高效毛細(xì)管電泳-紫外檢測(cè)法同時(shí)檢測(cè)雪糕中多種添加劑

郭芳芳，馮 鋒,,*，白云峰，陳澤忠，劉荔貞，李 蓉，周 高

高效毛細(xì)管電泳-紫外檢測(cè)法同時(shí)檢測(cè)雪糕中多種添加劑

郭芳芳1，馮 鋒1,2,*，白云峰2，陳澤忠2，劉荔貞2，李 蓉2，周 高2

（1.山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山西 太原 030006；2.山西大同大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，山西 大同 037009）

采用高效毛細(xì)管電泳-紫外檢測(cè)法，對(duì)雪糕中常見(jiàn)的亮藍(lán)、日落黃、莧菜紅、新胭脂紅、檸檬黃5 種色素進(jìn)行檢測(cè)。電泳條件：緩沖溶液10 mmol/L Na2B4O7-5 mmol/L NaH2PO4（濃度為0.7 mmol/L的β-環(huán)糊精），pH 11.5，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm，外加電壓25 kV。在該條件下，各色素線性范圍在10～1 000 μg/mL之間，r在0.997 5～0.999 9之間，檢出限在1.2～8.6 μg/mL之間（RSN=3），平均回收率為93.8%～108.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于4.19%，結(jié)果表明該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠，可用于雪糕中合成色素的同時(shí)檢測(cè)。

高效毛細(xì)管電泳；色素；雪糕

食品色澤作為感官質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，在給人帶來(lái)美感的同時(shí)，也能激發(fā)人的購(gòu)買欲，在食品中添加色素，可以彌補(bǔ)食品因加工、運(yùn)輸?shù)仍蛟斐缮珴勺儾畹娜毕?。在不同食用色素中，合成色素因價(jià)格便宜、穩(wěn)定性好、色調(diào)多等優(yōu)點(diǎn)，成為商家的首選[1-3]。但是研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)量合成色素進(jìn)入體內(nèi)，會(huì)損害人體器官甚至致癌，特別對(duì)代謝排毒能力比較弱的老人、孕婦和兒童，危害更加明顯，對(duì)此，我國(guó)GB 2760—2011《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[4]對(duì)食品中色素的使用進(jìn)行嚴(yán)格的規(guī)定，用來(lái)控制食品中色素的含量。

目前對(duì)食品中色素的檢測(cè)方法主要有分光光度法[5-8]、薄層色譜法[9-10]、極譜法[11]、表面等離子體共振法[12]、高效液相色譜法[13-22]、毛細(xì)管電泳法[23-26]等。由于雪糕含有乳制品和蛋制品，基體較為復(fù)雜，對(duì)檢測(cè)的干擾較大，因而目前對(duì)雪糕中色素的檢測(cè)少有報(bào)道。高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳法都可用于雪糕中色素的檢測(cè)[12,21]，但與毛細(xì)管電泳法相比，高效液相色譜法存在試劑消耗量大，所需成本高、分析時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)。相關(guān)文獻(xiàn)[27]報(bào)道中先加入沉淀劑使雪糕中蛋白質(zhì)和增稠劑等大分子物質(zhì)沉淀，再用國(guó)標(biāo)[28]中聚酰胺吸附法對(duì)樣液中色素進(jìn)行提取，色素提取率為74.6%～92.7%，此法操作復(fù)雜，試劑消耗量大，需分步完成，所耗時(shí)間長(zhǎng)；本實(shí)驗(yàn)向雪糕中直接加入甲醇進(jìn)行提取，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了基體的分離和色素的提取，色素提取率為90.6%～98.0%，在提取率略有提高的情況下，簡(jiǎn)化了操作步驟，縮短了提取時(shí)間。所得提取液經(jīng)微孔膜過(guò)濾后直接進(jìn)樣，實(shí)現(xiàn)了雪糕中色素的快速提取與檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5 種伊利牌雪糕（小布丁雪糕、香橙雪糕、香芋雪糕、榴蓮雪糕、葡萄雪糕） 市購(gòu)。

氫氧化鈉（NaOH，分析純） 天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司；硼砂（Na2B4O7，分析純） 天津化學(xué)試劑三廠；磷酸二氫鈉（NaH2PO4，分析純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；色素（亮藍(lán)、檸檬黃、日落黃、莧菜紅、新胭脂紅） 阿拉丁試劑公司；甲醇（色譜純）；實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

P/ACETMMDQ高效毛細(xì)管電泳儀（配有紫外檢測(cè)器以及32 Karat軟件） 美國(guó)Beckman公司；內(nèi)徑75 μm未涂層石英毛細(xì)管 邯鄲鑫諾光纖色譜有限公司；KQ5200DA型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；AP250D分析天平 美國(guó)Ohaus公司；飛鴿牌TDL-16B型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；PSH-2C型精密酸度計(jì) 上海大普儀器有限公司；0.22 μm一次性針孔過(guò)濾器；Lambda35紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)PerkinEimer公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的制備

分別稱量10.0 mg的亮藍(lán)、日落黃、莧菜紅、新胭脂紅、檸檬黃放置于5 個(gè)容量瓶中，用二次蒸餾水溶解后定容成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。配制10 mmol/L Na2B4O7-5 mmol/L NaH2PO4的緩沖溶液，用0.1 mol/L的NaOH溶液調(diào)至pH 11.5。

1.3.2 樣品處理

將買來(lái)的雪糕放于燒杯中封口，待其溶化后，混合均勻，稱取5.0 g于100 mL燒杯中，加入10mL的甲醇，玻璃棒攪拌1 min，超聲提取20 min（隔5 min攪拌1 次），轉(zhuǎn)移至15 mL的離心管中，以6 000 r/min離心10 min，取上層清液，用0.22 μm一次性針孔過(guò)濾器過(guò)濾兩次，放置于冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 操作條件

對(duì)新毛細(xì)管進(jìn)行活化，在20 psi條件下，用0.1 mol/L NaOH、二次蒸餾水和緩沖溶液各沖洗20min；2 次進(jìn)樣間分別用0.1 mol/L NaOH溶液、二次蒸餾水和緩沖溶液沖洗5 min。檢測(cè)波長(zhǎng)：214 nm；分離電壓：25 kV；進(jìn)樣時(shí)間：4 s；緩沖溶液：10 mmol/L Na2B4O7-5 mmol/L NaH2PO4（濃度為0.7 mmol/L的β-環(huán)糊精）；pH 11.5。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品處理?xiàng)l件的選擇

對(duì)小布丁雪糕按1.3.2節(jié)中方法進(jìn)行處理，經(jīng)檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)有色素的添加，選擇該雪糕作為基底。平行稱取等量小布丁雪糕3 份放置于燒杯中，向其中添加0.1 mg/mL的色素，分別用等量的甲醇、乙醇、乙醇-氨水對(duì)其中色素進(jìn)行單次提取，經(jīng)超聲離心處理后，觀察發(fā)現(xiàn)，乙醇-氨水提取劑不能實(shí)現(xiàn)雪糕基體中蛋白質(zhì)、增稠劑等大分子物質(zhì)的完全沉淀，而甲醇和乙醇可以實(shí)現(xiàn)，進(jìn)而對(duì)3 種提取劑的提取效率進(jìn)行考察，結(jié)果如表1所示，乙醇-氨水的平均提取率為37.0%～43.5%，乙醇的平均提取率為55.5%～68.8%，而甲醇的平均提取率為90.6%～98.0%，甲醇的提取率最好，所以本實(shí)驗(yàn)選擇甲醇作為提取劑。

表 1 溶劑提取率實(shí)驗(yàn)（n=3）Table 1 Comparison of the extraction efficiencies of different solvents for synthetic dyes (s (n = 3) %

2.2 電泳分離條件的確定

2.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

配制一定質(zhì)量濃度的亮藍(lán)、日落黃、莧菜紅、新胭脂紅和檸檬黃的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水做空白，在200～650 nm范圍內(nèi)對(duì)其進(jìn)行紫外掃描，確定5 種色素在214 nm波長(zhǎng)處均有較大吸收，故將214 nm作為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2.2 緩沖溶液pH值對(duì)分離的影響

圖 1 pH值對(duì)5 種色素分離的影響Fig.1 Effect of running buffer pH on the separation of five synthetic dyes

緩沖溶液pH值通過(guò)對(duì)電滲流和分析物解離度的影響，從而影響分析物的分離情況，本實(shí)驗(yàn)考察了10 mmol/L Na2B4O7-5 mmol/L NaH2PO4緩沖溶液，pH值分別在10.0、10.5、11.0、11.5、12.0時(shí)對(duì)5 種色素分離的影響，結(jié)果如圖1所示。a曲線、b曲線和c曲線只出現(xiàn)了4 個(gè)色素峰，表明了當(dāng)pH值小于11.5時(shí)，5 個(gè)色素峰并不能完全分離；e曲線的峰形開(kāi)始變差，而且有色素峰發(fā)生重疊，分離不完全；只有d曲線所有色素峰分離完全，無(wú)重疊現(xiàn)象，因此實(shí)驗(yàn)中選擇11.5為最佳pH值。

2.2.3 緩沖溶液濃度的影響

緩沖溶液濃度通過(guò)影響電滲流和溶液的黏度，從而影響樣品的分離情況。本實(shí)驗(yàn)分別考察了5 mmol/L和10 mmol/L Na2B4O7與5 mmol/L和10 mmol/L NaH2PO4在不同濃度配比（5∶5、10∶5、5∶10、10∶10）時(shí)對(duì)5 種色素分離的影響，并對(duì)影響分離效果的原因進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖2，a曲線和c曲線出現(xiàn)了色素峰的重疊，分離效果受到影響；d曲線由于濃度增大，有較多的焦耳熱產(chǎn)生，導(dǎo)致峰形展寬，分離不完全；b曲線中所有組分均完全分離，因此本實(shí)驗(yàn)選擇的緩沖溶液中Na2B4O7和NaH2PO4的最佳濃度配比為10∶5，即10 mmol/L Na2B4O7-5 mmol/L NaH2PO4溶液。

圖 2 緩沖溶液濃度對(duì)5 種色素分離的影響Fig.2 Effect of running buffer concentration on the separation of five synthetic dyes

2.2.4 添加劑對(duì)分離的影響

為了進(jìn)一步改善峰形，提高分離的選擇性，本實(shí)驗(yàn)考察乙腈、丙酮、β-環(huán)糊精作為添加劑對(duì)5 種色素分離情況的影響，結(jié)果表明乙腈的加入會(huì)導(dǎo)致分析物遷移時(shí)間的延長(zhǎng)，丙酮的加入會(huì)導(dǎo)致峰形變差，而β-環(huán)糊精的加入可縮短分離時(shí)間，提高分離效率。β-環(huán)糊精有著特殊的內(nèi)疏水外親水的環(huán)狀中空?qǐng)A筒型結(jié)構(gòu)，當(dāng)將其加入到緩沖溶液中時(shí)，會(huì)對(duì)緩沖溶液中客體離子產(chǎn)生一定程度的包合，使緩沖溶液中離子強(qiáng)度降低，Zeta電勢(shì)增大，電滲流增大，即加大了外加電壓，進(jìn)而縮短了分離時(shí)間，改善了峰形，提高了分離效率[26]。因此選擇β-環(huán)糊精作為添加劑。進(jìn)一步考察不同濃度（0.6、0.7、 0.8 mmol/L）β-環(huán)糊精對(duì)分離的影響，結(jié)果如圖3所示，a曲線中有色素峰發(fā)生重疊，5 種色素不能完全分離；b曲線中5 種分析物得到完全分離；c曲線中基線不穩(wěn)，色素峰展寬，分離效果下降。因此，β-環(huán)糊精的最佳濃度為0.7 mmol/L。

圖 3 3 β-環(huán)糊精的添加量對(duì)分離的影響Fig.3 Effect of β-cyclodextrin concentration on the separation of five synthetic dyes

2.2.5 外加電壓對(duì)分離的影響

外加電壓也是影響分離度的一個(gè)重要因素，外加電壓較低時(shí)，遷移時(shí)間延長(zhǎng)，峰形展寬，當(dāng)外加電壓增大時(shí)，樣品遷移速度增大，遷移時(shí)間縮短，但是產(chǎn)生的焦耳熱也會(huì)增加，造成基線不穩(wěn)，分離效果降低?？疾焱饧与妷悍謩e為15、20、25、30 kV時(shí)，5 種色素分離的情況，結(jié)果見(jiàn)圖4，a曲線和b曲線，5 種色素可以完全分離，但是所需時(shí)間長(zhǎng)，c曲線中所有組分完全分離，d曲線中，由于峰的展寬有兩個(gè)色素峰發(fā)生重疊，不能完全分離，綜合考慮，選擇25 kV作為最佳外加電壓。

圖 4 外加電壓對(duì)5種色素分離的影響Fig.4 Effect of applied voltage on the separation of five synthetic dyes

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及儀器檢出限

表 2 添加劑的線性方程及檢出限Table 2 Standard curves for determining dyes by HPCE and their limits of detection

配制5 種色素的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最佳電泳條件下進(jìn)行測(cè)定，以色素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性相關(guān)系數(shù)（r）、線性范圍和各物質(zhì)的儀器檢出限（RSN=3），見(jiàn)表2。

2.4 實(shí)際樣品分析

2.4.1 色素峰的確定

按1.3.2節(jié)中提到的方法對(duì)樣品進(jìn)行處理，在最佳電泳條件下對(duì)樣品進(jìn)行分析，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法確定樣品中所含色素含量，如圖5所示，香橙雪糕中含有日落黃和檸檬黃，葡萄雪糕中含有亮藍(lán)、莧菜紅和檸檬黃，榴蓮雪糕中含有檸檬黃，香芋雪糕中含有亮藍(lán)和莧菜紅。

圖 5 樣品色譜峰的確定Fig.5 HPCE profiles of real samples

2.4.2 實(shí)際樣品的色素含量

按1.3.2節(jié)中的方法對(duì)4 種雪糕樣品進(jìn)行處理，取處理好的雪糕樣品，在最佳電泳條件下平行測(cè)定3 次，根據(jù)線性方程，計(jì)算出樣品中色素的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表 3 市售4種雪糕中色素的含量Table 3 Contents of food dyes in four different flavored ice-creams μg/mL

2.4.3 樣品回收率和精密度

根據(jù)2.4.2節(jié)中所給出結(jié)果，將樣品所含色素含量的2～3 倍作為添加量，進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，測(cè)得結(jié)果見(jiàn)表4，平均回收率在93.8%～108.5%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于4.19%，說(shuō)明本法適用于雪糕中色素的測(cè)定，精密度良好，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

表 4 色素在雪糕中的回收率（n=3)Table 4 Recoveries of synthetic dyes in ice-cream (n = 3)

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)使用高效毛細(xì)管電泳-紫外檢測(cè)法，在最佳電泳條件下（檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm、外加電壓25 kV、緩沖溶液10 mmol/L Na2B4O7-5 mmol/L NaH2PO4（含有濃度為0.7 mmol/L的β-環(huán)糊精）、pH 11.5），實(shí)現(xiàn)5 種合成色素的同時(shí)檢測(cè)。通過(guò)選用甲醇對(duì)雪糕樣品進(jìn)行處理，在該條件下對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，所得平均回收率為93.8%～108.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于4.19%，表明該方法準(zhǔn)確可靠，為雪糕中合成色素的同時(shí)檢測(cè)提供了較好的理論依據(jù)。

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Determination of Different Synthetic Dyes in Ice-Cream by High Performance Capillary Electrophoresis with UV Detection

GUO Fangfang1, FENG Feng1,2,*, BAI Yunfeng2, CHEN Zezhong2, LIU Lizhen2, LI Rong2, ZHOU Gao2
(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Shanxi University, Taiyuan 030006, China；2. School of Chemical and Environmental Engineering, Shanxi Datong University, Datong 037009, China)

An efficient high performance capillary electrophoresis (HPCE) method with ultraviolet detector has been successfully developed for the determination of brilliant blue, sunset yellow, amaranth, ponceau 4R and tartrazine in icecream. The running buffer was composed of 10 mmol/L Na2B4O7and 5 mmol/L NaH2PO4containing 0.7 mmol/L betacyclodextrin at pH 11.5. The detection wavelength was set at 214 nm and applied voltage 25 kV. Under these conditions, the linear range was from 10 to 1 000 μg/mL with correlation coefficients between 0.997 5 and 0.999 9 and the limit of detection (LOD) varied from 1.2 to 8.6 μg/mL (RSN= 3). The average recoveries (n = 3) were in the range from 93.8% to 108.5%, with a relative standard deviation (RSD) lower than 4.19%. This method is convenient, accurate and suitable for the simultaneous detection of multiple synthetic dyes.

high performance capillary electrophoresis； synthetic dyes； ice-cream

O658.9

A

1002-6630（2015）08-0206-05

10.7506/spkx1002-6630-201508038

2014-06-12

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（21175085）

郭芳芳（1989—），女，碩士研究生，主要從事毛細(xì)管電泳研究。E-mail：13546046121@163.com

*通信作者：馮鋒（1964—），男，教授，博士，主要從事毛細(xì)管電泳研究。E-mail：feng-feng64@263.net