大柴胡顆粒對(duì)糖尿病大鼠模型的干預(yù)作用

大柴胡顆粒對(duì)糖尿病大鼠模型的干預(yù)作用

陶玉菡1許惠琴1張志芬2王兆龍2李偉1

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210046)

摘要〔〕目的采用高脂復(fù)合鏈脲佐菌素(STZ)造成類似于臨床2型糖尿病(T2DM)動(dòng)物模型，觀察大柴胡顆粒劑對(duì)該模型的干預(yù)作用。方法高脂復(fù)合STZ造糖尿病(DM)模型，取造模成功大鼠，隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組(0.07 g/kg)、大柴胡顆粒高中低劑量組(1.1、2.2、4.4 g/kg)，另設(shè)空白對(duì)照組(生理鹽水10 ml/kg)，同時(shí)觀察大鼠體重、攝食量、飲水量、尿量等常規(guī)指標(biāo)。用試劑盒測(cè)定糖化血紅蛋白(HbA1c)、肝糖原、肌糖原、血脂等各項(xiàng)指標(biāo)。取胰腺、肝臟等組織，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。結(jié)果二甲雙胍組、大柴胡顆粒3種劑量組對(duì)高脂復(fù)合STZ所致DM大鼠血糖、HbA1c、肌糖原及血脂含量均有降低作用，對(duì)胰島素、肝糖原含量升高作用。結(jié)論大柴胡顆粒對(duì)高脂復(fù)合STZ所致DM大鼠有一定的降糖的作用。

關(guān)鍵詞〔〕大柴胡顆粒；糖尿?。桓咧瑥?fù)合鏈脲佐菌素；血糖

中圖分類號(hào)〔〕R285.5〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：江蘇科技成果轉(zhuǎn)化專項(xiàng)資金項(xiàng)目(No.BA2010094)

通訊作者：許惠琴(1961-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事內(nèi)分泌藥理學(xué)研究。

1江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

2南通精華制藥股份有限公司

第一作者：陶玉菡(1989-)，女，碩士，主要從事內(nèi)分泌藥理學(xué)研究。

遺傳因素和多種環(huán)境因素共同作用使胰島素絕對(duì)或相對(duì)分泌不足，引起糖、蛋白質(zhì)、脂肪等的代謝紊亂，臨床以高血糖為主要表現(xiàn)的一組全身性代謝紊亂疾病〔1〕。2型糖尿病(T2DM)是由于組織細(xì)胞的胰島素抵抗、β細(xì)胞功能衰退或其他多種原因引起的，多采用口服降糖藥治療。鏈脲佐菌素(STZ)對(duì)胰島β細(xì)胞有選擇性破壞作用，能誘發(fā)多種動(dòng)物產(chǎn)生糖尿病(DM)，如可造成大鼠、小鼠的DM模型。注射較少量STZ時(shí)，由于只是破壞一部分胰島β細(xì)胞的功能，造成外周組織對(duì)胰島素不敏感，同時(shí)給予高熱量飼料喂養(yǎng)，兩者結(jié)合便誘導(dǎo)出病理、生理改變都接近于人類T2DM的動(dòng)物模型。大柴胡顆粒是在“大柴胡湯”基礎(chǔ)上研制而成的現(xiàn)代中藥復(fù)方制劑，主要由柴胡、大黃、枳實(shí)(炒)、黃芩、半夏(姜)、芍藥、大棗、生姜多味中藥組成〔2〕。近代研究表明，大柴胡湯有疏肝解郁、清熱化瘀之功效，能改善肝臟脂質(zhì)代謝，通過(guò)降糖、降脂、增加胰島素敏感性可起到保護(hù)胰島β細(xì)胞的功能，控制DM的病程〔3〕。故本實(shí)驗(yàn)采用高脂復(fù)合STZ所致DM大鼠，通過(guò)測(cè)定血清中血脂、血糖、糖化血紅蛋白(HbA1c)、胰島素等指標(biāo)，觀察大柴胡顆粒的降血糖等作用。

1資料與方法

1.1藥物及試劑大柴胡顆粒，南通精華制藥股份有限公司，批號(hào):100103。鹽酸二甲雙胍片，江蘇蘇中藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：10052613。STZ(Sigma公司，進(jìn)口分裝)。檸檬酸，合肥工業(yè)大學(xué)化學(xué)試劑廠，批號(hào):20030801。檸檬酸鈉，上海久億化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20110212。戊巴比妥鈉，北京通縣育才精細(xì)化工廠，批號(hào)：950427。羅康全優(yōu)越型血糖試紙，德國(guó)羅氏診斷有限公司，批號(hào)：451421/571532。氯化鈉注射液，南京小營(yíng)藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：2011011303。甲醛溶液，西隴化工股份有限公司，批號(hào)：1103112。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼料清潔級(jí)雄性Wistar大鼠，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，合格證SCXK(滬)2007-0005。普通飼料、高脂飼料(普通飼料74.5%、蔗糖10%、豬油10%、蛋黃粉5%、膽固醇0.5%)，由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供。

1.3儀器及實(shí)驗(yàn)條件JA2003N電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司。Accu-chek Advantage血糖儀，羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司。Synergy HT酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Tec公司。LDZ5-2離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1實(shí)驗(yàn)條件空白對(duì)照組用普通飼料喂養(yǎng)，其余組用高脂飼料喂養(yǎng)，自由飲水，室溫18℃～24℃，濕度40%～70%。

1.4.2造模取120只雄性Wistar大鼠，體重180~220 g，自由進(jìn)食和進(jìn)水。其中取10只作為空白對(duì)照組，用普通飼料喂養(yǎng)；其余大鼠用高脂飼料飼養(yǎng)。第9周末，全部大鼠禁食不禁水12 h后尾尖采血，用血糖儀測(cè)其血糖值。隨后高脂飼料飼養(yǎng)大鼠以25 mg/kg STZ溶液1次性腹腔注射,空白對(duì)照組大鼠腹腔注射相同容量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。第10周時(shí)，大鼠禁食不禁水12 h后尾尖采血測(cè)血糖。以血糖值≥16.7 mmol/L為達(dá)到造模標(biāo)準(zhǔn)。

1.4.3分組及給藥取造模合格的DM大鼠，按血糖值隨機(jī)分為：①模型組：給予生理鹽水10 ml/kg；②二甲雙胍組：70 mg/kg；③大柴胡顆粒高劑量組：4.4 g/kg；④大柴胡顆粒中劑量組：2.2 g/kg；⑤大柴胡顆粒低劑量組：1.1 g/kg。各組每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7 w，并在給藥期間繼續(xù)喂以高脂飼料飼養(yǎng)。另設(shè)的空白對(duì)照組給予生理鹽水10 ml/kg，喂以普通飼料。

1.4.4測(cè)定指標(biāo)(1)常規(guī)指標(biāo)：給藥前每3 w測(cè)量并記錄大鼠體重；給藥后每周測(cè)量并記錄大鼠體重。給藥后每3 w測(cè)量大鼠攝食量、飲水量、尿量，取平均值。(2)生化指標(biāo)：①給藥后每2周測(cè)定血糖值；②末次給藥后禁食12 h，頸總動(dòng)脈取血，一部分用肝素抗凝，制備紅細(xì)胞，用于測(cè)定HbA1c；另一部分靜置后分離制備得血清，用于測(cè)定總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)及低密度脂蛋白(LDL)、游離脂肪酸(NEFA)、胰島素(INS)等含量。③取肝臟和肌肉組織，測(cè)定肝糖原與肌糖原的含量。(3)組織病理學(xué)檢查：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取胰腺、肝臟等組織，用10%甲醛溶液固定，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS11.5軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1對(duì)大鼠體重的影響在用高脂飼料單獨(dú)喂養(yǎng)大鼠期間，每3周測(cè)定大鼠體重，結(jié)果模型組大鼠隨喂養(yǎng)時(shí)間的增加，體重也增加。其中第6、9周時(shí)模型組大鼠增長(zhǎng)明顯，與空白對(duì)照組比較具有顯著差異(P<0.05，P<0.01)。在形成DM大鼠及給藥期間，與空白對(duì)照組比較模型組大鼠體重減輕，且呈逐漸下降趨勢(shì)(P<0.01)。二甲雙胍組、大柴胡高劑量組大鼠體重則略有增加，在給藥第5周時(shí)與模型組比較有顯著差異(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖1。

2.2對(duì)DM大鼠攝食量、飲水量、尿量的影響①模型組攝食量、飲水量和尿量明顯升高，與空白對(duì)照組比較差異有極顯著差異(P<0.01)。與模型組比較，二甲雙胍組、大柴胡低劑量組攝食量有下降趨勢(shì)(P<0.05)，其他各組攝食量無(wú)明顯下降趨勢(shì)。②與模型組比較，二甲雙胍組的飲水量明顯減少(P<0.01)，與模型組比較，大柴胡高、低劑量組飲水量有下降趨勢(shì)(P<0.05)，大柴胡中劑量組有下降趨勢(shì)，但與模型組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。 ③與模型組比較二甲雙胍組、大柴胡中、低劑量組尿量有下降趨勢(shì)(P<0.05)，大柴胡高劑量組有下降趨勢(shì)，但與模型組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表1　單獨(dú)用高脂飼料喂養(yǎng)對(duì)大鼠體重的影響 ± s)

圖1　不同組別不同時(shí)間點(diǎn)大鼠體重變化

組別n攝食量(g)飲水量(ml)尿量(ml)空白對(duì)照組1025.2±5.356.2±29.031.4±27.9模型組1030.9±5.6136.4±26.8104.1±27.0二甲雙胍組923.7±14.0102.1±57.373.5±43.0大柴胡高劑量組1031.9±13.6109.1±51.989.5±40.0大柴胡中劑量組1130.8±10.8116.2±42.482.5±31.2大柴胡低劑量組1125.3±11.0103.1±50.182.3±36.2

2.3大柴胡顆粒對(duì)DM大鼠血糖的影響與空白對(duì)照組比較，模型組血糖值明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，二甲雙胍組、大柴胡高劑量組在6周時(shí)的血糖值有明顯下降趨勢(shì)(P<0.01)。其他組血糖未見(jiàn)明顯下降趨勢(shì)。見(jiàn)表3。

2.4大柴胡顆粒對(duì)糖尿病大鼠中HbA1c含量的影響模型組大鼠中含量有上升趨勢(shì)，與空白對(duì)照組相比有差異(P<0.05)。與模型組相比大柴胡中劑量組大鼠的HbA1c含量下降(P<0.01)；其余各給藥組與模型組相比較無(wú)明顯差異。見(jiàn)表3。

表3　大柴胡顆粒對(duì)DM大鼠血糖、HbA1c的影響

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01

2.5大柴胡顆粒對(duì)DM大鼠肌糖原、肝糖原及INS含量的影響與空白對(duì)照組比較模型組大鼠肌糖原含量升高(P<0.01)。與模型組比較大柴胡中劑量組大鼠肝糖原含量升高明顯(P<0.05)；二甲雙胍組、大柴胡高劑量組大數(shù)中肝糖原含量均有下降趨勢(shì)，但與模型組比差異不明顯(P>0.05)；大柴胡低劑量組大鼠肝糖原含量有上升趨勢(shì)，但與模型組相比差異不明顯(P>0.05)。二甲雙胍組、大柴胡低劑量組大鼠中肌糖原的含量有下降趨勢(shì)，與模型組比較有差異(P<0.05)；大柴胡高、中劑量組有下降趨勢(shì)，但與模型組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。與模型組相比大柴胡中劑量組大鼠的INS含量升高，有極顯著差異(P<0.01)；其余各組大鼠的INS含量均升高，但與模型組比無(wú)顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)表4。

2.6大柴胡顆粒對(duì)DM大鼠血脂的影響與空白對(duì)照組比較模型組大鼠血清中TC、HDL含量均升高(P<0.05，P<0.01)；TG、LDL含量升高，但與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。二甲雙胍組、大柴胡高劑量組血清中TC含量均有下降趨勢(shì)，但與模型組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)；大柴胡中、低劑量組血清中TC含量均升高。各給藥組血清中TG、HDL含量與模型組相比無(wú)明顯差異。與模型組比較二甲雙胍組血清中LDL含量有明顯下降趨勢(shì)(P<0.01)；大柴胡高、低劑量組血清中LDL-C含量有下降趨勢(shì)，但與模型組比無(wú)顯著差異(P>0.05)；大柴胡中劑量組血清中LDL含量有升高趨勢(shì)。二甲雙胍組LDL/HDL比值與模型組相比有顯著下降趨勢(shì)(P<0.01)。見(jiàn)表5。

表4　大柴胡顆粒對(duì)DM大鼠肌糖原、肝糖原、INS含量的影響 ± s)

表5　大柴胡顆粒對(duì)糖尿病大鼠血脂的影響 ± s)

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.01，2)P<0.05

2.7病理組織學(xué)檢查空白對(duì)照組：肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞無(wú)明顯變性、壞死，左中部為中央靜脈。模型組：多數(shù)肝細(xì)胞內(nèi)有多量脂滴空泡。二甲雙胍組：部分肝細(xì)胞內(nèi)有脂滴空泡，右下角為中央靜脈。大柴胡高劑量：部分肝細(xì)胞內(nèi)有少量脂滴空泡，右下角為中央靜脈。大柴胡中劑量：部分肝細(xì)胞內(nèi)有脂滴空泡，下中部為門(mén)管區(qū)，無(wú)明顯病變。高脂復(fù)合STZ復(fù)制的DM大鼠，肝臟損傷主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞脂變，無(wú)明顯肝細(xì)胞壞死，門(mén)管區(qū)無(wú)纖維組織增生。應(yīng)用大柴胡顆粒后有減輕肝細(xì)胞脂變的作用，其效果按由高到低的順序依次為大柴胡高劑量組，大柴胡中劑量組，與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。空白對(duì)照組：胰島團(tuán)索狀，形態(tài)規(guī)整。胰島細(xì)胞著色淺、分布較均勻、細(xì)胞無(wú)變性。模型組：胰島形態(tài)不規(guī)則，胰島內(nèi)細(xì)胞分布不均，有明顯變性。二甲雙胍組：胰島細(xì)胞變性程度較模型組輕。大柴胡高劑量：胰島邊緣較模型組整齊，胰島細(xì)胞輕度變性。大柴胡中劑量：胰島邊緣較模型組整齊，胰島細(xì)胞輕度變性。大柴胡低劑量：胰島邊緣較模型組整齊，胰島細(xì)胞變性較高、中劑量組略明顯。用高脂復(fù)合STZ復(fù)制了大鼠DM動(dòng)物模型，主要組織病理學(xué)表現(xiàn)為內(nèi)分泌部胰島數(shù)量減少，形態(tài)不規(guī)則，胰島內(nèi)細(xì)胞排列紊亂，有不同程度的變性。外分泌部腺泡及導(dǎo)管未見(jiàn)明顯異常。應(yīng)用大柴胡顆粒后胰島數(shù)目未增多，胰島內(nèi)細(xì)胞變性程度略有減輕。見(jiàn)圖2，圖3及表6。

表6　各組胰島、肝臟病變輕重程度評(píng)分結(jié)果 ± s)

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05

圖2　大柴胡顆粒對(duì)糖尿病大鼠胰島的影響(HE，×200)

圖3　大柴胡顆粒對(duì)糖尿病大鼠肝臟的影響(HE，×200)

3討論

DM由于遺傳因素和多種環(huán)境因素共同作用，使胰島素絕對(duì)或相對(duì)分泌不足，引起糖、蛋白質(zhì)、脂肪等的代謝紊亂，臨床以高血糖為主要表現(xiàn)的一組全身性代謝紊亂的疾病。T2DM以胰島素抵抗為主，伴胰島素分泌不足,多采用口服降糖藥治療。中醫(yī)認(rèn)為DM的病因是陰虛為本，燥熱為標(biāo)，隨著病程的遷延，燥熱傷及氣，導(dǎo)致氣陰兩傷，故氣陰兩虛為消渴病的常見(jiàn)臨床證型〔4〕。

大柴胡顆粒，是在漢代張仲景“大柴胡湯”的基礎(chǔ)上研制而成的現(xiàn)代中藥復(fù)方制劑，由柴胡、黃芩、白芍、法夏、枳實(shí)、大黃、大棗，生姜等組成，具有和解少陽(yáng)，內(nèi)瀉熱結(jié)的功效；主要用于因少陽(yáng)不和、肝膽濕熱所致的右上腹隱痛或脹滿不適、口苦、惡心嘔吐、大便秘結(jié)、舌紅苔黃膩、脈弦數(shù)或弦滑等癥。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，大柴胡顆湯對(duì)中焦郁熱的糖尿病患者還有輔助降糖、降脂作用。

DM的癥狀主要是糖、脂肪、蛋白質(zhì)、水、鹽、酸堿代謝紊亂，主見(jiàn)多飲多食多尿消瘦。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示STZ復(fù)合高脂飼料造成T2DM模型后，大鼠體重下降明顯，出現(xiàn)明顯的“三多一少”的癥狀。

HbA1c是血液中紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白和血糖結(jié)合的產(chǎn)物。因此檢查HbA1c已成為了解DM控制良好與否的重要指標(biāo)。TC是指血液中所有脂蛋白所含膽固醇之和。TC的增多可見(jiàn)于DM。TG是長(zhǎng)鏈脂肪酸和甘油形成的脂肪分子，現(xiàn)在認(rèn)為T(mén)G的升高可見(jiàn)于各種高脂蛋白血癥、DM、胰腺炎等。HDL為血清蛋白之一，可以攝取血管壁內(nèi)膜底層沉浸下來(lái)的HDL、TC、TG等有害物質(zhì)，轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟進(jìn)行分解排泄。LDL是有及低密度脂蛋白轉(zhuǎn)變而來(lái)，主要是把膽固醇運(yùn)輸?shù)饺砀魈幖?xì)胞，運(yùn)輸?shù)礁闻K合成膽酸，LDL水平過(guò)高能致動(dòng)脈粥樣硬化〔5，6〕。NEFA升高可加重INS抵抗，誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡，間接加重DM〔7，8〕。INS是機(jī)體內(nèi)唯一降低血糖的激素，同時(shí)促進(jìn)糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成。

綜上所述，大柴胡顆粒對(duì)高脂復(fù)合STZ所致DM大鼠可升高體重，減少飲食、飲水、尿量，對(duì)DM大鼠的血糖、尿糖、血脂、HbA1c、肌糖原含量有抑制作用，對(duì)肝糖原、INS含量升高影響不明顯，胰島內(nèi)細(xì)胞變性程度略有減輕，減輕肝細(xì)胞脂變的作用。本結(jié)果為大柴胡顆粒用于臨床治療DM提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為進(jìn)一步的臨床實(shí)驗(yàn)及新藥開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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〔2013-12-01修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)