褪黑素對高血壓模型大鼠基底前腦和海馬細胞及學(xué)習(xí)記憶的影響

褪黑素對高血壓模型大鼠基底前腦和海馬細胞及學(xué)習(xí)記憶的影響

磨潔琳郭靈曾慶堂

(廣西醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)教研室，廣西南寧530021)

摘要〔〕目的探討在褪黑素干預(yù)高血壓模型大鼠過程中基底前腦三個膽堿能核團神經(jīng)元、海馬星形膠質(zhì)細胞、學(xué)習(xí)記憶之間變化的相互關(guān)系。方法建立腎性高血壓大鼠模型，應(yīng)用免疫組化方法與Morris水迷宮系統(tǒng)，觀察外源性褪黑素干預(yù)后，基底前腦內(nèi)側(cè)隔核(MS)、斜角帶核垂直支(vDB)與水平支(hDB)的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)陽性細胞、海馬CA1區(qū)的膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)陽性細胞變化及學(xué)習(xí)記憶變化的趨勢及其相互關(guān)系。結(jié)果腎性高血壓大鼠的hDB的ChAT陽性細胞數(shù)明顯下降，海馬CA1區(qū)的GFAP陽性細胞數(shù)明顯升高，學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降(P<0.05)；應(yīng)用褪黑素后可將上述指標(biāo)的異常變化逆轉(zhuǎn)到接近正常的水平(P<0.05)，但MS或hDB的ChAT陽性細胞數(shù)始終均無顯著變化(P>0.05)；各組大鼠的ChAT陽性細胞形態(tài)或GFAP陽性細胞形態(tài)亦均無明顯差異。結(jié)論在腎性高血壓模型大鼠中，褪黑素具有保護基底前腦膽堿能神經(jīng)元免遭損害的作用，并對海馬星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生抑制效應(yīng)，褪黑素在早期防治因高血壓而誘發(fā)的老年血管性癡呆或老年性癡呆可能具有實用價值。

關(guān)鍵詞〔〕高血壓；褪黑素；基底前腦；膽堿能神經(jīng)元；海馬；星形膠質(zhì)細胞；學(xué)習(xí)記憶

中圖分類號〔〕R332〔

基金項目：廣西青年科學(xué)

通訊作者：郭靈(1960-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事發(fā)育神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)研究。

第一作者：磨潔琳(1978-)，女，碩士，講師，主要從事神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)研究。

如今已能夠人工合成褪黑素，并將其用于治療高血壓及某些腦病獲得良好的效果〔1，2〕；外源性褪黑素尚可糾正高血壓模型大鼠的神經(jīng)發(fā)生異常與學(xué)習(xí)記憶障礙〔3〕；在高血壓患者的自然增齡過程中，可損傷老年的膽堿能基底前腦與海馬，導(dǎo)致老年血管性癡呆或老年性癡呆(AD)的發(fā)生〔4，5〕。然而膽堿能基底前腦的神經(jīng)核團眾多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，這些核團又與海馬密切聯(lián)系〔6〕。本文觀察膽堿能基底前腦的三個核團——內(nèi)側(cè)隔核(MS)、斜角帶核垂直支(vDB)、斜角帶核水平支(hDB)的膽堿能神經(jīng)元表達的標(biāo)志物膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)、海馬CA1區(qū)星形膠質(zhì)細胞表達的標(biāo)志物膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)、學(xué)習(xí)記憶三者變化的相互關(guān)系。

1材料與方法

1.1材料褪黑素、小鼠抗大鼠膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)單克隆抗體、ABC 試劑盒、粉末型對氨基聯(lián)苯胺(DAB)、硫酸鎳胺均購自Sigma公司；小鼠抗大鼠膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)單克隆抗體，購自Chemicon公司； DMS-2型Morris水迷宮購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所；HM500高級雙制冷切片機購自德國Leica公司；C2目鏡微測尺購自上海光學(xué)儀器廠。

1.2方法

1.2.1實驗動物及分組選取清潔級Wistar雄性大鼠40只(體重140～170 g)，由廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境溫度25℃～28℃，光暗周期12 h。隨機分為四組：正常組、假手術(shù)組、高血壓組、褪黑素組，每組10只，假手術(shù)組的大鼠手術(shù)除不給兩側(cè)腎動脈安置銀夾外，其余手術(shù)步驟均與高血壓組的相一致；未給正常組大鼠做任何處理，但在相同條件下飼養(yǎng)。

1.2.2建立動物模型與藥物干預(yù)參考黃如訓(xùn)等〔7〕雙腎雙夾法，在大鼠兩側(cè)腎動脈安置銀夾從而制成腎性高血壓模型，對處于清醒狀態(tài)下的大鼠用套尾法測量其尾動脈收縮壓，將術(shù)后第4周血壓>150 mmHg的大鼠確定為建立腎性高血壓模型成功的大鼠〔7〕，最后將術(shù)后6w血壓仍然超過上述標(biāo)準(zhǔn)的大鼠隨機抽樣分入高血壓組或褪黑素組，并進行相應(yīng)干預(yù)。褪黑素組，每日上午10時，按劑量(20 μg/kg體重)腹腔注射褪黑素(將褪黑素溶解于5%乙醇生理鹽水中)；假手術(shù)組，腹腔注射等體積的5%乙醇生理鹽水，這兩組大鼠均在相同時間和地點連續(xù)腹腔注射14 d，正常組和高血壓組不進行任何干預(yù)。

1.2.3Morris水迷宮測試在完成相應(yīng)的干預(yù)后，對每組大鼠進行定位航行測試和空間探索試驗，分別記錄大鼠在120 s內(nèi)找到平臺的逃避潛伏期時間和記錄大鼠在120 s內(nèi)游泳穿越過原來所放下平臺位置的次數(shù)(跨平臺次數(shù))，前一項指標(biāo)反映出被測試大鼠的學(xué)習(xí)能力：逃避潛伏期越長，學(xué)習(xí)能力越弱，反之亦然；后一項指標(biāo)反映出被測試大鼠的空間記憶能力：跨平臺次數(shù)越多，空間記憶能力越強，反之亦然。

1.2.4固定與組織切片完成行為測試后，1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，開胸經(jīng)左心室插管至升主動脈用4%多聚甲醛(0.1 mol/L PBS配制，pH7.4)灌注固定大鼠。固定完畢首先除掉大鼠顱蓋骨，繼之用耳桿分別插入兩側(cè)外耳道底，將大鼠頭部正確安置在腦立體定位儀上，最后參照大鼠腦立體定位圖譜〔8〕，暴露并切取出含有基底前腦和海馬組織塊，冠狀連續(xù)冰凍切片，隔三取一，片厚40 μm，待染色反應(yīng)。

1.2.5免疫組織化學(xué)反應(yīng)染色應(yīng)用ABC法對基底前腦的MS、vDB與hDB的切片進行ChAT(1∶800)免疫組織化學(xué)反應(yīng)染色；對海馬的切片進行GFAP(1∶800)免疫組織化學(xué)染色反應(yīng)，DAB加入硫酸鎳胺顯色(陽性反應(yīng)顏色為紫藍色)；常規(guī)脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。陰性對照反應(yīng)除用PBS液體代替笫一抗體外，其余步驟與上述相同(反應(yīng)結(jié)果為無顏色)。

1.2.6細胞觀察和計數(shù)在10×40倍的光鏡下，觀察細胞形態(tài)變化并進行細胞計數(shù)。ChAT陽性細胞計數(shù)：每只大鼠選擇基底前腦的MS、vDB、hDB典型切面(前囟前0.4 mm、0.2 mm、 0.0 mm)各3張切片〔8〕。三個核團在光鏡下的境界劃分方法是：經(jīng)兩側(cè)前連合上緣及視神經(jīng)背側(cè)的腦腹側(cè)溝頂端各作一條橫線，在上橫線上方的區(qū)域為MS，在上、下兩橫線之間的區(qū)域為vDB，在下橫線下方的區(qū)域為hDB。計數(shù)時，凡壓在上、下橫線的細胞分別計入MS和vDB內(nèi)。分別計數(shù)右側(cè)MS、vDB和hDB內(nèi)所有陽性細胞數(shù)，并觀察細胞形態(tài)變化。每只大鼠選取右側(cè)海馬CA1區(qū)(前囟后3.2 mm、3.4 mm、3.6 mm)切片各3張〔8〕，對每張切片的相應(yīng)部位隨機選取3個視野，計數(shù)所有陽性細胞，并觀察細胞形態(tài)變化。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析及Games-Howell檢驗。

2結(jié)果

2.1Morris水迷宮行為測定結(jié)果在四組大鼠中，高血壓組大鼠的逃避潛伏期最長(P<0.05)，而跨平臺次數(shù)則變得最少(P<0.05)；褪黑素組大鼠的逃避潛伏期與跨平臺次數(shù)分別比高血壓組大鼠的眀顯縮短或眀顯增多(P<0.05)，并接近于假手術(shù)組或正常組大鼠的水平(P>0.05)。見表1。

表1　四組大鼠水迷宮測試指標(biāo)比較 ± s， n=10)

與假手術(shù)組或正常組比較：1)P<0.05；與高血壓組比較：2)P<0.05，下表同

圖1　四組大鼠斜角帶水平支(hDB) 的 ChAT陽性細胞的變化(DAB,×400)

圖2　四組大鼠海馬CA1區(qū)的GFAP陽性細胞的 變化(DAB，×400)

2.2各腦組織ChAT、GFAP陽性細胞表達比較圖1，圖2可見，基底前腦ChAT免疫反應(yīng)產(chǎn)物被染成紫藍色，主要位于神經(jīng)元胞質(zhì)及近側(cè)突起內(nèi)，而胞核未著色。四組大鼠的MS、vDB與hDB的ChAT陽性細胞的形態(tài)與大小均無明顯差異。海馬CA1區(qū)的GFAP陽性細胞形態(tài)似蜘蛛狀，胞體和突起呈紫藍色；四組大鼠的GFAP陽性細胞形態(tài)與大小也均無明顯變化。在四組大鼠中，高血壓組大鼠hDB的ChAT 陽性細胞數(shù)最少(P<0.05)，而海馬CA1區(qū)的GFAP陽性細胞數(shù)則最多(P<0.05)；褪黑素組大鼠hDB的ChAT 陽性細胞數(shù)較高血壓組大鼠hDB的眀顯升高(P<0.05)，但褪黑素組大鼠海馬CA1區(qū)的GFAP陽性細胞數(shù)卻比高血壓組大鼠的眀顯降低(P<0.05)，并接近于假手術(shù)組大鼠或正常組大鼠的水平(P>0.05)。然而，四個組大鼠的MS或vDB的ChAT 陽性細胞數(shù)之間均不存在顯著性差異(P>0.05) 。見表2。

表2　各組大鼠腦組織ChAT及GFAP陽性

3討論

研究證實，高血壓在其發(fā)生與發(fā)展過程中，隨著患者年齡增大而可累及膽堿能基底前腦與海馬等結(jié)構(gòu)，引發(fā)老年血管性癡呆或老年性癡呆〔4，5〕，使患者最終喪失最基本的生活自理能力，給家庭及社會帶來嚴(yán)重的負擔(dān)，故早期診治這類致殘的終極性疾病格外重要。然而，目前在高血壓的消長中，有關(guān)膽堿能基底前腦的具體核團受到損害及其與海馬的相互關(guān)系不夠明確，不利于臨床神經(jīng)科學(xué)的準(zhǔn)確形態(tài)定位診斷；而且也沒有應(yīng)用外源性褪黑素干預(yù)由高血壓可能影響上述結(jié)構(gòu)與功能變化的嘗試，這對篩選出具有防治老年血管性癡呆或老年性癡呆潛力的藥物進行針對性早期干預(yù)也不便利。本文用褪黑素治療高血壓大鼠2 w后，CHAT和GFAP陽性細胞接近正常水平，與其他學(xué)者的結(jié)果相似〔9〕，也與本研究組已報道的結(jié)果相一致〔3〕，說明高血壓在進展到一定時間段后，可對膽堿能基底前腦、海馬及學(xué)習(xí)記憶功能產(chǎn)生負性影響，應(yīng)用褪黑素可以改善這些異常變化。

在本研究的結(jié)果中，膽堿能基底前腦的三個核團的ChAT陽性細胞數(shù)變化并不一致：這為在建立腎性高血壓6 w后膽堿能核團及其神經(jīng)元受損做出了定位——在此階段hDB的ChAT陽性神經(jīng)元數(shù)已受到不良影響，同時也提示基底前腦膽堿能神經(jīng)元核團之間在由高血壓引起損傷的易感性方面可能存在著結(jié)構(gòu)性或部位性的差異。此外，本研究的結(jié)果還顯示，在患高血壓時海馬CA1星形膠質(zhì)細胞數(shù)明顯增多，這可能與該區(qū)域的星形膠質(zhì)細胞針對異常升高的血壓做出應(yīng)答性增生反應(yīng)有關(guān)；相比之下，本研究各組大鼠ChAT陽性細胞形態(tài)或GFAP陽性細胞形態(tài)均無明顯差異，這可能與高血壓未損害到細胞骨架內(nèi)部的構(gòu)筑有關(guān)，但以上推測均仍需要進一步研究加以證實。

本研究結(jié)果還顯示，應(yīng)用外源性褪黑素2 w后，對hDB與海馬CA1細胞所產(chǎn)生的效應(yīng)也是不同的：對hDB的ChAT陽性神經(jīng)元具有正性促進作用，這可能與褪黑素抗氧化應(yīng)激、抗細胞凋亡、高調(diào)ChAT基因表達蛋白產(chǎn)物有關(guān)〔10〕；而對海馬CA1的GFAP陽性細胞具有抑制作用，這可能與褪黑素低調(diào)GFAP基因表達蛋白產(chǎn)物或阻止星形膠質(zhì)細胞增殖有關(guān)，由此便可減少在腦實質(zhì)內(nèi)膠質(zhì)瘢痕的形成，不隨意侵占屬于神經(jīng)元的固有領(lǐng)地，對于確保神經(jīng)元能在既定大小的天然環(huán)境里發(fā)揮正常學(xué)習(xí)記憶功能具有重要的生物學(xué)意義。有關(guān)隱藏在褪黑素對膽堿能神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細胞具有不同作用模式背后的機制可能值得深入研究，或許可從中得到某些個體化防治老年血管性癡呆或老年性癡呆的啟發(fā)。

總之，本研究初步證實了褪黑素可以阻止由腎性高血壓引起的hDB膽堿能神經(jīng)元數(shù)減少，降低海馬CA1區(qū)星形膠質(zhì)細胞數(shù)增多，從而提高學(xué)習(xí)記憶能力；提示褪黑素有可能在防治老年血管性癡呆或老年性癡呆方面成為一個有前景的藥物。

4參考文獻

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〔2013-07-25修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)