細(xì)胞靶向結(jié)合，并與轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)。E6蛋白通過泛素途徑降解p53，因此在DNA受損傷時(shí)不能誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或凋亡。E7結(jié)合pRB，p107，和p130，并使其降解，同時(shí)阻止Mi2組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶，誘導(dǎo)C-Myc，抑制TGFβ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 HPV E6/E7的重要性已被人們所公認(rèn)，通過HPV E6/E7 mRNA的定量檢測(cè)可直觀地了解宮頸細(xì)胞中HPV致癌基因表達(dá)的情況，為治療、預(yù)后提供可靠的評(píng)估工具。

1資料與方法

1.1研究對(duì)象收集2010年10月至2011年12月在我院婦產(chǎn)科門診及住院期間，因?qū)m頸炎癥、白帶異常、陰道異常出血等原因就診，并自愿接受宮頸細(xì)胞學(xué)檢查、HPV DNA和mRNA檢測(cè)及宮頸組織病理檢查的婦女共680例，平均年齡為(39.5±13.4)歲，并對(duì)以上患者進(jìn)行跟蹤隨訪。

1.2方法

1.2.1樣本采集使用窺陰器暴露宮頸，用新柏式公司的ThinPrep采樣器置于宮頸口，逆時(shí)針方向轉(zhuǎn)3圈，停留15 s，并存儲(chǔ)專用的標(biāo)本瓶中，4℃保存1 w內(nèi)檢測(cè)完畢。

1.2.2液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)使用新柏氏液基細(xì)胞學(xué)檢查系統(tǒng)對(duì)待檢樣本進(jìn)行檢測(cè)。

細(xì)胞學(xué)標(biāo)本使用2001年貝塞斯達(dá)(Bethesda)報(bào)告系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)〔3〕：①未見上皮內(nèi)病變/惡性細(xì)胞(NILM)；②意義不明的非典型鱗狀上皮細(xì)胞(ASC-US)；③低度鱗狀上皮內(nèi)病變(L-SIL)；④高度鱗狀上皮內(nèi)病變(H-SIL)。少數(shù)ASC-H結(jié)果報(bào)告在H-SIL，而不典型腺細(xì)胞(AGC)報(bào)告一起入ASC-US組。

1.2.3HPV液態(tài)芯片基因分型使用上海透景公司的HPV分型檢測(cè)試劑盒，該試劑盒可以檢測(cè)26種HPV亞型，其中高危型19種分別為HPV 16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、55、56、58、59、66、68、82、83；低危型7種分別為：6、11、40、42、44、61、73。使用美國(guó)Luminex公司最新一代的標(biāo)準(zhǔn)化高通量檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)Luminex 200流式熒光平臺(tái)，采用專利的流式熒光技術(shù)，同時(shí)檢測(cè)26種HPV亞型，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，所得到的數(shù)據(jù)經(jīng)軟件分析后可以直接判斷結(jié)果。

1.2.4HPV E6/E7 mRNA定量檢測(cè)使用美國(guó)IncellDx公司的 HPV OncoTect E6/E7 mRNA檢測(cè)試劑盒，可以一次性檢出13種高危型HPV型別的mRNA，分別為：HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型。取1 ml儲(chǔ)存于ThinPrep儲(chǔ)存液中的宮頸細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，將細(xì)胞離心沉淀和洗滌1次，在磷酸鹽緩沖液(PBS)中，pH值7.4，將細(xì)胞固定和透化在環(huán)境溫度下1 h。隨著固定和透化，將細(xì)胞洗滌2次，并沉淀離心。用針對(duì)13種高危型HPV的E6/E7全長(zhǎng)的mRNA 的寡核苷酸探針進(jìn)行原位雜交，然后將細(xì)胞重新懸浮在2%胎牛血清PBS中，使用IncellDx Goldfish流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，所得到的數(shù)據(jù)經(jīng)軟件分析后直接判讀結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0軟件行χ2檢驗(yàn)，并計(jì)算HPV液態(tài)芯片基因分型與HPV E6/E7 mRNA的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值。

2結(jié)果

2.1HPV液態(tài)芯片基因分型和HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)HPV液態(tài)芯片基因分型的陽(yáng)性率為79.6%(541/680)，HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的陽(yáng)性率為35.3%(240/680)。兩者差異顯著(χ2=296，P<0.05)。

2.2兩種方法對(duì)宮頸細(xì)胞學(xué)檢測(cè)的意義對(duì)680例樣本按細(xì)胞學(xué)分類進(jìn)行分級(jí)，其中細(xì)胞學(xué)有異常的樣本共640例，對(duì)細(xì)胞學(xué)有異常的患者隨訪，根據(jù)陰道鏡及病理結(jié)果對(duì)HPV液態(tài)芯片基因分型和HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的結(jié)果比較，其陽(yáng)性率、敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值見表1。

2.3兩種方法在不同階段對(duì)宮頸癌篩查的臨床應(yīng)用根據(jù)美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)2011.1版的宮頸癌臨床實(shí)踐指南，結(jié)合本研究HPV液態(tài)基因芯片和HPV E6/E7mRNA檢測(cè)分析結(jié)果，可建立以下臨床診療圖譜，對(duì)臨床的診療及預(yù)后防治具有較好的價(jià)值。見圖1。

表1　HPV液態(tài)芯片基因分型和HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)在細(xì)胞學(xué)異常的不同階段的檢測(cè)準(zhǔn)確性分析

圖1　HPV DNA分型與HPV mRNA檢測(cè)在不同階段對(duì) 宮頸癌篩查的臨床應(yīng)用

3討論

HPV是最小的DNA病毒，也是人類癌瘤發(fā)病中唯一可以完全確認(rèn)的致癌病毒。依據(jù)HPV型別與癌發(fā)生危險(xiǎn)性的高低分為低危型HPV和高危型HPV。低危型HPV如HPV6，11，42，43，44等，常引起外生殖器濕疣等良性病變，高危型HPV如HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68等，與宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)的發(fā)生相關(guān)，但并不是所有的HPV 感染者都會(huì)進(jìn)展為宮頸癌，在30歲以下(18~28歲)性生活活躍的年輕婦女中HPV感染機(jī)會(huì)在4%~15%，終身積累概率達(dá)60%以上，而多數(shù)的感染是“一過性”的，只是一種“一過性HPV攜帶狀態(tài)”，即多數(shù)女性可自行清除，平均時(shí)間是8個(gè)月〔4〕，只有持續(xù)的HPV感染才會(huì)發(fā)生CIN或?qū)m頸癌，一般平均8~24個(gè)月可發(fā)生CIN，再平均8~12年可發(fā)生浸潤(rùn)癌。HPV能否被消除，是否促成宮頸癌取決于：HPV的型別只有持續(xù)的高危型HPV感染才可能造成宮頸癌 宿主的免疫功能患者的產(chǎn)次、激素影響、營(yíng)養(yǎng)狀況等其他性行為因素、性傳播疾病(STD)、重復(fù)HPV感染等。

本研究中HPV液態(tài)芯片檢測(cè)在宮頸癌篩查中顯示了較高的陽(yáng)性率，其陽(yáng)性率為79.6%，與相關(guān)的文獻(xiàn)基本相符〔5〕，可能是由于液態(tài)芯片分型基本涵蓋了中國(guó)人常見的HPV亞型，再加上檢測(cè)方法的靈敏度比較高，因而其能作為宮頸癌基本篩查的檢測(cè)手段，但HPV DNA檢測(cè)陽(yáng)性只能反映HPV存在與否，并且大多數(shù)婦女感染只是一過性的，只有高危型的HPV持續(xù)感染才可能導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生，過高的陽(yáng)性率反而會(huì)增加患者的心理負(fù)擔(dān)，因此若結(jié)合HPV mRNA檢測(cè)，就更能綜合地判斷患者的HPV感染綜合水平，這是由于HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)更能反映HPV感染后致癌蛋白是否表達(dá)，其對(duì)臨床療效對(duì)比，疾病的預(yù)后具有重要意義。

本研究中顯示，2種方法在診斷的陽(yáng)性率上都隨著3個(gè)病理分級(jí)的增高而增高，但HPV液態(tài)芯片基因分型陽(yáng)性率增高的比較明顯，因此其在宮頸癌普查上具有重要的意義；在診斷的敏感性上，2種方法均具有較高的敏感性，但隨著病理級(jí)別的增高沒有明顯的改變，因此這兩種方法都可以用于宮頸癌篩查，而除了在ASC-US分級(jí)上兩種方法沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，其他以上分級(jí)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在診斷的特異性上，HPV液態(tài)芯片基因分型檢測(cè)隨著病理分級(jí)的增高而降低，相反，HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)則隨著病理分級(jí)的增高而增高，2種方法在病理分級(jí)的3個(gè)階段均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此可以認(rèn)為HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)對(duì)宮頸癌早期篩查具有較高的特異性，這主要是由于HPV E6/E7 mRNA更能反映HPV在細(xì)胞內(nèi)是否表達(dá)，以及表達(dá)的量；在陽(yáng)性預(yù)測(cè)值上，HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的結(jié)果均大于HPV液態(tài)芯片基因分型，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有差異，這與相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道相符〔6〕。

在本研究中HPV E6/E7 mRNA的檢測(cè)顯示比HPV DNA檢測(cè)更高的特異性，當(dāng)用作分流篩查中，其測(cè)定能大大減少了陰道鏡的轉(zhuǎn)診檢查，提高檢測(cè)的效率。本研究結(jié)果顯示這兩種檢測(cè)方法的陰性預(yù)測(cè)值較為接近，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值HPV mRNA定量檢測(cè)高于HPV液態(tài)芯片分型，可以避免臨床不必要的陰道鏡檢查，給臨床醫(yī)生提供更有價(jià)值的檢測(cè)結(jié)果，可以指導(dǎo)臨床用藥及效果對(duì)比，有助于改善患者的診療質(zhì)量。本研究通過分析兩種方法的臨床比較研究，結(jié)合NCCN2011.1版的宮頸癌臨床實(shí)踐指南，建立適合于我國(guó)的宮頸癌篩查指南，為臨床提供更為有效的篩查方法，對(duì)降低宮頸癌的發(fā)病率、死亡率提供更為有效的手段。

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〔2013-09-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)