低氧誘導因子-1α對老年骨關節(jié)炎軟骨細胞活性的影響

低氧誘導因子-1α對老年骨關節(jié)炎軟骨細胞活性的影響

葉暉林其仁吳文華林小斌林曉聰

(福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，福建泉州362000)

摘要〔〕目的探討低氧誘導因子(HIF)-1α與老年骨關節(jié)炎(OA)軟骨細胞增殖和凋亡的關系。方法選擇老年OA患者84例，另選健康人群80例作為對照。免疫組織化學方法檢測HIF-1α、bcl-2蛋白和增殖細胞核抗原(PCNA)在OA和正常軟骨細胞中的表達，分析其對OA軟骨細胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果OA組HIF-1α陽性表達率為83.9%，明顯高于正常對照組(χ2=30.312，P=0.000)。正常軟骨細胞中bcl-2蛋白表達量明顯高于OA軟骨細胞。TUNEL法檢測細胞凋亡結(jié)果顯示，OA軟骨組中細胞凋亡碎片明顯多于正常軟骨細胞，正常組軟骨細胞凋亡指數(shù)為7.16±9.01，而OA組軟骨細胞凋亡指數(shù)為39.7±7.23，兩者差異顯著(P<0.05)。PCNA計數(shù)，OA組中軟骨細胞增殖活性明顯低于正常組。結(jié)論HIF-1α表達與OA軟骨細胞活性密切相關，可能通過調(diào)控bcl-2蛋白及PCNA影響軟骨細胞的增殖與凋亡。

關鍵詞〔〕骨關節(jié)炎；低氧誘導因子-1α；軟骨細胞

中圖分類號〔〕R68〔

基金項目：福建省衛(wèi)生廳青年基金(2010-2-62)；泉州市科技計劃(2010Z36)

通訊作者：林其仁(1956-)，男，主任醫(yī)師，教授，主要從事關節(jié)外科、創(chuàng)傷骨科的臨床與基礎研究。

第一作者：葉暉(1975-)，男，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事關節(jié)外科、創(chuàng)傷骨科的臨床與基礎研究。

骨關節(jié)炎(OA)發(fā)病年齡逐步年輕化〔1〕。目前尚缺乏從根本上控制和治療OA的有效方法。OA發(fā)病機制至今尚不十分清楚，涉及全身及局部的許多因素，可能是一種綜合的機制。OA的重要病理特征是關節(jié)軟骨的降解〔2〕，軟骨細胞凋亡在其中起到關鍵作用〔3〕。本研究利用本院病例資源探討低氧誘導因子(HIF)-1α等對OA軟骨保護作用及其機制，并探討其與OA軟骨細胞增殖與凋亡的相關性，為臨床老年OA診治提供一定的理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料選取我院2011年2月至2013年2月就診的已經(jīng)病理確診的84例老年OA患者和80例同年齡、無關節(jié)病史及肉眼病變并行手術治療者為對照。實驗組男51例，女33例，年齡61～87歲，平均(63.7±1.1)歲；對照組男44例，女36例，年齡63～86歲，平均(65.2±1.4)歲；均經(jīng)過臨床確診，且無其他心血管或神經(jīng)系統(tǒng)等嚴重疾患。三組患者的性別、年齡等比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2標本采集方法OA軟骨標本取自膝關節(jié)表面置換術中切下的OA患者脛骨平臺軟骨。同時收集無關節(jié)疾病史及肉眼病變的因外傷截肢、交叉韌帶斷裂、盤狀軟骨損傷與半月板損傷等行手術治療的膝關節(jié)組織，所有病例均經(jīng)臨床和病理確診關節(jié)無病變,作為正常對照組。

1.3免疫組化方法所取新鮮標本均以10%中性甲醛液固定48 h，關節(jié)軟骨10%EDTA脫鈣6、7 w，常規(guī)脫水，石蠟包埋，以4～5 μm厚度連續(xù)切片。行常規(guī)HE染色外按試劑盒內(nèi)說明分別行HIF-1α、bcl-2及PCNA免疫組化與細胞凋亡染色,用已知的陽性切片作為陽性對照,以PBS代替一抗作為陰性對照。采用免疫組織化學PicTureTM通用型二步法,具體步驟按說明書進行。兔抗HIF-1α抗體(1∶200)購自武漢博士德公司。鼠抗人PCNA和bcl-2抗體工作液為北京中山試劑公司產(chǎn)品。PV6000通用型試劑盒購自美國Zymed公司。

1.4免疫組化結(jié)果判斷方法HIF-1α染色結(jié)果陽性判斷標準:HIF-1α蛋白以細胞核或胞漿內(nèi)有棕黃色細顆粒為陽性。在高倍鏡下(×400)對每張切片隨機選擇5個視野,計數(shù)200個細胞/視野,共計1 000個,陽性細胞數(shù)≤10%為陰性(-),>10%為陽性(+)。bcl-2蛋白染色陽性結(jié)果判斷:bcl-2蛋白主要位于細胞質(zhì)內(nèi),呈棕黃色細顆粒狀。以陽性細胞占切片中軟骨細胞總數(shù)的5%以上為陽性(+),≤5%為陰性(-)。PCNA染色結(jié)果及分級:PCNA陽性信號分布于細胞核,棕黃色顆粒狀陽性細胞≤25%為Ⅰ級,26%～50%為Ⅱ級,51%～75%為Ⅲ級,≥76%為Ⅳ級。將Ⅰ、Ⅱ級定為低增殖活性,Ⅲ、Ⅳ級定為高增殖活性,以此作為OA軟骨細胞增殖程度的指標。

1.5細胞凋亡結(jié)果判斷用TUNEL法標記過氧化物酶顯色檢測細胞凋亡,陽性細胞(凋亡細胞)呈棕褐色,核濃縮、邊集,大小不等,有時呈半月形,有時核碎裂成碎片,最終胞質(zhì)也發(fā)生碎裂。每張切片連續(xù)選取5個高倍(×200)視野,計算平均凋亡細胞所占細胞總數(shù)的百分比即為凋亡指數(shù)(AI)。

2結(jié)果

2.1滑膜HE染色光鏡觀察情況正常滑膜下層由含有較多脂肪組織及纖維網(wǎng)狀組織構(gòu)成的疏松結(jié)構(gòu)，其內(nèi)層由2～3層滑膜細胞組成，排列疏松，內(nèi)層滑膜細胞包裹于基質(zhì)中?；|(zhì)層可見纖維排列整齊,由內(nèi)向外逐漸增多,僅見少量滑膜成纖維細胞及淋巴細胞;滑膜下層結(jié)構(gòu)疏松,含有較多的脂肪組織及纖維網(wǎng)狀組織。見圖1。OA滑膜可見明顯炎性細胞浸潤,滑膜退變明顯，可見多量微血管形成,滑膜結(jié)構(gòu)明顯改變、紊亂，其間可見多數(shù)脂肪細胞浸潤，圖1。

OA滑膜

2.2兩組人群軟骨細胞中HIF-1α表達情況兩組人群軟骨細胞經(jīng)免疫組化染色后，HIF-1α表達陽性顆粒主要見于細胞核及胞質(zhì)中,OA組HIF-1α陽性表達率為83.9%，而正常對照組中未見明顯HIF-1α陽性表達，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=30.312，P=0.000)。見圖2。

正常軟骨細胞

OA軟骨細胞

2.3兩組軟骨細胞凋亡情況免疫組化結(jié)果顯示，正常軟骨細胞和OA軟骨細胞中均有bcl-2蛋白表達，但正常軟骨細胞中bcl-2蛋白表達量明顯高于OA軟骨細胞(P<0.05)。TUNEL法檢測細胞凋亡結(jié)果顯示，正常組軟骨細胞凋亡指數(shù)為7.16±9.01，而OA組軟骨細胞凋亡指數(shù)為39.7±7.23，兩者差異顯著(P<0.05)。見圖3。

正常軟骨細胞bcl-2

OA軟骨細胞bcl-2

OA組細胞凋亡

正常組細胞凋亡

2.4兩組軟骨細胞增殖情況通過免疫組化PCNA計數(shù)，OA組中軟骨細胞增殖低增殖活性62例，高增殖活性22例。而正常健康組中高增殖活性有59例，低增殖活性21例，兩者相比差異顯著(P<0.05)，OA組Ⅰ級36例，Ⅱ級26例，Ⅲ級18例，Ⅳ級4例；健康組Ⅰ級12例，Ⅱ級9例，Ⅲ級43例，Ⅳ級16例。見圖4。

正常組

OA組

3討論

OA最主要的病理特征是關節(jié)軟骨的退行性變化。OA涉及整個滑膜關節(jié)，包括軟骨、滑膜及軟骨下骨，這些組織的細胞都有相對獨立的啟動能力并引起OA的發(fā)生，其最后通路都是關節(jié)軟骨的破壞、關節(jié)的重塑及軟骨下的骨質(zhì)硬化〔4〕。目前對于其具體發(fā)病機制仍未完全明了。臨床上OA的治療主要是緩解關節(jié)疼痛、改善功能以及人工關節(jié)置換術，而缺乏一種從軟骨破壞和骨贅形成這些OA發(fā)生的關鍵原因著手的根本性治療方式〔5〕。隨著研究進展，國內(nèi)外許多學者對OA關節(jié)軟骨組織學研究發(fā)現(xiàn)有軟骨細胞減少，而軟骨細胞凋亡在其中起到關鍵作用〔6〕。

膝關節(jié)是人體最大的滑膜關節(jié)，也是骨關節(jié)炎發(fā)病率最高的關節(jié)。大量研究顯示關節(jié)腔內(nèi)為低氧環(huán)境,表層關節(jié)軟骨周圍氧濃度約為空氣中氧的6%～10%,深層的軟骨細胞接受僅約1%～6%的氧濃度,甚至更少〔7〕。本研究從膝關節(jié)取材。正常關節(jié)軟骨滑膜組織HE染色區(qū)呈白色或淡黃色，表面光滑而具有光澤，軟骨細胞較致密而均勻。而在OA軟骨細胞數(shù)目減少稀疏，表面粗糙不光滑，無光澤有些甚至出現(xiàn)裂隙，且存在較多空泡細胞。利用免疫組化染色方法探究HIF-1α、bcl-2蛋白和PCNA在正常膝關節(jié)軟骨細胞和OA患者膝關節(jié)軟骨細胞中的表達差異，并通過軟骨細胞增殖和凋亡活性的不同反應HIF-1α對軟骨細胞活性的調(diào)控功能。HIF-1α是受氧濃度調(diào)節(jié)的重要因子,當氧濃度低于6%時,HIF-1α表達會成倍增加并迅速達到最大值,然后其轉(zhuǎn)入核內(nèi)與HIF-1β形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，當發(fā)生OA時，膝關節(jié)內(nèi)部缺氧狀態(tài)更明顯，促使HIF-1α表達持續(xù)增加，因此其在OA發(fā)生發(fā)展中的重要地位無可否認。

bcl-2蛋白是目前已知的最重要的抗凋亡因子〔8〕。bcl-2蛋白分布在線粒體外膜的漿膜面、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面,對于穩(wěn)定線粒體膜有著重要的作用,同時還可作用于線粒體通透轉(zhuǎn)運孔的有關蛋白以維持線粒體的跨膜電位。此外，bcl-2可能是阻止DNA損傷激活的凋亡信號到達它的靶位,從而打斷了凋亡感應子和效應子階段的聯(lián)系〔9〕。本文表明HIF-1α可能通過bcl-2蛋白調(diào)控軟骨細胞的凋亡，從而影響OA的發(fā)生發(fā)展。

PCNA與細胞DNA合成關系密切，在細胞增殖的啟動上起重要作用，是反映細胞增殖狀態(tài)的良好指標。PCNA是一種分子量為36 kD的蛋白質(zhì)，在細胞核內(nèi)合成，并存在于細胞核內(nèi)，為DNA聚合酶表達活性時的輔助蛋白。免疫組化檢測軟骨細胞PCNA的表達可以反映軟骨細胞的增殖狀況。

綜上，HIF-1α對OA軟骨細胞增殖和凋亡起很大作用，其可能通過調(diào)控bcl-2蛋白和PCNA的表達量影響軟骨細胞活性。

4參考文獻

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9張振,王君,呂苗苗,等.大鼠低氧誘導因子-1.基因克隆和表達載體的構(gòu)建〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2010;(14):1101-3.

〔2013-12-13修回〕

(編輯李相軍)