衰老大鼠心肌線粒體PT孔開放對(duì)線粒體呼吸功能的影響

衰老大鼠心肌線粒體PT孔開放對(duì)線粒體呼吸功能的影響

趙淑琴孫蒙1陳慧穎1張世忠1

(三峽大學(xué)校醫(yī)院，湖北宜昌443002)

摘要〔〕目的研究衰老大鼠心肌線粒體通透性轉(zhuǎn)換(PT)孔開放對(duì)線粒體呼吸功能的影響及機(jī)制。方法左心室插管檢測(cè)大鼠心功能；透射電鏡檢測(cè)大鼠心肌組織線粒體形態(tài)學(xué)改變；線粒體腫脹法檢測(cè)心肌線粒體PT孔開放程度；氧電極法檢測(cè)大鼠線粒體呼吸速率；熒光法檢測(cè)線粒體膜電位。結(jié)果同3月齡組大鼠相比，15和18月齡組大鼠線粒體出現(xiàn)空泡腫脹、線粒體內(nèi)膜脊出現(xiàn)斷裂；大鼠左室收縮壓(LVSP)和左室壓上升/下降最大速率(±dp/dtmax)降低(P<0.01)；線粒體PT孔開放幅度明顯增強(qiáng)(P<0.01)，左室舒張末壓(LVEDP)升高(P<0.01)；線粒體膜電位下降(P<0.01)；線粒體呼吸速率明顯降低(P<0.01)。線粒體PT孔開放抑制了線粒體呼吸功能，降低了線粒體膜電位(P<0.01)，但是抑制線粒體呼吸功能對(duì)線粒體PT孔開放和線粒體膜電位無影響(P>0.05)。結(jié)論衰老大鼠線粒體PT孔開放可能通過降低線粒體膜電位抑制線粒體呼吸功能。

關(guān)鍵詞〔〕心衰；線粒體PT孔；線粒體；呼吸功能

中圖分類號(hào)〔〕R33〔

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30872716)

通訊作者：張世忠(1970-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事心衰機(jī)制研究。

doi2Halestrap AP,Pass P.The role of the mitochondrial permeability transition pore in heart disease〔J〕.Biochim Biophys Acta,2009;1787(13):1402-15.

Effect of mitochondrial PT pore on mitochondrial respiratory ratio in aged rats

ZHAO Shu-Qin, SUN Meng,CHEN Hui-Ying,etal.

Medical Science College of China Three Gorges University, Yichang 443002, Hubei, China

Abstract【】ObjectiveTo investigate effect of mitochondrial permeability transition (PT)pore opening on mitochondrial respiratory function in aged rats.MethodsCardiac function was measured by inserting a tube into the left ventricle of rats. Morphological changes of hearts from rats were detected by transmission electron microscope. Mitochondrial permeability transition pore opening was measured by mitochondrial swelling method. Mitochondrial respiratory function was measured by oxygen electrode method. Mitochondrial membrane potential was measured by fluorescence method.ResultsCompared with rats aged 3 months, the mitochondria in rats aged 15, 18 months was swollen, vacuolated and the mitochondrial ridge was broken; the LVSP and ±dp/dtmax were decreased(P<0.01)，LVEDP was increased (P<0.01) and mitochondrial membrane potential was decreased(P<0.01)；the opening of mitochondrial permeability transition pore was inhibited the respiratiory function of mitochondria and the mitochondrial membrane potential, respectively(P<0.01).However,inhibition of mitochondrial respiratory function had no effect on opening of mitochondrial permeability transition pore and the mitochondrial membrane potential(P>0.05).ConclusionsOpening of mitochondrial permeability transition pore could inhibit mitochondrial respiratory function via decreasing mitochondrial membrane potential.

【Key words】Heart failure; Mitochondrial permeability transition pore; Mitochondria;Respiratory function

1三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院

第一作者：趙淑琴(1969-)，女，主管護(hù)師，主要從事心衰護(hù)理研究。

線粒體通透性轉(zhuǎn)換(PT)孔是位于線粒體內(nèi)膜上的非特異性孔道〔1〕，在心肌細(xì)胞凋亡、心肌缺血/再灌注損傷中具有重要的作用〔2〕。筆者以往的研究表明，隨年齡增長，線粒體PT孔開放呈增強(qiáng)趨勢(shì)，并伴隨心功能減退和心肌細(xì)胞的大量凋亡〔3，4〕。本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究了線粒體PT孔開放與線粒體呼吸功能的關(guān)系，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討。

1材料與方法

1.1.材料

1.1.1主要試劑魚藤酮、ADP、羧基蒼術(shù)苷、環(huán)孢菌素A、羅丹明123均購自sigma公司，馬斯亮藍(lán)蛋白定量檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程研究所，BSA購自Roche公司，EGTA和Tris-HCl購自Ameresco公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2主要儀器及裝置高速冷凍離心機(jī)(Suprafuge 22，德國)；紫外可見光分光光度計(jì)(UV-2100型,尤尼柯儀器公司)；氧電極(Oxytherm,漢莎科學(xué)儀器有限公司)；多功能顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)；透射電鏡(H-7500，日本)

1.2方法

1.2.1心肌組織形態(tài)學(xué)電鏡檢測(cè)不同月齡(3、15、18月齡)SD大鼠取左心室前側(cè)心肌組織塊切成1 mm×1 mm×1 mm大小，先后經(jīng)2.5%戊二醛和0.1%餓酸雙重固定后，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，然后經(jīng)乙醇-丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂滲透、包埋，半薄切片、超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色后日立H-600透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)變化。

1.2.2在體大鼠心功能檢測(cè)各組大鼠以4%水合氯醛(0.4 g/kg)腹腔注射麻醉，在頸部作正中切口，暴露氣管，氣管插管并接呼吸機(jī)。分離大鼠左側(cè)頸總動(dòng)脈，將導(dǎo)管經(jīng)左側(cè)頸總動(dòng)脈插入左心室，導(dǎo)管另一端與血壓傳感器相連，通過biopac16道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄左室收縮曲線，檢測(cè)左心室收縮壓(LVSP)、左室壓上升和下降最大速率(±dp/dtmax)，左心室舒張末壓(LVEDP)。

1.2.3心肌線粒體分離提取心室稱重后在冰冷的勻漿液(160 mmol/L KCl，10 mmol/L EGTA，0.5%小牛血清BSA，pH 7.4)中剪碎，勻漿機(jī)勻漿，然后按1∶10的體積用勻漿液稀釋后用低溫離心機(jī)在2℃ 1 000×g下離心10 min，取上清液在2℃離心10 min，棄去上清，底部沉淀即為初步提取的線粒體。用重懸液(320 mmol/L sucrose，10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4)將初提的線粒體進(jìn)行重懸，然后再次在2 ℃離心10 min，得到較為純凈的線粒體。

1.2.4線粒體PT孔開放測(cè)定對(duì)分離的線粒體蛋白定量并用腫脹液(120 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L MOPS，5 mmol/L KH×2PO×4，pH 7.4)將線粒體蛋白濃度稀釋為0.25 mg/ml，然后加入Ca2+(200 μmol/L)至2 ml線粒體中，誘發(fā)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，同時(shí)用全波長酶標(biāo)儀每10 s監(jiān)測(cè)1次，連續(xù)監(jiān)測(cè)15 min線粒體在520 nm處的吸光度變化。

1.2.5線粒體呼吸功能檢測(cè)方法用氧電極法對(duì)線粒體呼吸功能進(jìn)行測(cè)量。將氧電極定標(biāo)，在反應(yīng)杯中加入1.5 ml反應(yīng)介質(zhì)(mmol/L，蔗糖 250，Tris 10，EGTA 10，磷酸二氫鉀 10，pH 7.4)和0.5 ml線粒體(0.5 mg/ml)懸液，待溶氧曲線斜率穩(wěn)定，此時(shí)所得曲線為Ⅰ態(tài)呼吸曲線；加入琥珀酸鈉(終濃度10 mmol/L)，待溶氧曲線斜率穩(wěn)定，此時(shí)所得曲線為Ⅱ態(tài)呼吸曲線；加入ADP(終濃度0.05 mmol/L)，待溶氧曲線穩(wěn)定，此時(shí)所得曲線為Ⅲ態(tài)呼吸曲線；待ADP消耗后，曲線斜率大幅下降，此時(shí)所得曲線為Ⅳ態(tài)呼吸曲線。使用Oxygraph軟件測(cè)量斜率，選取每個(gè)呼吸狀態(tài)曲線中間平直的部分測(cè)量斜率，以減小誤差。以RCR表示線粒體呼吸功能強(qiáng)弱并通過以下公式進(jìn)行計(jì)算：RCR=ST3斜率/ST4斜率。

1.2.6心肌線粒體膜點(diǎn)位測(cè)定用酶解法分離心肌細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，使用孵育液將細(xì)胞稀釋至1×105個(gè)/ml，添加20 nmol/L的羅丹明123，37℃避光孵育30 min，1 000 r/min離心后，用孵育液沖洗3次，使用熒光顯微鏡綠色鏡片進(jìn)行拍照分析。

2結(jié)果

2.1各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化電鏡檢測(cè)結(jié)果在透射電鏡下觀察各組大鼠心肌線粒體形態(tài)，可見3月齡組線粒體內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)完整，嵴完整無斷裂，線粒體排列整齊致密。15和18月齡組線粒體形態(tài)不規(guī)則，內(nèi)膜斷裂，脊不完整，部分線粒體可見明顯空泡，甚至出現(xiàn)破裂，見圖1。

圖1　不同月齡大鼠心肌組織電鏡圖(× 40 000)

2.2各組大鼠心功能改變與3月齡組大鼠相比，15和18月齡組LVSP(A)、±dp/dtmax(B、C)均明顯下降(P< 0.01)，LVEDP(D)均明顯增高(P< 0.01)。見表1。

2.3各組大鼠線粒體PT孔開放、線粒體呼吸速率、膜電位改變與3月齡大鼠相比，15、18月齡大鼠線粒體PT孔開放速率明顯增大(P< 0.01)，線粒體呼吸速率明顯降低(P<0.01)大鼠心肌細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯減小(P< 0.01)，表明膜電位明顯降低。見表2。

表1　各月齡大鼠心臟LVSP(A)、±dp/dtmax(B、C)、

與3月齡比較：1)P<0.01

表2　各月齡大鼠心肌線粒體PT孔開、

2.4抑制線粒體呼吸作用對(duì)線粒體PT孔開放的影響在3月齡大鼠，用線粒體呼吸鏈第一鏈呼吸抑制劑ROT(50 μmol/L)和第二鏈抑制劑Carboxine(200 μmol/L)分別抑制線粒體呼吸功能，未能引起線粒體PT的開放，3、15、18月齡組A520下降百分率分別為(0.12±0.004)%、(0.11±0.016)%、(0.10±0.018)%(P> 0.05)。

2.5線粒體PT孔開放對(duì)呼吸功能、線粒體膜電位的影響在分離的3月齡大鼠心肌細(xì)胞線粒體，用線粒體PT孔開放劑Atr(2 μmol/L)開放PT孔，明顯減小了線粒體呼吸速率對(duì)照組、Atr組氧耗分別為(15.8±0.5)、(4.85±0.1)mmol·min-1·mg-1(P< 0.01)，3、15、18月齡心肌熒光強(qiáng)度分別為0.39±0.03、0.24±0.01、0.20±0.02(P< 0.01)，表明線粒體膜電位明顯降低。

2.6抑制線粒體呼吸作用對(duì)線粒體膜電位的影響在3月齡大鼠，用線粒體呼吸鏈第一鏈呼吸抑制劑ROT(50 μmol/L)和第二鏈抑制劑Carboxine(200 μmol/L)分別抑制線粒體呼吸功能，未能引起線粒體膜電位改變，對(duì)照組、ROT組和Carboxine組膜電位熒光強(qiáng)度分別為0.39±0.02、0.34±0.03、0.37±0.02(P> 0.05)。

3討論

線粒體PT孔是位于線粒體內(nèi)膜的非特異性孔道，其開放可誘發(fā)線粒體腫脹、細(xì)胞色素c的釋放、細(xì)胞凋亡，在心肌缺血/再管注損傷中發(fā)揮重要的作用〔5〕。

研究〔3,4〕表明，隨年齡增長線粒體PT孔開放明顯增強(qiáng)。本研究中，第1次對(duì)比了3月齡和15、18月齡大鼠線粒體PT孔開放情況，結(jié)果同以往已發(fā)表的觀察結(jié)果趨勢(shì)一致。為了進(jìn)一步檢測(cè)15、18月齡大鼠心功能是否出現(xiàn)衰退，結(jié)果顯示，15、18月齡組大鼠心肌組織線粒體出現(xiàn)明顯形態(tài)學(xué)變化，表現(xiàn)為線粒體腫脹、線粒體內(nèi)膜損壞、脊斷裂。這些研究結(jié)果表明，15、18月齡大鼠心功能出現(xiàn)明顯衰退。

心肌線粒體的主要功能是為心肌的收縮和舒張活動(dòng)提供所需能量，這主要是由線粒體的呼吸功能完成的。因此，筆者推測(cè)，隨年齡增長，線粒體PT孔開放增強(qiáng)可能通過影響線粒體呼吸功能而造成心功能衰退。筆者對(duì)心功能出現(xiàn)衰退的15、18月齡大鼠線粒體呼吸功能進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果間接證明了上述推測(cè)的可能性，但并不能說明該兩組大鼠線粒體呼吸功能的減退的確是由線粒體PT孔開放增強(qiáng)所致。為此，筆者在分離的3月齡大鼠線粒體上進(jìn)一步進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，結(jié)果誘發(fā)線粒體呼吸功能明顯減退，相反，實(shí)驗(yàn)中如果用線粒體呼吸鏈抑制劑ROT和Carboxine抑制線粒體呼吸功能，結(jié)果并未誘發(fā)線粒體PT孔開放發(fā)生改變。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，線粒體PT孔隨年齡增長出現(xiàn)開放增強(qiáng)的趨勢(shì)，且PT孔開放可抑制線粒體呼吸功能。

線粒體膜電位與線粒體呼吸功能有密切聯(lián)系〔6〕，為了進(jìn)一步探討線粒體PT孔開放抑制線粒體呼吸功能的機(jī)制，筆者對(duì)線粒體膜電位進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明線粒體膜電位減小可能參與了PT孔開放誘發(fā)的線粒體呼吸抑制。為進(jìn)一步證實(shí)此推測(cè)，筆者在3月齡大鼠心肌線粒體上用線粒體PT孔開放劑Atr開放線粒體PT孔，結(jié)果表明，線粒體膜電位降低參與了PT孔開放增強(qiáng)引起的線粒體呼吸功能減退。

綜上，隨年齡增長，線粒體PT孔開放可能通過降低線粒體膜電位抑制線粒體呼吸功能，從而造成心功能減退。

4參考文獻(xiàn)

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4王秀靜，趙淑琴，張世忠，等.線粒體PT孔在心功能自然衰退過程中的作用〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2011；31(8):787-90.

5Forte M,Bernardi P.The permeability transition and BCL-2 family proteins in apoptosis:co-conspirators or independent agents〔J〕.Cell Death Differ,2006;13(11):1287-90.

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〔2013-05-13修回〕

(編輯曲莉)