固相萃取-高效液相色譜法檢測(cè)油炸豬肉中丙烯酰胺

邵美麗，郝星宇，劉 巍,2，崔承遠(yuǎn)，袁兆豐，董 鑫

固相萃取-高效液相色譜法檢測(cè)油炸豬肉中丙烯酰胺

邵美麗1，郝星宇1，劉 巍1,2，崔承遠(yuǎn)1，袁兆豐1，董 鑫1

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 黑龍江 150030；2.佳木斯出入境檢驗(yàn)檢疫局，黑龍江 佳木斯 154002）

建立油炸豬肉中丙烯酰胺的固相萃取-高效液相色譜檢測(cè)方法。油炸豬肉樣品經(jīng)正己烷脫脂，2 mol/L氯化鈉溶液提取，乙酸乙酯萃取，固相萃取小柱凈化后，以甲醇-水（5∶95，V/V）為流動(dòng)相，Hypersi10DS2-C18色譜柱分離，內(nèi)標(biāo)法定性、定量分析丙烯酰胺。結(jié)果表明：丙烯酰胺的定性檢出限為6 μg/kg，定量檢出限為20 μg/kg，線性定量范圍0.05～1.00 μg/mL，線性相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999 8，本方法的加標(biāo)回收率穩(wěn)定在90%～92%范圍，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.5%。

油炸豬肉；丙烯酰胺；固相萃??；高效液相色譜

丙烯酰胺是一種不飽和酰胺，具有神經(jīng)毒性、生殖毒性、遺傳毒性及潛在致癌性[1-4]。研究表明，不僅在富含碳水化合物的高溫油炸食品中含有大量的丙烯酰胺[5-6]，燒烤、油炸的肉類(lèi)如烤羊肉串（23 μg/kg）、油炸雞翅（214 μg/kg）及煎牛排（251 μg/kg）等食品中也含有一定量的丙烯酰胺[7-9]。在我國(guó)，豬肉是最常食用的一種肉類(lèi)，油炸更是人們常用的一種烹飪方式，建立油炸豬肉中丙烯酰胺的檢測(cè)方法及安全限量，對(duì)于避免因過(guò)多攝入油炸豬肉而引發(fā)丙烯酰胺蓄積毒性是非常有必要的。

食品中丙烯酰胺的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-13]等。其中氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法既有色譜對(duì)化合物的分離能力，又有質(zhì)譜特異性，具有檢出限低（食品中丙烯酰胺的最低檢出限可達(dá)1 μg/kg），靈敏度高，且能夠提供測(cè)量組分的分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)信息等特點(diǎn)。但這兩種方法的缺點(diǎn)是所用到的儀器價(jià)格非常昂貴，檢測(cè)費(fèi)用高，且氣相色譜-質(zhì)譜法的樣品需先經(jīng)過(guò)衍生化，操作比較復(fù)雜，不適用于大規(guī)模的推廣[14-17]。與其相比，高效液相色譜法對(duì)儀器要求不高，檢測(cè)成本低，且具有較好的分離效果和較低的檢出限，適于大規(guī)模推廣[18]。固相萃取技術(shù)是目前常用的樣品前處理方法，其操作簡(jiǎn)單，富集效率較高[19-21]。故本研究結(jié)合固相萃取技術(shù)，建立油炸豬肉中丙烯酰胺的高效液相色譜檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮豬肉 哈爾濱市購(gòu)。

丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）、甲基-丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%） 美國(guó)Sigma公司；甲醇（色譜純） 百靈威科技有限公司；乙酸乙酯、正己烷、環(huán)己烷、氯化鈉、石油醚（均為分析純） 天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

2487高效液相色譜系統(tǒng)、Oasis HLB固相萃取柱美國(guó)Waters公司；Hypersi10DS2-C18色譜柱 大連伊力特分析儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；QF-3800氮?dú)獯蹈蓛x 北京博峰天成科技有限公司；YZ-1531-B多功能油炸鍋 廣東容聲電器股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

1.2.1.1 提取

取10 g粉碎后的油炸豬肉樣品，加入0.01 mg/mL甲基丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)液500 μL，然后加入40 mL正己烷，超聲振蕩脫脂15 min，棄去正己烷層，重復(fù)此操作2 次。然后加入50 mL 2 mol/L氯化鈉溶液，磁力攪拌20 min，以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清液，重復(fù)此操作2 次。向上清液加入10 mL乙酸乙酯，靜置10 min后，收集上層溶液，重復(fù)此操作2 次。將收集到的萃取液，氮?dú)獯蹈?，加? mL超純水溶解，備用。

1.2.1.2 凈化

依次用3 mL甲醇和3 mL超純水活化平衡Oasis HLB固相萃取柱，然后將上述樣品提取液過(guò)Oasis HLB固相萃取小柱，棄去流出液，再用3mL超純水洗脫，收集全部洗脫液，用0.45 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)行色譜分析。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：Hypersi10DS2-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；進(jìn)樣量：20 μL；進(jìn)樣溫度：30 ℃；流速：0.8 mL/min；流動(dòng)相：甲醇-水（5∶95，V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)：205 nm，利用保留時(shí)間定性，峰面積定量。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制1 mg/mL的丙烯酰胺儲(chǔ)備液，進(jìn)一步稀釋得0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.4、0.6、0.8、1 μg/mL的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液。同時(shí)以0.1 μg/mL甲基丙烯酰胺作內(nèi)標(biāo)溶液。依次測(cè)定不同質(zhì)量濃度丙烯酰胺及其內(nèi)標(biāo)的峰面積，以丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度比為橫坐標(biāo)，以丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算丙烯酰胺含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Statistix 8.1軟件包中Linear Models程序進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相的選擇

丙烯酰胺是極性很強(qiáng)的化合物，因此在進(jìn)行色譜分離時(shí)流動(dòng)相的選擇非常重要[22]。本研究比較了6種不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇溶液（0%、5%、25%、50%、75%、100%）作為流動(dòng)相的分離效果。結(jié)果表明，以純水和純甲醇為流動(dòng)相時(shí)，沒(méi)有出現(xiàn)色譜峰；以25%、50%、75%的甲醇溶液作流動(dòng)相時(shí)，甲基丙烯酰胺的峰形較差，同時(shí)以50%的甲醇溶液做流動(dòng)相時(shí)，基線較不穩(wěn)定。而以5%的甲醇溶液作為流動(dòng)相時(shí)，丙烯酰胺的保留時(shí)間和峰形都較理想，基線平穩(wěn)且無(wú)明顯漂移的現(xiàn)象，色譜峰的分離效果也比較好（色譜圖略）。故最終選擇5%的甲醇溶液作流動(dòng)相。

2.1.2 進(jìn)樣溫度的選擇

本實(shí)驗(yàn)比較了20、30、40 ℃ 3 個(gè)不同進(jìn)樣溫度對(duì)丙烯酰胺分離效果的影響。結(jié)果表明，3 個(gè)溫度條件下色譜峰的保留時(shí)間差別不大。但進(jìn)樣溫度為20 ℃時(shí)，色譜圖的基線不夠平穩(wěn)；進(jìn)樣溫度為40 ℃時(shí)，丙烯酰胺色譜峰分離效果不好，故選擇30 ℃作為最佳的進(jìn)樣溫度（色譜圖略）。

2.1.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

丙烯酰胺的檢測(cè)波長(zhǎng)文獻(xiàn)報(bào)道不一致，其中最大波長(zhǎng)可達(dá)260 nm[23]，而所述最小僅197 nm[24]。為提高方法的靈敏度和準(zhǔn)確性，在進(jìn)樣前先采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)1 μg/mL的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)液以及0.1 μg/mL的甲基丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)液在190～350 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行吸光度全掃描，結(jié)果顯示在波長(zhǎng)為205 nm左右時(shí)有最大吸收波長(zhǎng)。故本研究分別比較200、205、210 nm 3 個(gè)波長(zhǎng)條件下丙烯酰胺的分離檢測(cè)效果。結(jié)果表明，在所選的3 個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)條件下，丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺均有最大吸收峰，且出峰時(shí)間和峰面積均相近，但在波長(zhǎng)為200 nm和210 nm時(shí)，丙烯酰胺的峰有一定的拖尾現(xiàn)象。故選擇205 nm作為丙烯酰胺的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)（色譜圖略）。

2.2 樣品提取方法的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

丙烯酰胺可不同程度的溶解于水、甲醇、乙醇和乙酸乙酯等多種溶劑，且在水中溶解度最大。而與水相比，高濃度的氯化鈉溶液在提取丙烯酰胺的同時(shí)可使樣品中的蛋白質(zhì)發(fā)生鹽析作用，從而有效抑制其乳化的過(guò)程，可進(jìn)一步提高丙烯酰胺的回收率，故高濃度氯化鈉溶液也是一種良好的丙烯酰胺提取溶劑。本研究分別選取2 mol/L氯化鈉溶液和純水作為提取溶劑，再分別配合磁力攪拌和超聲振蕩兩種方式進(jìn)行丙烯酰胺的提取。結(jié)果表明，采用超聲振蕩時(shí)，氯化鈉溶液和純水的丙烯酰胺回收率分別為90.0%和72.6%；采用磁力攪拌時(shí)，氯化鈉溶液和純水的丙烯酰胺回收率分別為95.9%和85.5%（表1）。可以看出，2 mol/L的氯化鈉溶液作為提取溶劑，并結(jié)合磁力攪拌的方式進(jìn)行樣品中丙烯酰胺提取的效果最好。

表 1 不同提取溶劑方法加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果（n=3）Table 1 Recovery rates of acrylamide with different eluents and methods (n= 3)

2.2.2 脫脂溶劑的選擇

油炸豬肉中大量油脂的存在會(huì)嚴(yán)重影響丙烯酰胺的提取純化以及檢測(cè)的過(guò)程，故需對(duì)樣品進(jìn)行脫脂處理。由于丙烯酰胺不溶于烷烴化合物，故本研究分別選取正己烷、環(huán)己烷、石油醚3 種溶劑對(duì)樣品進(jìn)行脫脂，并比較脫脂過(guò)程中三者對(duì)丙烯酰胺回收率的影響。結(jié)果表明，正己烷、石油醚和環(huán)己烷進(jìn)行樣品脫脂后，丙烯酰胺的損失率分別為1.7%、2.3%和4.5%，這說(shuō)明脫脂步驟并不會(huì)對(duì)丙烯酰胺的提取造成很大影響（表2）。相比而言，正己烷作為脫脂溶劑時(shí)丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液的損失率最小，故選擇正己烷作為脫脂溶劑。

n=3）=3 Table 2 Loss rates of acrylamide with different degreasant (表 2 不同脫脂劑損失率測(cè)定結(jié)果（Table 2 Loss rates of acrylamide with different degreasant (n = 3) = 3)

2.2.3 乙酸乙酯萃取次數(shù)的選擇

由圖1可知，萃取1 次時(shí)，丙烯酰胺回收率只有35%，萃取2 次時(shí)回收率提高到55.3%，萃取3 次時(shí)的回收率顯著增加到84.6%。當(dāng)繼續(xù)增加萃取次數(shù)到4 次和5 次時(shí)，丙烯酰胺的回收率沒(méi)有明顯增長(zhǎng)，說(shuō)明萃取次數(shù)達(dá)到3 次時(shí)，已可將丙烯酰胺充分萃取出來(lái)，故確定乙酸乙酯萃取次數(shù)為3 次。

圖 1 乙酸乙酯液液萃取次數(shù)對(duì)丙烯酰胺回收率的影響（n=33）Fig.1 Effect of number of extraction cycles with ethyl acetate on the recovery of acrylamide (n = 3)

2.3 固相萃取條件的優(yōu)化

2.3.1 洗脫劑的選擇

固相萃取可有效提高丙烯酰胺的回收率并有效減少雜質(zhì)[25]。本研究選用HLB固相色譜柱對(duì)樣品進(jìn)行純化處理，分別選用超純水以及25%、50%、75%、100%的甲醇溶液作為洗脫液，并分別對(duì)質(zhì)量濃度為0.05、0.25、1.00 μg/mL的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行洗脫，比較丙烯酰胺的回收率。由圖2可知，當(dāng)選用純水進(jìn)行洗脫時(shí)，3 種質(zhì)量濃度的丙烯酰胺回收率分別為93.6%、87.3%、92.3%。隨著甲醇比例的增加，丙烯酰胺的回收率均有所下降。當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)增長(zhǎng)到75%時(shí)，已檢測(cè)不到0.05 μg/mL的丙烯酰胺。故本實(shí)驗(yàn)選擇超純水作為洗脫溶劑。

圖 2 不同體積分?jǐn)?shù)甲醇溶液作為洗脫液時(shí)丙烯酰胺的固相萃取回收率（n=3）=3Fig.2 Effect of eluent (methanol) concentration on the recovery of acrylamide (n = 3)

2.3.2 洗脫液體積的選擇

圖 3 丙烯酰胺淋洗曲線Fig.3 Acrylamide elution curve with different eluent volumes

由圖3可知，隨著超純水體積不斷增加，丙烯酰胺的回收率逐漸升高。當(dāng)超純水體積達(dá)到3 mL時(shí)，丙烯酰胺回收率達(dá)到83.5%。隨后再增加洗脫劑體積，丙烯酰胺回收率并沒(méi)有明顯增加，由此說(shuō)明用3 mL的水就可將丙烯酰胺基本洗脫出來(lái)，再加大洗脫量并不能更大程度地提高回收率，故從經(jīng)濟(jì)的角度講，選擇3 mL為洗脫體積較合適。

2.4 方法評(píng)價(jià)

2.4.1 線性關(guān)系與最低檢出限

丙烯酰胺在0.05～1.00 μg/mL之間，峰面積和質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=0.981 4x＋0.262 3，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.999 8。以信噪比為3的條件下計(jì)算得出丙烯酰胺的最低檢出限（定性檢出限）為6 μg/kg，以信噪比為10的條件下計(jì)算得出丙烯酰胺的定量檢出限為20 μg/kg。丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見(jiàn)圖4。

圖 4 丙烯酰胺標(biāo)品高效液相色譜圖Fig.4 HPLC Chromatogram of acrylamide standard

2.4.2 精密度與回收率

表 3 高效液相色譜方法檢測(cè)油炸豬肉中丙烯酰胺的加標(biāo)回收率（n=5）Table 3 Recoveries of acrylamide spiked in deep-fried pork by the HPLC method (n= 5)

圖 5 實(shí)際樣品高效液相色譜檢測(cè)圖Fig.5 HPLC chromatogram of real sample

回收率可以反映出待測(cè)物質(zhì)在樣品分析處理過(guò)程中的損失程度，回收率越高說(shuō)明損失越少，其方法的準(zhǔn)確度也就越高。分別按照50、100、200 μg/kg的加標(biāo)水平向樣品中加入丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，計(jì)算平均回收率（表3）。結(jié)果表明，丙烯酰胺的加標(biāo)回收率在90%～92%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.5%，說(shuō)明本研究的樣品準(zhǔn)備方法和高效液相色譜檢測(cè)方法可靠、精密度高。油炸豬肉中丙烯酰胺的加標(biāo)前含量為108 μg/kg，其檢測(cè)色譜圖見(jiàn)圖5。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了油炸豬肉中丙烯酰胺的固相萃取-高效液相色譜檢測(cè)方法。該方法通過(guò)正己烷脫去樣品之中的脂類(lèi)，經(jīng)過(guò)氯化鈉溶液提取和乙酸乙酯萃取后，采用固相萃取柱的固相萃取，可較好地除去干擾雜質(zhì)，大大提高樣品的凈化程度，該法定性檢出限達(dá)6 μg/kg，定量檢出限為20 μg/kg，回收率在90%～92%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.5%。本方法操作簡(jiǎn)便、快速，對(duì)所需液相色譜儀器要求較低，可在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，具有較好的推廣價(jià)值。

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Determination of Acrylamide in Deep-Fried Pork by Solid Phase Extraction-High Performance Liquid Chromatography

SHAO Meili1, HAO Xingyu1, LIU Wei1,2, CUI Chengyuan1, YUAN Zhaofeng1, DONG Xin1
(1. College of Food Sciences, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China；2. Jiamusi Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Jiamusi 154002, China)

A method for the determination of acrylamide in deep-fried pork has been proposed using solid phase extraction (SPE) and high performance liquid chromatography (HPLC). Samples were degreased with n-hexane and extracted sequentially with 2 mol/L sodium chloride solution followed by ethyl acetate. Then the extract was cleaned up on an Oasis HLB solid phase extraction column and separated on a Hypersi10DS2-C18chromatographic column with a mobile phase consisting of methanol and water (5:95, V/V). Acrylamide was analyzed quantitatively by internal standard method. The results showed that the limit of qualitative detection of the proposed method was 6 μg/kg, and the limit of quantitative detection was 20 μg/kg. The standard curve was linear within the range of 0.05–1.00 μg/mL with a correlation coefficient of 0.999 8. The recoveries of the spiked sample ranged between 90% and 92% with a relative standard deviation (RSD) lower than 3.5%. This method proved to be simple, fast and highly sensitive.

deep-fried pork; acrylamide; solid-phase extraction; high performance liquid chromatography

TS201.6

A

1002-6630（2015）08-0231-05

10.7506/spkx1002-6630-201508043

2014-07-04

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C201303）；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（12541045）；

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD28B00-01-02）

邵美麗（1974—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩刂?。E-mail：shml0915@163.com