山楂葉總黃酮對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝細(xì)胞凋亡的影響

山楂葉總黃酮對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝細(xì)胞凋亡的影響

李素婷吳淑彥1杜超陳龍

(承德醫(yī)學(xué)院生化教研室，河北承德067000)

摘要〔〕目的研究山楂葉總黃酮(FMCL)對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝細(xì)胞凋亡的影響并探討其機(jī)制。方法昆明種小鼠60只隨機(jī)分為正常組、模型組、FMCL低、高劑量組和維生素E陽性對(duì)照組。采用白酒灌胃制備急性肝損傷模型，造模同時(shí)按劑量(40、80 mg/kg)每天給予FMCL保護(hù)，10 d后處死小鼠，TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡情況，HE染色觀察肝組織病理學(xué)變化，比色法檢測(cè)肝組織丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)水平。結(jié)果和模型組比較，F(xiàn)MCL明顯降低酒精性肝損傷小鼠肝細(xì)胞凋亡指數(shù)，TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.01)，肝細(xì)胞脂肪變性、炎癥壞死等病理改變明顯好轉(zhuǎn)；模型組小鼠肝組織MDA含量明顯升高，SOD、GSH活性明顯降低，給予FMCL保護(hù)后，MDA含量明顯降低，SOD、GSH活性明顯提高(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論FMCL對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝細(xì)胞凋亡具有一定的抑制作用，其機(jī)制與抑制酒精介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕山楂葉總黃酮；酒精性肝損傷；肝細(xì)胞凋亡；脂質(zhì)過氧化

中圖分類號(hào)〔〕R285.5〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(12276104D-93)

1新樂市醫(yī)院消化科

第一作者：李素婷(1963-)，女，醫(yī)學(xué)碩士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥對(duì)肝損傷保護(hù)作用及其分子機(jī)制的研究。

肝臟是酒精代謝的主要器官，過度飲酒會(huì)引起酒精性肝損傷。研究表明，酒精引起的氧化應(yīng)激介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡在酒精性肝損傷的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用〔1〕。抑制肝細(xì)胞凋亡有利于酒精性肝損傷的防治，也是抗酒精性肝纖維化一種治療方法。山楂葉總黃酮(FMCL)是從山楂葉中提取的黃酮類化合物，含有黃酮苷、葒草素、葡荊牡黃酮等多種抗氧化成分，具有很強(qiáng)的清除自由基抗脂質(zhì)過氧化作用〔2〕，對(duì)大鼠腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用〔3〕。本研究觀察FMCL對(duì)酒精所致小鼠急性肝損傷肝細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物、藥品及儀器昆明種小鼠，雄性，清潔級(jí)，體重(22±2)g,石家莊實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心提供。FMCL(純度為80%)：北京中醫(yī)藥大學(xué)饋贈(zèng)，臨用前以蒸餾水配置，4℃保存；56°紅星二鍋頭白酒：北京紅星釀酒廠生產(chǎn)； 丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)，購于南京建成生物工程研究所；TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒，由南京凱基生物科技發(fā)展有限公司提供；Olympus顯微鏡和組織切片機(jī)：德國Leica公司。

1.2動(dòng)物造模與藥物處理〔4〕將60只昆明種小鼠隨機(jī)分為5組，分別為正常組、模型組、FMCL小劑量(40 mg/kg)組、FMCL大劑量(80 mg/kg)組和維生素E(100 mg/kg)陽性對(duì)照組。正常組每天給予蒸餾水0.4 ml灌胃，模型組和給藥組按8 ml/kg灌胃給予56°紅星二鍋頭白酒，2次/d，連續(xù)10 d造模結(jié)束。自造模第1天起，F(xiàn)MCL組和維生素E組按劑量每天中午灌胃給藥1次，正常組和模型組同時(shí)灌服等體積蒸餾水，實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠自由飲水、進(jìn)食。最后一次灌胃結(jié)束，禁食不禁水14 h，斷頭處死小鼠。

1.3TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡情況TUNEL法按試劑盒說明書進(jìn)行操作。凋亡的肝細(xì)胞多表現(xiàn)為胞膜完整、核改變，細(xì)胞核呈棕黃色染色或細(xì)胞質(zhì)因核DNA逸出而呈陽性染色者為凋亡細(xì)胞，肝細(xì)胞凋亡小體也呈陽性著色。每例標(biāo)本選5個(gè)高倍視野(400倍)觀察凋亡細(xì)胞，計(jì)數(shù)不少于500個(gè)細(xì)胞，觀察并計(jì)數(shù)陽性凋亡細(xì)胞核數(shù)占該視野肝細(xì)胞核總數(shù)的比例，取均值以百分?jǐn)?shù)表示，以凋亡指數(shù)(AI)反映肝細(xì)胞凋亡情況。

1.4肝組織病理學(xué)學(xué)觀察取小鼠肝左葉,置10%中性甲醛溶液中固定,常規(guī)石蠟包埋、切片機(jī)切片，HE染色，光鏡下觀察肝組織脂肪變性和炎癥、壞死等病理改變。

1.5肝組織MDA、SOD、GSH水平的檢測(cè)取小鼠肝左葉，以生理鹽水制備成10%的肝勻漿，比色法檢測(cè)肝勻漿MDA含量和SOD、GSH活性。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1FMCL對(duì)酒精引起小鼠肝細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用正常組小鼠肝組織無或偶見肝細(xì)胞凋亡〔(2.92±0.88)%〕；模型組小鼠肝組織中可見大量棕黃色、棕褐色凋亡細(xì)胞核，肝細(xì)胞AI比正常組明顯升高〔(11.41±1.13)%，P<0.01〕；FMCL小、大劑量組肝細(xì)胞凋亡陽性細(xì)胞數(shù)目明顯減少，染色強(qiáng)度減弱，AI明顯降低〔(9.78±2.43)%、(7.96±1.84)%，P<0.01，P<0.05〕，并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，表明FMCL能明顯抑制酒精誘發(fā)的肝細(xì)胞凋亡，維生素E陽性對(duì)照組肝細(xì)胞AI為(7.64±2.23)%，較模型組明顯改善(P<0.01)。見圖1。

2.2FMCL對(duì)酒精引起小鼠肝組織病理學(xué)改變的保護(hù)作用各組小鼠肝組織切片HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察：正常組，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞呈索狀排列，肝細(xì)胞無明顯病變；模型組，肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，肝小葉界限模糊，肝細(xì)胞明顯腫脹，胞質(zhì)疏松化彌漫存在，并伴有肝細(xì)胞核濃縮、核碎裂，肝組織內(nèi)有炎癥細(xì)胞浸潤；FMCL各劑量組，肝細(xì)胞胞質(zhì)疏松化明顯減輕，細(xì)胞輕度腫脹，未見明顯的脂肪變性和炎癥細(xì)胞浸潤；維生素E陽性對(duì)照組，可見少量肝細(xì)胞胞質(zhì)疏松化，肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)明顯減輕，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常。見圖2。

圖1　FMCL對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝細(xì)胞凋亡的影響(TUNEL，×400)

圖2　FMCL對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝細(xì)胞病理改變的影響(HE，×400)

2.3FMCL對(duì)酒精引起小鼠脂質(zhì)過氧化的保護(hù)作用見表1。與正常組比較，模型組小鼠肝組織中MDA含量明顯升高，SOD、GSH活性明顯降低，表明急性酒精性肝損傷伴有顯著的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)；而給予FMCL保護(hù)后，肝組織MDA含量明顯降低，SOD、GSH活性明顯升高，表明FMCL可提高內(nèi)源性抗氧化劑的活性，具有明顯的清除自由基，抗脂質(zhì)過氧化作用。

表1　FMCL對(duì)肝組織MDA含量及SOD、GSH

與正常組比較：1)P<0.01,與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01

3討論

細(xì)胞凋亡又稱程序化細(xì)胞死亡(PCD)，是細(xì)胞在一定的生理或病理信號(hào)刺激下遵循自身程序，由基因控制的自主性死亡方式。凋亡與增殖的動(dòng)態(tài)平衡是維系正常組織自穩(wěn)態(tài)的一個(gè)基本過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡與各種肝臟疾病的發(fā)生密切相關(guān)，肝細(xì)胞的異常凋亡在酒精性肝病的發(fā)生與發(fā)展中起重要作用〔5〕。而促氧化物增多和抗氧化物減少造成的氧化應(yīng)激是酒精性肝病肝細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制之一〔6〕。

酒精介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡在酒精性肝損傷的發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色〔7〕。長(zhǎng)期或大量飲酒時(shí)，酒精在肝微粒體經(jīng)細(xì)胞色素P4502E1代謝時(shí)產(chǎn)生大量活性氧自由基(如O2-·、OH-·、C2H5O-·和C2H5OH-·等)，活性氧介導(dǎo)脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)，產(chǎn)生大量脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA，對(duì)肝細(xì)胞產(chǎn)生毒性，引起肝細(xì)胞凋亡。酒精在肝內(nèi)代謝及活性氧的產(chǎn)生主要在線粒體，線粒體DNA對(duì)氧自由基攻擊高度敏感，可引起線粒體DNA廣泛缺失而形成線粒體DNA微環(huán)，并破碎成數(shù)百個(gè)微環(huán)碎片，是肝細(xì)胞發(fā)生凋亡的前提。活性氧還能改變線粒體膜滲透性，通過釋放凋亡相關(guān)蛋白細(xì)胞色素C和其他凋亡相關(guān)因子，活化Caspase蛋白與凋亡效應(yīng)分子結(jié)合，誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生凋亡?；钚匝跻嗫苫罨疦F-κB等信號(hào)通路，通過上調(diào)P53、Bax及Caspase-3等促凋亡因子基因的表達(dá)，介導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡〔8，9〕。肝細(xì)胞凋亡可直接導(dǎo)致大量肝細(xì)胞的減少，并可激活肝組織炎癥和(或)壞死，最終導(dǎo)致肝功能嚴(yán)重?fù)p傷〔10〕。

正常肝組織內(nèi)存在多種抗氧化物質(zhì)，其中以SOD和GSH在抵抗酒精所致的肝損傷中起關(guān)鍵作用。SOD能有效清除自由基，保護(hù)細(xì)胞不受自由基侵害。GSH是肝細(xì)胞內(nèi)游離存在的小分子抗氧化劑，能直接和氧自由基起反應(yīng)，并作為谷胱甘肽過氧化物酶的特異性底物，還原體內(nèi)已生成的自由基〔11〕。許多研究證實(shí)GSH等內(nèi)源性抗氧化劑能夠?qū)挂掖家鸬母渭?xì)胞凋亡〔12，13〕。但是，當(dāng)產(chǎn)生的活性氧自由基超過SOD、GSH等抗氧化因子的清除能力時(shí)，便可由氧應(yīng)激損傷線粒體或活化促凋亡因子基因的表達(dá)，誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡。因此，提高內(nèi)源性抗氧化劑含量，清除自由基，抑制氧應(yīng)激介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡，是防治酒精性肝損傷的關(guān)鍵所在。

本研究結(jié)果表明小鼠急性酒精性肝損傷的形成是由于肝細(xì)胞異常凋亡所致，F(xiàn)MCL通過抑制肝細(xì)胞凋亡起到保肝護(hù)肝作用。FMCL能明顯降低酒精介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量的升高，明顯提高內(nèi)源性抗氧化劑SOD、GSH的活性，具有較強(qiáng)的清除自由基的抗氧化能力。表明FMCL通過提高內(nèi)源性抗氧化劑水平，抑制了氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的肝細(xì)胞異常凋亡，這可能是FMCL對(duì)酒精性肝損傷起保護(hù)作用的重要機(jī)制之一。

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〔2013-09-28修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)