金蓮花中葒草苷和牡荊苷對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠血清及組織抗氧化活性的動(dòng)態(tài)影響

金蓮花中葒草苷和牡荊苷對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠血清及組織抗氧化活性的動(dòng)態(tài)影響

屈海琪楊國(guó)棟蔣偉袁丹華王書(shū)華安芳

(河北北方學(xué)院藥學(xué)系，河北張家口075000)

摘要〔〕目的研究金蓮花中葒草苷和牡荊苷對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠血清總抗氧化能力(T-AOC)及組織細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)酶活性動(dòng)態(tài)變化及比較葒草苷和牡荊苷藥物抗氧化的構(gòu)效關(guān)系。方法通過(guò)腹腔注射D-半乳糖，造成小鼠亞急性衰老，經(jīng)過(guò)8 w造模并且驗(yàn)證模型成功后，隨機(jī)分為正常組，模型組，維生素E對(duì)照組，葒草苷和牡荊苷低、中、高各三個(gè)劑量組，并從第9周開(kāi)始各治療組每日上午分別口服灌胃給藥一次。給藥2、4、6、8 w后，分別斷頭處死衰老小鼠，測(cè)定血清T-AOC及腎、肝、腦組織中細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)離子能力。結(jié)果葒草苷和牡荊苷具有提高衰老小鼠血清T-AOC及腎、肝、腦組織中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性。與模型組相比，給藥2、4 w后，各劑量組血清T-AOC及組織中ATP酶活性雖有提高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，給藥6、8 w后，各劑量組血清T-AOC及組織中ATP酶活性顯著提高(P均<0.01)；葒草苷與牡荊苷相比，給藥2、4 w后，各劑量組在提高血清T-AOC及組織中ATP酶的活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，給藥6、8 w后，紅草苷中、低劑量組在提高血清T-AOC及組織中ATP酶的活性上高于牡荊苷同等劑量組(P<0.05)，高劑量組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)；給藥8 w后，葒草苷和牡荊苷中、低劑量組在提高血清T-AOC及組織中ATP酶的活性上低于VE(P<0.05)，而高劑量組與維生素E組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)。 結(jié)論葒草苷和牡荊苷給藥6 w后，顯著提高D-半乳糖致衰老小鼠血清T-AOC活性，對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠組織細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力的保護(hù)作用顯著。其中，中、低劑量組葒草苷的抗氧化作用優(yōu)于牡荊苷，葒草苷和牡荊苷的高劑量組與維生素E作用相當(dāng)。

關(guān)鍵詞〔〕葒草苷；牡荊苷；D-半乳糖；抗氧化

中圖分類號(hào)〔〕R285〔

基金項(xiàng)目：張家口市科技局(11110015D)

通訊作者：安芳(1965-)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥有效成分的提取及藥理研究。

第一作者：屈海琪(1985-)，女，碩士，主要從事中藥有效成分提取分離及藥代學(xué)研究。

現(xiàn)代藥理研究表明，金蓮花中其主要活性成分是黃酮類化合物，具有抗病毒、抑菌、體外抑制多種腫瘤細(xì)胞株增殖的作用〔1～4〕。藥動(dòng)學(xué)研究指出，葒草苷和牡荊苷在動(dòng)物體內(nèi)吸收、分布、起效均較為迅速，組織分布中尤以腎臟濃度最高〔5，6〕。研究還證實(shí)了金蓮花黃酮及單體葒草苷和牡荊苷良好的體內(nèi)外抗氧化作用〔7，8〕，有關(guān)衰老動(dòng)物體內(nèi)抗氧化研究多僅限于一個(gè)時(shí)間點(diǎn)〔9，10〕，本實(shí)驗(yàn)觀察給藥2、4、6、8 w后各時(shí)間點(diǎn)葒草苷和牡荊苷對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠血清總抗氧化能力(T-AOC)及組織中轉(zhuǎn)運(yùn)酶活性的影響，比較葒草苷和牡荊苷保護(hù)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力作用的動(dòng)態(tài)變化。

1材料與儀器

1.1試劑及藥品D-半乳糖(分析純)，上海試一化學(xué)試劑有限公司；牛血清蛋白(分析純)，鄭州益康有限公司；生理鹽水，石家莊第四制藥廠；T-AOC測(cè)試盒，南京建成生物有限公司(批號(hào)：20100610)；Na+-K+-ATP酶測(cè)試盒，南京建成生物有限公司(批號(hào)：20100920)；Ca2+-Mg2+-ATP酶測(cè)試盒，南京建成生物有限公司(批號(hào)：20100920)；考馬斯亮藍(lán)蛋白試劑盒，南京建成生物有限公司(批號(hào)：20100918)；N，N-二甲基甲酰胺，分析純，上海試一化學(xué)試劑有限公司；吐溫-80，分析純，上海試一化學(xué)試劑有限公司。葒草苷和牡荊苷(自制，經(jīng)1H-NMR和HPLC鑒定，純度98.9%)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠(河北北方學(xué)院動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK京2004-0001)，于18～25 ℃室溫下分籠飼養(yǎng)。

1.3動(dòng)物分組健康的昆明種小鼠280只(雌雄各半)，隨機(jī)分為正常組、模型組、葒草苷和牡荊苷低、中、高各三個(gè)劑量組、維生素E對(duì)照組，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后造模。

1.4造模方法采用D-半乳糖致亞急性衰老法〔11〕，在500 ml生理鹽水中溶解10.0 g D-半乳糖，對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射，注射劑量為200 mg·kg-1·d-1，正常組以等體積生理鹽水替代，造模8 w，每天給藥劑量以小鼠體重變化來(lái)調(diào)整。

1.5給藥方法葒草苷和牡荊苷溶液的配制：葒草苷和牡荊苷較難溶于水，經(jīng)預(yù)試，N，N-二甲基甲酰胺:吐溫-80：生理鹽水=1∶1∶20為溶劑。從第9周始每日上午，各治療組分別給予灌胃給藥維生素E組給藥劑量(20 mg/kg)，葒草苷、牡荊苷高中低三劑量組分別給藥劑量是40、20、10 mg/kg，每天的給藥劑量依據(jù)小鼠體重變化進(jìn)行調(diào)整，模型組和正常組給等體積的溶劑。葒草苷和牡荊苷組給藥時(shí)間設(shè)定2、4、6、8 w，維生素E組給藥時(shí)間為8 w。

1.6血清T-AOC的測(cè)定機(jī)體中有許多抗氧化物質(zhì)，能使Fe3+還原成Fe2+，后者可與菲琳類物質(zhì)形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，通過(guò)比色，可測(cè)出其抗氧化能力的高低。給藥2、4、6、8 w后，小鼠斷頭取血，以4 000 r/min離心10 min，取血清按照試劑盒上說(shuō)明要求操作。T-AOC(U/ml)=〔(A測(cè)定管-A對(duì)照管)/0.3〕×(反應(yīng)液總體積/取樣的體積)×稀釋前的倍數(shù)。

1.7組織Na+-K+-ATP和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性測(cè)定分別處死給藥不同周期的小鼠后，準(zhǔn)確稱取小鼠肝、腦、腎組織重量，按10%重量體積比制成組織勻漿液，再取一定量的勻漿液加99倍的生理鹽水制成0.1%的組織勻漿液0.1 ml，用考馬斯亮藍(lán)試劑測(cè)定組織蛋白。根據(jù)公式計(jì)算酶的活性。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行LSD檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1葒草苷和牡荊苷對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠血清T-AOC的影響葒草苷和牡荊苷具有提高D-半乳糖致衰老小鼠血清中T-AOC的能力，與正常組〔(16.70±3.82)U/ml〕相比，模型組中小鼠血清T-AOC明顯低于正常組〔(8.91±1.13)U/L,P<0.01〕；與模型組相比，第2、4周葒草苷和牡荊苷各治療組小鼠血清T-AOC活性有所提高，但無(wú)顯著性差異；第6、8周，葒草苷和牡荊苷各治療組使小鼠血清T-AOC活性明顯提高(P<0.01)。給藥8 w后，葒草苷和牡荊苷中、低劑量對(duì)提高小鼠血清T-AOC活性作用上弱于維生素E組(15.06±1.40，P<0.05)；葒草苷和牡荊苷高劑量組與維生素E組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)。葒草苷組與牡荊苷組相比，給藥2、4 w后，各劑量組提高小鼠血清T-AOC活性無(wú)顯著差異；給藥6、8 w后，葒草苷中、低劑量組提高小鼠血清T-AOC活性高于牡荊苷同等劑量組(P<0.05)；高劑量組間無(wú)顯著差異。見(jiàn)表1。

表1　葒草苷和牡荊苷對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠血清T-AOC的影響 ± s，U/ml)

與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與維生素E組比較：3)P<0.05；與葒草苷中劑量組比較：4)P<0.05；與葒草苷低劑量組比較：5)P<0.05，表3、表4、表5同

2.2葒草苷和牡荊苷對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠體內(nèi)組織細(xì)胞膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力的影響與正常組相比，模型組小鼠組織內(nèi)Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，給藥2、4 w后，葒草苷和牡荊苷各治療組能夠提高Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性，但無(wú)顯著差異(P>0.05)；給藥6、8 w后，葒草苷和牡荊苷各治療組明顯提高Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性(P均<0.05)，說(shuō)明小鼠衰老后細(xì)胞膜的Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明顯降低，而各治療組均具有升高Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的作用。與維生素E組相比，給藥8 w后，葒草苷和牡荊苷中、低劑量組在提高組織細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性上作用較弱(P<0.05)；高劑量組與維生素E組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。葒草苷組和牡荊苷組相比，給藥2、4 w后，各劑量組在提高組織中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性上無(wú)顯著性差異(P>0.05)；給藥6、8 w后，葒草苷中、低劑量組在對(duì)組織中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性影響上作用明顯高于牡荊苷同等劑量組(P<0.05)；高劑量組之間相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)表2～表5。

表2　各組衰老小鼠不同組織Na +-K +-ATP酶和Ca 2+-Mg 2+-ATP酶活性

與模型組比較:1)P<0.01

表3　葒草苷和牡荊苷對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠腎組織中Na +-K +-ATP酶和Ca 2+-Mg 2+-ATP酶活性的影響

表4　葒草苷和牡荊苷對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠肝組織中Na +-K +-ATP酶和Ca 2+-Mg 2+-ATP酶活性的影響

表5　葒草苷和牡荊苷對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠腦組織中Na +-K +-ATP酶和Ca 2+-Mg 2+-ATP酶活性的影響

3討論

人口老齡化使得與衰老相關(guān)因素的研究越來(lái)越受到人們的關(guān)注，至于衰老的機(jī)制目前還眾說(shuō)紛紜，其中自由基學(xué)說(shuō)被廣泛接受〔12〕。研究表明，由D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型已逐漸用于老年病、衰老機(jī)制及抗衰老藥物篩選等方面的研究〔13〕。

T-AOC在機(jī)體防御體系中占據(jù)著重要的作用，通過(guò)清除機(jī)體內(nèi)濃度過(guò)高的活性氧自由基，預(yù)防自由基機(jī)制的失衡，從而使機(jī)體保持在相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，它可代表非酶促系統(tǒng)和抗氧化酶系統(tǒng)的變化〔14〕。老齡化過(guò)程中，病理生理尤為突出的一個(gè)重要環(huán)節(jié)是T-AOC水平的下降，也正是因此導(dǎo)致體內(nèi)過(guò)多活性氧不能及時(shí)清除而造成積聚。這種機(jī)能的降低，常常導(dǎo)致疾病的發(fā)生和衰老的提前到來(lái)，因此體內(nèi)的T-AOC水平的檢測(cè)就顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示葒草苷、牡荊苷能夠有效地提高機(jī)體內(nèi)T-AOC的活性，葒草苷在提高機(jī)體內(nèi)T-AOC的活性方面要優(yōu)于牡荊苷，這可能與葒草苷和牡荊苷的結(jié)構(gòu)差異有關(guān)， B環(huán)上具有鄰二酚羥基的黃酮較B環(huán)上只連有單個(gè)酚羥基的黃酮氧化活性強(qiáng)。

Na+-K+-ATP酶活性與年齡的增加呈負(fù)相關(guān)，酶活性的降低使得細(xì)胞內(nèi)ATP的生成減少，導(dǎo)致鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，造成新陳代謝紊亂，從而使細(xì)胞的整體功能受到影響〔15〕。細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度大幅增加是ATP酶活性降低的另一結(jié)果，高水平的Ca2+將影響神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞骨架和膜結(jié)構(gòu)，使穩(wěn)定性降低，膜通透性增大，進(jìn)而產(chǎn)生一系列惡性循環(huán)〔16〕。

本實(shí)驗(yàn)在動(dòng)態(tài)的抗氧化研究中發(fā)現(xiàn)，給藥周期為2～4 w時(shí)，葒草苷和牡荊苷還不能有效地發(fā)揮其抗氧化作用，當(dāng)給藥周期為6 w時(shí)，其抗氧化能力已經(jīng)與給藥8 w時(shí)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，為今后抗衰老縮短給藥時(shí)間，發(fā)揮良好藥效，避免藥物體內(nèi)積累，安全用藥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。且葒草苷對(duì)于提高組織細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)酶的活性高于牡荊苷，發(fā)揮抗氧化作用與維生素E相當(dāng)。

4參考文獻(xiàn)

1蘇連杰，田鶴，馬麗英.金蓮花醇提物體內(nèi)抗病毒作用的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中草藥，2007；38(7)：1062-4.

2Li YL,Ma SC,Yang YT,etal.Antiviral activities of flavonoids and origanic acid from Trollius chinensis Bunge 〔J〕.Ethnophopharmacol,2002;79(3):365-8.

3孫黎，劉芳，劉華，等.金蓮花黃酮對(duì)人體乳腺癌細(xì)胞作用的研究〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2009；29(5)：1098-9.

4孫黎，羅強(qiáng)，張力，等.金蓮花黃酮對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2011；31(1)：82-3.

5曲彩紅.金蓮花中葒草苷兔體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究〔D〕.河北北方學(xué)院，2010.

6顏娟.金蓮花中牡荊苷兔體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究〔D〕.河北北方學(xué)院，2010.

7田嘉銘，楊國(guó)棟，饒娜，等.金蓮花中葒草苷和牡荊苷對(duì)D-半乳糖致衰小鼠細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2012；32(9)：3945-7.

8蔣偉，屈海琪，袁丹華，等.金蓮花中葒草苷和牡荊苷對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠腦損傷的保護(hù)作用〔J〕.中草藥，2012；43(7)：1376-80.

9范紅艷，顧饒勝，王春艷，等.大豆異黃酮抗衰老作用研究〔J〕.中草藥，2010；41(12)：2054-7.

10遲曉星，張濤，錢麗麗，等.大豆異黃酮對(duì)青年雌性大鼠卵巢、子宮組織中Bcl-2 mRNA和Bax mRNA表達(dá)的影響〔J〕.食品科學(xué)，2010；31(11)：231-3.

11苗明三.五味子多糖對(duì)衰老模型小鼠的影響〔J〕.中國(guó)醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2002；27(3)：187.

12Droge W.Oxidative stress and aging〔J〕.Adv Exp Med.Biol,2003;543:191-200.

13Cui X,Zou P,Zhang Q,etal.Chronic systemic D-galactose exposure induces memory loss，neurodegeneration，and oxidative damage in mice protective effects of R-alpha-lipoic acid〔J〕.Neurosci Res,2006;83:1584-90.

14李云，楊素青，張軍.急性致衰老動(dòng)物模型的探討〔J〕.衛(wèi)生研究，2002；31(4)：290-1.

15梁晚益，楊宗誠(chéng)，黃躍生.線粒體Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)與細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)〔J〕.生理科學(xué)進(jìn)展，2000；4(31)：357.

16Germann I,Hagelauer D,Kelber O,etal.Antioxidative properties of the gastrointestinal phytopharmaceutical remedy STW(Iberogast(R))〔J〕.Phytomedicine,2006;13(1):45-5.

〔2013-07-04修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)