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    米諾環(huán)素保護(hù)大鼠缺血再灌注損傷腦作用的時(shí)間窗

    2015-12-30 07:38:07熊建忠,易飛,揭文妙
    中國老年學(xué)雜志 2015年7期

    米諾環(huán)素保護(hù)大鼠缺血再灌注損傷腦作用的時(shí)間窗

    熊建忠易飛揭文妙

    (萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,江西萍鄉(xiāng)337000)

    摘要〔〕目的觀察米諾環(huán)素對(duì)大鼠腦缺血再灌注后損傷的腦保護(hù)作用的時(shí)間窗。方法72只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、生理鹽水組、預(yù)處理組、30 min組、4 h組及12 h組,每組12只。采用線栓法制作大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型。用免疫組織化學(xué)法、放射免疫法、RT-PCR、Hoechst染色評(píng)估腦缺血再灌注損傷后環(huán)氧化酶(COX)-2、前列腺素(PG)E2、白細(xì)胞介素-1β轉(zhuǎn)化酶(ICE)的表達(dá)及細(xì)胞凋亡的情況。用核磁共振DWI掃描及增強(qiáng)掃描觀察各組大鼠細(xì)胞性腦水腫及血管源性腦水腫情況。結(jié)果預(yù)處理組、30 min組、4 h組能明顯抑制缺血再灌注后COX-2、PGE2、ICE的表達(dá),減輕細(xì)胞及血管源性腦水腫,抑制細(xì)胞凋亡。12 h組對(duì)腦缺血再灌注后COX-2、PGE2、ICE的表達(dá),細(xì)胞及血管源性腦水腫及細(xì)胞凋亡無明顯抑制作用。結(jié)論米諾環(huán)素對(duì)腦缺血再灌注后腦損傷的保護(hù)作用有一定的時(shí)間窗。

    關(guān)鍵詞〔〕米諾環(huán)素;缺血再灌注;腦保護(hù);時(shí)間窗

    中圖分類號(hào)〔〕R741〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

    基金項(xiàng)目:江西省科技計(jì)劃支撐項(xiàng)目(SBB01800)

    第一作者:熊建忠(1974-),男,博士,副主任醫(yī)師,主要從事腦血管疾病研究。

    腦血管病致死致殘率非常高,缺血性腦血管病占腦血管病的70%左右。對(duì)于缺血性腦血管病目前尚無有效的治療手段。盡管有許多藥物在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)有神經(jīng)保護(hù)作用,但在臨床中試驗(yàn)卻以失敗告終。臨床試驗(yàn)失敗的原因不是毒副作用太大,就是治療時(shí)間窗太窄。因此廣大學(xué)者一直在尋找一種治療效果好,副作用少的神經(jīng)保護(hù)藥。腦缺血再灌注后立即出現(xiàn)炎癥反應(yīng),腦水腫及細(xì)胞凋亡。因此如能抑制缺血后炎性反應(yīng),腦水腫及細(xì)胞凋亡將對(duì)缺血性腦損傷起到非常好的腦保護(hù)作用。米諾環(huán)素(MC)是一種半合成的第二代四環(huán)素衍生物。對(duì)革蘭陽性及革蘭陰性球菌等都有較好的抗菌作用。米諾環(huán)素較其他四環(huán)素類藥物具有較高親脂性,容易透過血腦屏障到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)。因而在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中發(fā)揮重要作用。最近在中樞神經(jīng)系統(tǒng)動(dòng)物模型中的研究表明MC具有抗炎、抗凋亡、抗氧化等神經(jīng)保護(hù)作用。本課題采用線栓法制作大鼠局灶性腦缺血再灌注模型,術(shù)后不同時(shí)段給大鼠腹腔注射MC,用免疫組織化學(xué)法、放射免疫法、RT-PCR、Hoechst染色評(píng)估腦缺血再灌注損傷后環(huán)氧化酶(COX)-2、前列腺素(PG)E2、白細(xì)胞介素-1β轉(zhuǎn)化酶(ICE)的表達(dá)及細(xì)胞凋亡的情況,采用核磁共振DWI掃描及增強(qiáng)掃描觀察各組大鼠腦水腫情況,探討其對(duì)腦缺血再灌注損傷后腦保護(hù)作用及時(shí)間窗。

    1材料與方法

    1.1材料雄性SD大鼠,體重250~300 g,中南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。MC:中國惠式制藥有公司(批號(hào):0812080)。ICE引物,上海生物工程技術(shù)有限公司合成。COX2檢測(cè)試劑盒:廣州森達(dá)生物科技公司。Hoechst33258液:上海碧云天生物技術(shù)有限公司。PGE2放射免疫試劑盒:北京華英生物技術(shù)有限公司。1.5T高場(chǎng)核磁共振:美國GE公司。熒光顯微鏡:日本Nikon公司。

    1.2動(dòng)物分組將72只雄性 SD大鼠隨機(jī)分為6組 ,每組12只 ,即假手術(shù)組(術(shù)后30 min腹腔注射MC 45 mg/kg),生理鹽水組(大鼠缺血后 30 min腹腔注射生理鹽水),預(yù)處理組(大鼠缺血前12 h腹腔注射MC 45 mg/kg),30 min組(大鼠缺血后30 min腹腔注射MC 45 mg/kg),4 h組(大鼠缺血后4 h腹腔注射MC 45 mg/kg),12 h組(大鼠腦缺血后12 h腹腔注射MC45 mg/kg)。

    1.3模型的制備采用改良的Zea Longa線栓法建立右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞再通模型,于缺血1.5 h后拔出線栓,形成腦缺血再灌注。假手術(shù)組(線栓插入深度為10 mm,不造成腦缺血)其余處理相同。

    1.4核磁共振掃描采用GE1.5T超導(dǎo)MR成像設(shè)備,3英寸環(huán)形表面線圈為接收線圈。大鼠缺血再灌注24 h后核磁共振掃描。掃描參數(shù):DWI:TR/TE/NEX =4 975/103/16,T1WI:TR/TE/NEX=1 835/12.4/6。增強(qiáng)掃描時(shí)從股靜脈留置針靜緩慢注入Gd-DTPA(0.2 mmol/kg)。注藥后10 min進(jìn)行增強(qiáng)掃描。磁共振成像(MRI)原始數(shù)據(jù)傳入工作站,由同一名影像專業(yè)醫(yī)師在同一天進(jìn)行分析。血管源性腦水腫的評(píng)價(jià):選取包括兩側(cè)側(cè)腦室的層面為測(cè)量層面,在患側(cè)皮層和紋狀體區(qū)病灶中心及對(duì)側(cè)對(duì)應(yīng)區(qū)分別測(cè)量感興趣區(qū)(ROI)的平均信號(hào)強(qiáng)度(SI)。以 Re表示增強(qiáng)掃描患側(cè)SI的變化率,Re=病側(cè)增強(qiáng)掃描SI/對(duì)側(cè)增強(qiáng)掃描SI×100%。細(xì)胞性腦水腫的測(cè)量,在DWI圖像上取3點(diǎn)興趣區(qū),1點(diǎn)為中心區(qū),3點(diǎn)為邊緣區(qū),2點(diǎn)為第1、3點(diǎn)的中心點(diǎn)。計(jì)算平均擴(kuò)散系數(shù)。計(jì)算時(shí)采用相對(duì)表現(xiàn)擴(kuò)散系數(shù) (rADC)=病側(cè)ADC值/健側(cè)相應(yīng)區(qū)域ADC值×100%。然后比較各組的rADC。

    1.5免疫組織化學(xué)染色大鼠缺血再灌注24 h后,用10%水合氯醛麻醉,等滲生理鹽水和4%多聚甲醛PBS液進(jìn)行心臟灌注,斷頭取腦,取距嗅球尖端后7~11 mm間的腦組織塊,置于4%多聚甲醛中固定,脫水,包埋,連續(xù)切片,片厚 6 μm 。免疫組織化學(xué)染色嚴(yán)格按照說明書操作進(jìn)行。染色成功后用高倍顯微鏡進(jìn)行拍照,每張切片選取5個(gè)視野,采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析光密度值。

    1.6PGE2水平測(cè)定大鼠麻醉后用等滲生理鹽水快速灌洗,斷頭取患側(cè)腦組織,分離額頂部皮質(zhì),置微型勻漿器中加0.1 ml 無水乙醇研磨,再加等滲生理鹽水0.9 ml充分研磨成勻漿,4℃離心3 500 r/min,15 min,取勻漿上清液200 μl,按放免試劑盒說明操作,測(cè)出樣品溶度。

    1.7ICE mRNA檢測(cè)大鼠缺血再灌注24 h后,10%水合氯醛麻醉后斷頭取腦,取缺血半暗帶腦組織,迅速用液氮冷凍,并放置-70℃保存。RNA提取及引物合成提取采用異硫氰酸胍法:正義鏈引物5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′,反義鏈引物:5'-TGG TGT GGA AGA GCA GAA AGC-3';γ-actin正義鏈引物5'-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3',反義鏈引物:5'-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3'。逆轉(zhuǎn)錄及cDNA擴(kuò)增,參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行,ICE擴(kuò)增28個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳。通過圖像分析軟件讀取目的電泳條帶的灰度值,以ICE基因片段與相應(yīng)模板GAPDH片段灰度值的比值作為其mRNA相對(duì)表達(dá)水平數(shù)值。

    1.8Hoechst染色切片常規(guī)脫蠟透明后,置于6孔板上以0.9%生理鹽水洗3遍,每次3 min,吸盡液體,然后加入0.5 ml的Hoechst 染色液,手搖晃動(dòng)以充分染色,染色5 min,完成后將切片置于載玻片上,滴上1滴抗淬滅液,蓋上潔凈的蓋玻片,在熒光顯微鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡形態(tài)并進(jìn)行拍照。并計(jì)算出細(xì)胞凋亡百分率。

    1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,方差齊用Bonferroni法,方差不齊采用Welch法和Dunnett'3法。

    2結(jié)果

    2.1COX-2免疫組化表達(dá)假手術(shù)組可見少量COX-2陽性細(xì)胞。生理鹽水組缺血灶周圍可見大量COX-2 染色陽性細(xì)胞。與假手術(shù)組相比,其平均光密度值增高(P<0.05)。與生理鹽水組相比,預(yù)處理組、30 min、4 h組平均光密度值下降(P<0.05)。12 h組COX-2光密度值下降不明顯,與生理鹽水組相比,差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1,圖1。

    2.2PGE2的表達(dá)假手術(shù)組只有少量PGE2表達(dá),生理鹽水組PGE2表達(dá)明顯增高,預(yù)處理組30 min、4 h組PGE2表達(dá)水平相對(duì)于生理鹽水組有明顯下降(P<0.05)。12 h組PGE2含量與假手術(shù)組相比,差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

    2.3ICE的表達(dá)假手術(shù)組大鼠的大腦皮層只有少量ICE表達(dá),生理鹽水組在缺血半暗帶ICE表達(dá)增強(qiáng)。與生理鹽水組相比,預(yù)處理組、30 min、4 h組ICE的表達(dá)降低(P<0.05),12 h組ICE的表達(dá)無明顯下降(P>0.05)。見表1。

    2.4磁共振彌散加權(quán)成像假手術(shù)組磁共振DWI掃描無異常信號(hào),生理鹽水組DWI掃描可見大片異常信號(hào)區(qū),rADC值下降,與假手術(shù)組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各模型組DWI掃描均可見高信號(hào)區(qū),預(yù)處理組、30 min組rADC有所上升,與生理鹽水組相比差異顯著(P<0.05)。與生理鹽水組相比,4、12 h組rADC值亦有相應(yīng)上升。見表2,圖1。

    2.5核磁共振T1WI增強(qiáng)掃描假手術(shù)組T1WI增強(qiáng)掃描無異常表現(xiàn),各模型組增強(qiáng)掃描后均出現(xiàn)不同程度的強(qiáng)化。與假手術(shù)組相比,生理鹽水組增強(qiáng)掃描可見強(qiáng)化,相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度增高。預(yù)處理組,30 min組、4 h增強(qiáng)掃描后其信號(hào)強(qiáng)度與生理鹽水組相比有所下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。12 h組與生理鹽水組相比增強(qiáng)掃描信號(hào)強(qiáng)度無明顯下降(P>0.05)。見表2,圖1。

    2.6Hoechst染色結(jié)果與假手術(shù)組相比,假手術(shù)組大腦皮層只有少量凋亡細(xì)胞,生理鹽水組在腦缺血灶周圍中可見大量凋亡細(xì)胞(P<0.05)。預(yù)處理組、30 min、4 h組細(xì)胞凋亡百分率下降,與生理鹽水組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與生理鹽水組相比,12 h組細(xì)胞凋亡百分率無明顯下降(P>0.05)。見表2,圖1。

    表1 各組大鼠的COX-2光密度值、PGE2的含量、

    與生理鹽水組比較:1)P<0.05,2)P<0.01,下表同

    表2 各組大鼠增rADC值、強(qiáng)掃描相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度、

    COX-2表達(dá)(×400)

    DWI掃描圖

    增強(qiáng)掃描圖

    Hoechst染色

    3討論

    神經(jīng)元凋亡是一種多基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡過程,在不同刺激信號(hào)的影響下,涉及多個(gè)基因表達(dá)及相互作用的復(fù)雜過程。ICE是Caspase家族中最早克隆的凋亡相關(guān)基因。ICE能使IL-1β前體轉(zhuǎn)化成為成熟形式,成熟的IL-1β促進(jìn)凋亡的發(fā)生,是凋亡的增強(qiáng)因子〔1〕。Hoechst染色后在熒光顯微鏡下能迅速區(qū)分出正常細(xì)胞與凋亡細(xì)胞,被廣泛地用于細(xì)胞凋亡研究。近來動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)米諾環(huán)素具有抗微生物特性外,還具有細(xì)胞凋亡等作用〔2〕。

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)MC在腦缺血前后一定時(shí)間段給藥具有抗細(xì)胞凋亡作用,與Arvin等〔3〕研究結(jié)果相一致。

    MC的抗凋亡作用可能與阻止細(xì)胞內(nèi)鈣離子(Ca2+)超載、細(xì)胞色素C和Smac/Diablo的釋放,縮小線粒體的皺縮和腫脹,抑制線粒體的死亡有關(guān)。同時(shí)MC還能抑制ICE的表達(dá)及ICE的活性;另外米諾環(huán)素還能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活,穩(wěn)定線粒體膜,減少線粒體對(duì)細(xì)胞色素C(Cyt-C),Smac/Diablo和AIF的通透性〔4〕,上調(diào)抗凋亡因子bcl-2〔5〕。

    腦缺血引起的腦水腫是影響病人急性期與亞急性期生存的重要因素。 腦缺血再灌注損傷后導(dǎo)致的腦水腫,涉及多種因素,多個(gè)環(huán)節(jié),其中炎性反應(yīng),自由基的形成,金屬基質(zhì)蛋白酶的活化在缺血后腦水腫起重要作用。

    MRI是腦缺血的神經(jīng)保護(hù)藥物療效監(jiān)測(cè)、作用效果對(duì)比等研究一種簡(jiǎn)單、有效且實(shí)用的方法〔6〕。DWI對(duì)急性腦缺血非常敏感,是評(píng)價(jià)腦缺血后細(xì)胞性水腫的一個(gè)很好指標(biāo)。急性腦缺血區(qū)DWI信號(hào)直接與ADC值有關(guān),兩者呈反比,即ADC值越低,DWI信號(hào)越高;ADC值越高,DWI信號(hào)越低。Gd-DTPA是一種順磁性金屬離子螯合物。正常腦組織中,靜脈注射的順磁性造影劑Gd-DTPA不能通過血腦屏障(BBB),只有在BBB完整性破壞時(shí),T1WI增強(qiáng)掃描才會(huì)出現(xiàn)信號(hào)強(qiáng)化,其強(qiáng)化范圍和信號(hào)強(qiáng)度均反映出BBB的受損情況。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明,在腦缺血前后一定時(shí)間段內(nèi)給予MC能減輕腦缺血再灌注損傷后腦水腫。MC在腦缺血再灌注損傷中抑制腦水腫的作用機(jī)制可能是:抑制氧自由基的形成〔7〕;抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性;MC能結(jié)合Ca2+及鋅離子(Zn2+),從而抑制了依賴這些離子的膠原酶〔8〕;MC還能減少基質(zhì)金屬蛋白(MMP)-9的產(chǎn)生,從而減輕腦水腫〔9〕;MC還通過抗炎作用起到抑制腦缺血再灌注后腦水腫〔10〕。

    缺血性腦血管疾病存在一系列的腦組織損傷、細(xì)胞致死過程。目前越來越多的證據(jù)表明,炎癥在缺血性腦卒中的發(fā)生和發(fā)展中具有關(guān)鍵作用。腦梗死后炎性因子包括COX-2、PGE2、腫瘤壞死因子等。研究表明COX-2、PGE2參與了腦缺血后腦損傷的發(fā)生、發(fā)展 ,并與腦缺血的預(yù)后關(guān)系密切。本組數(shù)據(jù)顯示生理鹽水組,COX-2,PGE2的表達(dá)較假手術(shù)組明顯增多,MC預(yù)處理組,30 min組、4 h組均能明顯降低COX-2、PGE2的表達(dá),以預(yù)處理組及30 min組效果明顯。12 h不能降低COX-2、PGE2的表達(dá)。米諾環(huán)素抑制腦缺血后炎性反應(yīng)可能是通過抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS),減少一氧化氮的產(chǎn)生,抑制還原型輔酶Ⅱ氧化酶的活性,降低缺血后COX-2的表達(dá)及腦組織內(nèi)PGE2的含量〔11〕;另外MC還具有抑制小膠質(zhì)細(xì)胞(MG)細(xì)胞的激活及其與T細(xì)胞的交互作用,降低了T細(xì)胞接觸MG的能力,從而減少小膠質(zhì)細(xì)胞釋放或分泌一些炎性因子和酶類,達(dá)到抑制腦缺血后炎性反應(yīng)的作用〔10〕。減少炎性因子的釋放達(dá)到抑制炎性反應(yīng)的作用。

    本研究提示米諾環(huán)素對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病有一定的保護(hù)作用,其作用機(jī)制不是單一的,而是多因素多途徑的。相信隨著研究的深入,米諾環(huán)素的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制會(huì)得到更好的解釋,米諾環(huán)素有可能成為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病新的有效藥物。米諾環(huán)素對(duì)缺血后腦保護(hù)作用有一定的時(shí)間窗,在缺血前12 h,缺血后30 min給藥效果最好。腦缺血后12 h給藥,效果不佳。但目前對(duì)米諾環(huán)素的研究大多停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段,其臨床效果及最佳作用時(shí)間還需要更多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

    參考文獻(xiàn)4

    1Ravizza T,Noe F,Zardoni D,etal.Interleukin converting enzyme inhibition impairs kindling epileptogenesis in rats by blocking astrocytic IL-1beta production〔J〕.Neurobiol Dis,2008;31(3):327-33.

    2Pabreja K,Dua K,Sharma S,etal.Minocycline attenuates the development of diabetic neuropathic pain:possible anti-inflammatory and anti-oxidant mechanisms〔J〕.Eur J Pharmacol,2011;661(1-3):15-21.

    3Arvin KL,Han BH,Du Y,etal.Minocycline markedly protects the neonatal brain against hypoxic-ischemic injury〔J〕.Ann Neurol,2002;52(1):54-61.

    4Mansson R,Hansson MJ,Morota S,etal.Re-evaluation of mitochondrial permeability transition as a primary neuroprotective target of minocycline〔J〕.Neurobiol Dis,2007;25(1):198-205.

    5Kernt M,Neubauer AS,Eibl KH,etal.Minocycline is cytoprotective in human trabecular meshwork cells and optic nerve head astrocytes by increasing expression of XIAP,survivin,and Bcl-2〔J〕.Clin Ophthalmol,2010;4:591-604.

    6Meyer JR,Gutierrez A,Mock B,etal.High-b-value diffusion-weighted MR imaging of suspected brain infarction〔J〕.AJNR Am J Neuroradiol,2000;21(10):1821-9.

    7Schildknecht S,Pape R,Muller N,etal.Neuroprotection by minocycline caused by direct and specific scavenging of peroxynitrite〔J〕.J Biol Chem,2011;286(7):4991-5002.

    8Lee CZ,Yao JS,Huang Y,etal.Dose-response effect of tetracyclines on cerebral matrix metalloproteinase-9 after vascular endothelial growth factor hyperstimulation〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab,2006;26(9):1157-64.

    9Nelissen I,Martens E,Van den Steen PE,etal.Gelatinase B/matrix metalloproteinase-9 cleaves interferon-beta and is a target for immunotherapy〔J〕.Brain,2003;126(Pt 6):1371-81.

    10Cai ZY,Yan Y,Chen R.Minocycline reduces astrocytic reactivation and neuroinflammation in the hippocampus of a vascular cognitive impairment rat model〔J〕.Neurosci Bull,2010;26(1):28-36.

    11Leite LM,Carvalho AG,F(xiàn)erreira PL,etal.Anti-inflammatory properties of doxycycline and minocycline in experimental models:an in vivo and in vitro comparative study〔J〕.Inflammopharmacology,2011;19(2):99-110.

    〔2013-09-11修回〕

    (編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)

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