葛根芩連湯對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠的保護(hù)機(jī)制

葛根芩連湯對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠的保護(hù)機(jī)制

姚金福樊湘澤楊子堯楊波范曉清

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) ,吉林長(zhǎng)春130117)

摘要〔〕目的探討葛根芩連湯對(duì)內(nèi)毒素(LPS)誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷(ALI)的保護(hù)作用。方法小鼠腹腔注射LPS(5 mg/kg)復(fù)制ALI動(dòng)物模型。將小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、LPS組、地塞米松組(2 mg/kg)、葛根芩連湯低劑量組(6.5 g/kg)、葛根芩連湯高劑量組(13 g/kg)。觀察各組肺組織病理學(xué)改變,測(cè)量肺濕/干重比、丙二醛(MDA)、炎癥因子白介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α含量及肺組織中Toll樣受體(TLR2)、TLR4與核因子(NF)-κB P65蛋白表達(dá)。結(jié)果葛根芩連湯可有效減輕LPS所致肺組織病理學(xué)變化，能降低肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞的數(shù)目，能顯著降低肺濕/干重比重并能降低減低TLR2、TLR4與NF-κB P65蛋白。結(jié)論葛根芩連湯可減輕LPS所致ALI，對(duì)LPS誘導(dǎo)的核因子有保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞〔〕葛根芩連湯；炎癥；LPS-誘導(dǎo)急性肺損傷；TLR2；TLR4；NF-κB P65

中圖分類號(hào)〔〕R285.5〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：吉林省中醫(yī)藥管理局資助項(xiàng)目(2012-074)

通訊作者：范曉清(1967-)，女，實(shí)驗(yàn)師，主要從事分析化學(xué)、藥物化學(xué)的研究。

第一作者：姚金福(1960-) ，男，副教授，主要從事中醫(yī)學(xué)、中藥學(xué)研究。

急性肺損傷(ALI)是指嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、休克等打擊后,出現(xiàn)以肺泡毛細(xì)血管損傷導(dǎo)致肺水腫和肺不張為病理特征的一種肺部炎癥與通透性增加綜合征〔1〕。臨床資料分析發(fā)現(xiàn),革蘭陰性桿菌膿毒癥是引起ALI,并導(dǎo)致其死亡的主要原因之一〔2〕。有時(shí)應(yīng)用抗生素使細(xì)菌裂解和死亡后,可釋放更多的內(nèi)毒素(LPS)〔3,4〕。Toll樣受體(TLR)是新近發(fā)現(xiàn)的跨膜信號(hào)傳導(dǎo)受體及病原模式識(shí)別受體,在感染性疾病中起重要作用。核因子(NF)-κB能引起一系列基因的表達(dá)增加,這些基因的產(chǎn)物則參與炎癥和免疫反應(yīng),從而使NF-κкB 轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在ALI中發(fā)揮調(diào)節(jié)機(jī)制〔5~8〕。本研究旨在探討葛根芩連湯通過(guò)調(diào)節(jié)肺部TLR2、TLR4、NF-κBP65的作用機(jī)制，為ALI的診治提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物BABL/C小鼠，雌性，體重18~22 g，購(gòu)自長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司。動(dòng)物批準(zhǔn)文號(hào)：SCXK(吉)2014-0007。

1.1.2葛根芩連湯制備取葛根15 g，黃連9 g，黃芩9 g，甘草6 g購(gòu)自吉林大藥房藥業(yè)股份有限公司，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)王德友教授鑒定為正品，加雙蒸水(1∶10)，煮沸2次。每次60 min，合并濾液，濃縮至浸膏，用時(shí)采用蒸餾水溶解配置成濃度1 g/ml的液體。

1.1.3試劑LPS(L2880，大腸桿菌055類型：B5，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。由無(wú)菌水配制成儲(chǔ)備液1 mg/ml，-20℃避光保存，使用時(shí)用注射用生理鹽水配成0.5 mg/ml備用)。白介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α、TLR2抗體、TLR4抗體，NF-κBP65抗體等試劑盒購(gòu)自南京建成生物有限公司。

1.1.4儀器細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(KX-21，美國(guó)SYSMEX)，倒置顯微鏡( OLYMPUS Sh1)。

1.2方法

1.2.1小鼠ALI模型復(fù)制及分組取小鼠50只,以25%氨基甲酸乙酯1 g/kg腹腔注射麻醉,隨機(jī)分成5組: 空白對(duì)照組(腹腔注射生理鹽水); LPS組(腹腔注射LPS,5 mg/kg),葛根芩連湯低劑量組(腹腔注射LPS前1 h給予葛根芩連湯,6.5 g/kg),葛根芩連湯高劑量組(腹腔注射LPS前1 h給葛根芩連湯,13g/kg),地塞米松組(予地塞米松2 mg/kg)每組10只小鼠。

1.2.2指標(biāo)檢測(cè)

1.2.2.1肺組織濕/干重量比(g/g)取右上肺葉稱濕重,80℃ 恒溫箱烤48 h至干重恒定,稱干重,計(jì)算濕/干比。

1.2.2.2肺病理學(xué)檢查切取右肺,以4%的多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,切片,HE染色,光鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。

1.2.2.3肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α檢測(cè)按照試劑盒方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2.4Western 印跡將肺組織置于冰冷的裂解液中收集裂解物總蛋白，組織蛋白行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)印至PVDF膜; 室溫封閉2 h，分別與TLR2、TLR4、NF-κB P65一抗孵育，膜經(jīng)漂洗后再與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗反應(yīng)，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL) 發(fā)光試劑顯影，灰度成像軟件(UVP，UK) 測(cè)定主帶的光密度值以計(jì)算TLR2、TLR4、NF-κB P65蛋白表達(dá)水平。

2結(jié)果

2.1肺組織的病理學(xué)變化光鏡觀察顯示,空白對(duì)照組肺組織形態(tài)基本正常; LPS組肺泡毛細(xì)血管充血擴(kuò)張,肺間質(zhì)及肺泡間隔明顯增寬,炎性水腫,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn); 葛根芩連湯組上述變化明顯減輕,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和局灶性肺間隔增寬。見(jiàn)圖1。

2.2肺組織濕/干重比(g/g)與空白對(duì)照組(1.35±0.12)相比,LPS組(6.69±0.11)肺組織濕/干重比升高(P<0.05); 葛根芩連湯組可降低LPS所致肺組織濕/干重比的升高(低、高劑量分別為4.83±0.11、4.31±0.16)(P<0.05)，地塞米松組為3.12±0.15。

2.3肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α含量與空白對(duì)照組相比,LPS組肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α含量顯著升高(P<0.05)；與LPS組比較，葛根芩連湯組IL-6、TNF-α含量降低(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.4肺組織中P38MAPK和NF-κBP65蛋白水平與空白對(duì)照組相比,LPS組肺組織中TLR2，TLR4和NF-κB P65蛋白水平顯著升高(P<0.01)；與LPS組比較，葛根芩連湯組肺組織中TLR2，TLR4和NF-κBP65蛋白水平降低 (P<0.01)，見(jiàn)圖2。

表1　葛根芩連湯對(duì)IL-6和TNF-α的影響

與空白對(duì)照組比較:1)P<0.05;與LPS組比較:2)P<0.05;下圖同

圖1　葛根芩連湯提取液對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠ALT肺組織病變的影響(HE，×200)

A：空白對(duì)照組;B：LPS組; C：地塞米松組;D：葛根芩連湯低劑量組;E：葛根芩連湯高劑量組 圖2　肺組織TLR2，TLR4和NF-κB P65蛋白水平

3討論

ALI和急性呼吸窘迫綜合征ARDS是由多種炎性介質(zhì)及效應(yīng)細(xì)胞共同參與,并呈級(jí)聯(lián)放大的瀑布樣炎癥繼發(fā)性損傷與繼發(fā)性彌漫性肺實(shí)質(zhì)損傷。目前除采用抗生素、腎上腺皮質(zhì)激素、機(jī)械通氣及吸氧等措施外,尚無(wú)有效的治療藥物與方法。這促使我們尋找新藥物來(lái)治療ALI。

葛根芩連湯是經(jīng)典古方之一,來(lái)源于東漢末年張仲景所著 《傷寒論 》第 34條：“太陽(yáng)病,桂枝證,醫(yī)反下之,利遂不止,脈促者,表未解也,喘而汗出,葛根黃芩黃連湯主之”〔9〕。

本文發(fā)現(xiàn)葛根芩連湯發(fā)現(xiàn)能顯著減低模型小鼠肺泡灌洗液中的炎癥因子含量，降低肺組織中TLR2、TLR4和NF-κB P65蛋白水平，提示葛根芩連湯可能是通過(guò)調(diào)節(jié)TLR/NF-κB信號(hào)來(lái)達(dá)到抗急性肺損傷的。

參考文獻(xiàn)4

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9陳麗紅,唐于平,王強(qiáng).葛根芩連湯的現(xiàn)代研究進(jìn)展〔J〕.中草藥，2010；4(41)：8-12.

〔2014-05-17修回〕

(編輯徐杰)