正交試驗(yàn)優(yōu)化豆皮水溶性多糖中果膠的分離技術(shù)

李群飛，安 寧，于 丹，孫姿姿，魏玉良，遲玉森*

正交試驗(yàn)優(yōu)化豆皮水溶性多糖中果膠的分離技術(shù)

李群飛，安 寧，于 丹，孫姿姿，魏玉良，遲玉森*

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109）

目的：豆皮水溶性多糖中含有果膠組分，探究一種適合工業(yè)生產(chǎn)的高效分離果膠方法。方法：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)探究可溶性固形物含量（A）、鈣化pH值（B）、水洗次數(shù)（C）、酸化pH值（D）4 個(gè)因素對果膠和中性糖純度的影響。結(jié)果：四因素對果膠純度的影響均大于對中性糖純度的影響；對果膠純度影響主次順序?yàn)镃＞A＞B＞D，而對中性糖純度影響主次順序?yàn)锳＞B＞C＞D，綜合考慮確定最優(yōu)分離條件為A1B2C3D2，即：可溶性固形物含量2.5%、鈣化pH 8、水洗5 次、酸化pH 2。在最優(yōu)條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)際得到的果膠純度高達(dá)85.48%，得率為31.3%；中性糖純度高達(dá)80.01%，得率為64.9%。結(jié)論：方法有效實(shí)用，操作簡便，成本低，綠色無污染，適合工業(yè)化大生產(chǎn)。

豆皮水溶性多糖；分離；果膠；中性糖

果膠是由植物組織中提取的一種酸性多糖（富含羧酸基），其水溶液黏度較低，可與Ca2＋、Mg2＋、Cu2＋等陽離子反應(yīng)生成具有優(yōu)良性質(zhì)的凝膠體系或沉淀[1-2]。果膠具有分散性、抗氧化性、乳化性和黏著性等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工以及生物工程等領(lǐng)域[3-8]。

隨社會對果膠的需求越來越大，國內(nèi)果膠資源日趨緊張。盡管果膠普遍存在于植物的細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)層，但可以用于提取果膠的部分卻比較局限，現(xiàn)多以時(shí)令果蔬的皮或渣為主。因此，開發(fā)新的果膠資源成為一個(gè)亟待解決的問題。

劉賀等[9]研究發(fā)現(xiàn)，豆皮水溶性多糖主要含有果膠和中性多糖。若從中分離出兩組分，既可依豆皮耐貯存的特點(diǎn)以克服季節(jié)因素限制為果膠連續(xù)生產(chǎn)提供保障，又將大大提高豆皮利用率，增加其附加值。另有研究發(fā)現(xiàn)，中性糖具有保護(hù)肝臟、降血糖、抗氧化、抗腫瘤、抗病菌以及提高免疫力等生物活性[10-12]，豆皮中性糖的應(yīng)用價(jià)值值得進(jìn)一步研究。豆皮中可溶性多糖含量高達(dá)35%[13]，因此，以豆皮為原料制得豆皮水溶性多糖后，分離出果膠和中性糖具有重大的意義。

目前，文獻(xiàn)資料關(guān)于豆皮果膠提取的報(bào)道中，關(guān)注得率而未以提高果膠純度為目的，將多糖混合物誤認(rèn)為是果膠[14]；我國大豆多糖提取利用僅限于可溶性大豆多糖混合物的層次[15-17]?，F(xiàn)有研究中采用柱層析法對多糖組分進(jìn)行分離純化，但因該法操作繁瑣、條件要求高而不適用大規(guī)模生產(chǎn)。本研究擬以CaCl2處理法代替柱層析，分離制得高純度果膠和中性糖組分，開發(fā)出一個(gè)適用于工業(yè)化大生產(chǎn)的新果膠資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆皮水溶性多糖 山東嘉冠油脂化工有限公司；鹽酸、硝酸（均為分析純） 煙臺三和化學(xué)試劑有限公司；NaOH（分析純） 天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；CaCl2、95%乙醇（均為分析純） 萊陽市康德化工有限公司；硝酸銀（分析純） 天津市邁斯科化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AR1140電子分析天平 奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司；WS101手持糖度計(jì) 上海測維光電技術(shù)有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；PHS-3C型數(shù)顯酸度計(jì) 杭州雷磁分析儀器；TD5A-WS臺式低速大容量離心機(jī) 金壇市金南儀器制造有限公司；ZJFD-3冷凍干燥機(jī) 上海肇基電氣科技有限公司。1.3 方法

1.3.1 工藝流程

豆皮水溶性多糖（質(zhì)量記為M1）→溶于蒸餾水→真空濃縮→調(diào)節(jié)pH值→鈣化反應(yīng)→離心

1.3.1.1 豆皮水溶性多糖溶于蒸餾水

稱取豆皮水溶性多糖約10 g（精確至0.000 1 g），按料液比1∶100溶于蒸餾水，于50 ℃恒溫?cái)嚢枞芙?.5 h，離心（4 000 r/min）15 min，收集上清液；將沉淀復(fù)溶于相同體積的水中，常溫?cái)嚢枞芙?5 h，離心（4 000 r/min）15 min，收集合并兩次上清液。

1.3.1.2 真空濃縮粗提液

將1.3.1.1節(jié)所得上清液濃縮至可溶性固形物含量為一定值， 制得混合多糖濃縮液以備用。濃縮條件為：50 ℃，-0.1 MPa。

1.3.1.3 調(diào)節(jié)pH值

用2 mol/L NaOH溶液，調(diào)節(jié)上述濃縮液的pH值到合適值，備用。

1.3.1.4 鈣化反應(yīng)

向調(diào)pH值后的濃縮液中緩慢滴加5 mL CaCl2溶液（5 mol/L），邊滴邊攪；待均勻后，靜置40 min，使果膠酸鈣生成完全。

1.3.1.5 洗滌果膠酸鈣沉淀

將上述處理液煮沸5 min，離心（3 500 r/min ）10 min，收集上清液；將沉淀置于400 mL熱蒸餾水（≥85 ℃）中，磁力攪拌洗滌10 min，離心（3 500 r/min）10 min，分別收集果膠酸鈣沉淀和上清液。重復(fù)洗滌果膠酸鈣一定次數(shù)，取出果膠酸鈣沉淀，用于提取果膠，合并本步所有上清液用于后續(xù)提取中性糖組分。

1.3.1.6 保溫酸化

將果膠酸鈣沉淀轉(zhuǎn)移至30 mL一定pH值的鹽酸溶液中，60 ℃水浴保溫20 min，使果膠酸鈣完全轉(zhuǎn)化為果膠酸，目視無明顯顆粒得果膠多糖液。若轉(zhuǎn)化不完全，殘留的果膠酸鈣會以雜質(zhì)存在，影響果膠純度和溶解度。

1.3.1.7 醇沉/醇洗

由上述處理得到的果膠多糖液，經(jīng)計(jì)算后加入無水乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，攪拌均勻后靜置10 min；離心（3 500 r/min）10 min，將所得果膠沉淀經(jīng)75%乙醇重復(fù)離心洗滌至上清液中無氯離子殘留。

氯離子檢驗(yàn)方法：取上述離心上清液約20 mL于小燒杯中，滴加2 滴硝酸銀指示劑溶液，目視無明顯白色沉淀即認(rèn)為上清液中無氯離子殘留。

1.3.1.8 冷凍干燥

將洗滌處理后的果膠沉淀復(fù)溶后冷凍干燥，即得符合商品要求的豆皮果膠。

1.3.1.9 真空濃縮中性糖上清液

將第1.3.1.5節(jié)所得中性糖上清液濃縮至可溶性固形物含量為1%～1.5%，備用。濃縮條件為：75 ℃，-0.1 MPa。

1.3.1.10 保溫酸化

用2 mol/L HCl溶液，調(diào)上述濃縮液pH值為一定值， 60 ℃條件下水浴保溫20 min，原理同1.3.1.6節(jié)。

1.3.1.11 醇沉/醇洗

操作步驟同1.3.1.7節(jié)。

1.3.1.12 冷凍干燥

將洗滌處理后的中性糖沉淀復(fù)溶后冷凍干燥，即得到另一種產(chǎn)品——大豆中性糖。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

選取可溶性固形物含量、鈣化pH值、水洗次數(shù)和酸化pH值作為影響果膠和中性糖純度的主要考察因素，通過單因素試驗(yàn)確定正交試驗(yàn)的因素和水平。每組試驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.3.2.1 可溶性固形物含量的確定

制備混合多糖濃縮液，控制其可溶性固形物含量分別為2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%，其他條件設(shè)定為鈣化pH 7、水洗4 次、酸化pH 2，考察不同可溶性固形物含量對果膠和中性糖純度的影響。

1.3.2.2 鈣化pH值的確定

制備混合多糖濃縮液，調(diào)鈣化pH值分別為5、6、7、8、9，其他條件設(shè)定為可溶性固形物含量2.5%、水洗4 次、酸化pH 2，考察不同鈣化pH值對果膠和中性糖純度的影響。

1.3.2.3 水洗次數(shù)的確定

制備混合多糖濃縮液，鈣化后水洗次數(shù)分別為2、3、4、5、6，其他條件設(shè)定為可溶性固形物含量2.5%、鈣化pH 7、酸化pH 2，考察不同水洗次數(shù)對果膠和中性糖純度的影響。

1.3.2.4 酸化pH值的確定

制備混合多糖濃縮液，調(diào)酸化pH值分別為0、1、2、3、4，其他條件設(shè)定為可溶性固形物含量2.5%、鈣化pH 7、水洗4 次，考察不同酸化pH值對果膠和中性糖純度的影響。

1.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)，對可溶性固形物含量、鈣化pH值、水洗次數(shù)和酸化pH值四因素的條件進(jìn)行優(yōu)化，方案設(shè)計(jì)如表1所示。

表 1 正交試驗(yàn)分離條件因素水平表Table1 Factors and levels used in the orthogonal array design for optimizing separation conditions

1.3.4 純度測定

果膠純度以半乳糖醛酸含量計(jì)，參照GB 25533—2010《食品添加劑：果膠》[18]方法。

中性糖純度以總糖含量計(jì)，參考許會生等[19]針對糖醛酸與中性糖共存情況下各組分的測定改良方法，采用苯酚-硫酸法進(jìn)行測定。

1.3.5 得率計(jì)算

1.3.6 產(chǎn)品感官鑒別定性

參照GB 25533—2010[18]方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 可溶性固形物含量對果膠和中性糖純度的影響

圖 1 可溶性固形物含量對果膠和中性糖純度的影響Fig.1 Effect of soluble solids content on the purities of pectin and neutral sugars

由圖1可知，隨混合多糖濃縮液中可溶性固形物含量的增大，果膠純度逐漸降低，這是由于當(dāng)混合多糖溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高時(shí)， Ca2＋與果膠反應(yīng)更快，對溶液中的中性糖組分包埋程度較大，致使果膠純度降低[20]；而中性糖組分的純度逐漸上升后趨于平緩，原因是果膠酸鈣復(fù)合物在體系中存在解離平衡，當(dāng)混合多糖溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)較小時(shí)，不利于果膠酸鈣的形成，導(dǎo)致離心后殘留在上清液中的果膠多糖越多，混入中性糖組分中降低了其純度。

2.1.2 鈣化pH值對果膠和中性糖純度的影響

圖 2 鈣化pH值對果膠和中性糖純度的影響Fig.2 Effect of calcification pH value on the purities of pectin and neutral sugars

由圖2可知，從果膠純度的走勢推斷，反應(yīng)體系分別為酸性、中性和堿性的情況下，果膠與Ca2＋的反應(yīng)結(jié)合機(jī)理有差別，從而影響了中性糖組分的純度。

當(dāng)pH＜7時(shí)，溶液呈酸性，果膠與Ca2＋成膠的同時(shí)有微弱逆反應(yīng)存在，使得少量果膠酸鈣水解成果膠后殘留在離心上清液中，所以果膠純度較高而中性糖純度偏低；當(dāng)pH 7時(shí)，溶液呈中性，果膠與Ca2＋結(jié)合不受其他離子干擾，反應(yīng)速率最快。中性糖組分被包埋在果膠酸鈣中的程度最大，導(dǎo)致果膠純度最低；當(dāng)pH＞7時(shí)，果膠純度先升高后略微下降，推測是由離子競爭反應(yīng)和β-消去反應(yīng)共同作用所致。當(dāng)Ca2＋加入到堿性多糖濃縮液中的瞬間，OH-暫時(shí)與部分Ca2＋生成微溶于水的Ca(OH)2，降低了Ca2＋濃度，使得果膠與Ca2＋反應(yīng)速率減慢；另外，在堿性環(huán)境下，果膠分子自身會不可避免的發(fā)生β-消去反應(yīng)，對果膠性質(zhì)有不良影響。堿性越大，該反應(yīng)越劇烈[23]。

另外，果膠酸鈣在不同酸堿環(huán)境中的存在形式也存在差異。在酸性和中性條件下，果膠與Ca2＋形成的凝膠能夠穩(wěn)定存在；在堿性條件下，果膠與Ca2＋形成的凝膠不穩(wěn)定，其以沉淀形式存在，現(xiàn)象同已有研究[21-22]的描述一致。但果膠酸鈣的存在形式并不影響后期處理效果。2.1.3 水洗次數(shù)對果膠和中性糖純度的影響

圖 3 水洗次數(shù)對果膠和中性糖純度的影響Fig.3 Effect of washing cycles on the purities of pectin and neutral sugars

由圖3可知，隨著水洗次數(shù)的增加，果膠純度先逐漸上升后趨于平緩，這是由于附著于果膠酸鈣表面未成膠的中性糖組分溶于熱蒸餾水而被洗至了離心上清液中；另外，果膠酸鈣在熱蒸餾水中存在可逆反應(yīng)[2]，水洗次數(shù)越多損失越多，即離心上清液中果膠殘留總量越多，致使中性糖組分純度略微降低。

2.1.4 酸化pH值對果膠和中性糖純度的影響

圖 4 酸化pH值對果膠和中性糖純度的影響Fig.4 Effect of acidification pH value on the purities of pectin and neutral sugars

由圖4可知，隨酸化pH值的升高，果膠純度先升高后降低，中性糖組分純度無顯著變化。當(dāng)pH值小于2時(shí)，果膠純度隨酸化pH值的升高有所升高，推測可能是過酸條件下果膠多糖比其他物質(zhì)降解速率略快所致，其原因有待進(jìn)一步探究；當(dāng)pH值大于2時(shí)，由于果膠酸鈣脫Ca2＋不完全[2]，果膠純度隨酸化pH值的升高有所降低。

2.2 果膠和中性糖分離正交試驗(yàn)優(yōu)化

由表2中半乳糖醛酸含量極差分析可知，各因素對果膠純度的影響次序?yàn)镃＞A＞B＞D，即影響因素由主到次依次為水洗次數(shù)、可溶性固形物含量、鈣化pH值、酸化pH值，制得最高純度果膠的分離條件參數(shù)為C3A1B2D2。

表 2 正交試驗(yàn)L9（34）結(jié)果Table 2 L9(34) Orthogonal array design and experimental results

由表2中總糖含量極差分析可知，各因素對中性糖純度的影響次序?yàn)锳＞B＞C＞D，即影響因素由主到次依次為可溶性固形物含量、鈣化pH值、水洗次數(shù)、酸化pH值，制得最高純度中性糖組分的分離條件參數(shù)為A3B3C1D1。

表2數(shù)據(jù)中兩者的R值顯示各因素對果膠純度的影響均大于對中性糖純度的影響；本研究所制得的果膠和中性糖兩者的純度相互制約。綜合考慮各因素對果膠和中性糖純度的影響程度以及本研究目的，本著敏感指標(biāo)優(yōu)先考慮、主要因素優(yōu)先滿足的原則，保證果膠和中性糖兩組分純度較高的最優(yōu)分離條件參數(shù)應(yīng)為A1B2C3D2。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由于得出的最優(yōu)分離條件組合A1B2C3D2在正交試驗(yàn)中并沒有包含，需要補(bǔ)充驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)對比L9（34）中A1B1C3D2（方案1）與A1B2C3D2的分離效果，見表3。最終確定最優(yōu)分離條件為A1B2C3D2。

表 3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of verification experiments

2.4 感官鑒別定性

2.4.1 感官評定結(jié)果

本研究從豆皮水溶性多糖中分離制得的果膠和中性糖兩組分，均易溶于水，而兩者的水溶液及干燥產(chǎn)物卻有其各自的特點(diǎn)。如表4所示，當(dāng)果膠溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%時(shí)，溶液無色透明，干燥后的果膠呈透明片狀，較脆易碎，須經(jīng)粉碎后得微晶狀粉末果膠；相比之下，同質(zhì)量分?jǐn)?shù)中性糖溶液為半透明乳白色，干燥后直接可得質(zhì)地松散的纖維狀粉末。這是由于果膠多糖富含羧酸基，在水溶液中易形成氫鍵等次級鍵以相互交聯(lián)形成聚集體，更具柔性和伸展性，溶液透明度更好。中性糖在水溶液中不易聚集，呈多分散的桿狀[9]，干燥后即為松散的粉末。

表 4 感官評定結(jié)果Table 4 Sensory evaluation results

2.4.2 果膠鑒別定性結(jié)果

對果膠組分進(jìn)行鑒別定性，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的果膠溶液經(jīng)加熱冷卻后形成黏稠狀液體；5 mL 1%的果膠溶液與1 mL 0.02 mol/L NaOH溶液混合后形成透明半凝膠沉淀，向其中加入1 mL鹽酸溶液，加熱后形成白色絮狀沉淀。上述現(xiàn)象完全符合GB 25533—2010要求。

3 結(jié) 論

一般方法提取的豆皮水溶性多糖中半乳糖醛酸計(jì)含量僅約為40%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于商品化果膠（半乳糖醛酸含量不小于65%）要求。本研究基于果膠遇Ca2＋形成凝膠而中性糖不反應(yīng)[2]的特點(diǎn)，通過單因素和正交試驗(yàn)探討了可溶性固形物含量、鈣化pH值、水洗次數(shù)以及酸化pH值對豆皮水溶性多糖分離效果的影響，結(jié)果表明：果膠和中性糖兩組分的純度相互制約，各因素對果膠純度的影響均大于對中性糖純度的影響；各因素對果膠純度影響主次順序?yàn)镃＞A＞B＞D，而對中性糖純度的影響主次順序?yàn)锳＞B＞C＞D。綜合考慮最終確定的最優(yōu)分離條件為A1B2C3D2，即：可溶性固形物含量2.5%、鈣化pH 8、水洗5 次、酸化pH 2，實(shí)現(xiàn)了果膠和中性糖的有效分離。果膠純度可高達(dá)85.48%，純度和感官鑒別定性結(jié)果均符合國標(biāo)要求，可作為商品果膠；中性糖純度可達(dá)80.01%，為進(jìn)一步探究豆皮中性糖的單糖組成、性質(zhì)、功能以及應(yīng)用價(jià)值鑒定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

目前，尚無合適高效分離果膠與中性糖的方法一直是限制豆皮果膠工業(yè)化生產(chǎn)的問題所在，本研究證實(shí)了CaCl2法分離豆皮水溶性多糖中果膠與中性糖兩組分的可行性，拓寬了豆皮多糖的應(yīng)用領(lǐng)域，使豆皮高值化生產(chǎn)及利用成為可能。本法操作簡便，成本低，綠色無污染，適合于工業(yè)化大生產(chǎn)，有望成為緩解高純度果膠市場壓力的有效途徑。

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Optimization by Orthogonal Array Design of Pectin Separation from Soluble Soybean-Hull Polysaccharide

LI Qunfei, AN Ning, YU Dan, SUN Zizi, WEI Yuliang, CHI Yusen*
(College of Food Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China)

Objective: To develop a suitable industrial method for effi cient separation of pectin from soluble soybean-hull polysaccharide. Methods: Based on single factor experiments, the effects of soluble solids content (A), calcification pH value (B), washing cycles (C) and acidifi cation pH value (D) on the purities of pectin and neutral sugar were investigated through L9(34) orthogonal experiments. Results: All the investigated factors affected more significantly the purity of pectin than that of neutral sugar. The infl uences of the four factors on the purity of pectin followed the descending order: C ＞ A ＞ B ＞ D, while the order of their effects on the purity of neutral sugar was as follows: A ＞ B ＞ C ＞ D. Based on comprehensive consideration the optimum separation conditions were determined as 2.5%, 8, 5, and 2 for soluble solids content, calcifi cation pH value, washing cycles, and acidifi cation pH value, respectively. Experiments conducted under these conditions resulted in a pectin purity of 85.48%, a pectin yield of 31.3%, a neutral sugar purity of 80.01% and a neutral sugar yield of 64.9%. Conclusion: The proposed separation method is effective, practical, easy to operate, low-cost, green pollution-free, and suitable for industrial production.

soluble soybean-hull polysaccharide; separation; pectin; neutral sugar

TS209

A

1002-6630（2015）08-0092-05

10.7506/spkx1002-6630-201508016

2014-09-10

李群飛（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘钚晕镔|(zhì)。E-mail：liqunfeixx@yeah.net

*通信作者：遲玉森（1962—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樯锘钚晕镔|(zhì)及農(nóng)產(chǎn)品高值化。E-mail：sd-chiyusen@163.com