HSP27在調(diào)控人胃癌細(xì)胞系5-FU耐藥中的作用機(jī)制

HSP27在調(diào)控人胃癌細(xì)胞系5-FU耐藥中的作用機(jī)制

宋榮峰張慧卿熊彥王艷華萬(wàn)以葉

作者單位:330029 江西省腫瘤醫(yī)院

【摘要】目的探討熱休克蛋白27(HSP27)在調(diào)控人胃癌細(xì)胞系5-FU耐藥中的作用機(jī)制。方法培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞株HGC27、BGC823、SGC7901、MKN28，采用CCK法篩選5-FU敏感株和耐藥株，采用流式細(xì)胞儀和western blot 檢測(cè)4株胃癌細(xì)胞株中HSP27表達(dá)水平，轉(zhuǎn)染HSP27-siRNA，觀察siRNA干擾后5-FU敏感株和耐藥株中HSP27蛋白表達(dá)，并將兩細(xì)胞株分別與不同濃度5-Fu共培養(yǎng)，采用CCK法檢測(cè)細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。結(jié)果CCK法顯示SGC7901細(xì)胞系是4株胃癌細(xì)胞中5-Fu相對(duì)耐藥株，而HCG27是5-Fu相對(duì)敏感株。流式細(xì)胞儀顯示SGC7901細(xì)胞株中HSP27表達(dá)水平最高為 (72.10±1.89)%，而在HGC27細(xì)胞株中的表達(dá)水平最低為(22.12±1.33)%，各株表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染HSP27-siRNA 后，各兩株細(xì)胞HSP27蛋白表達(dá)水平均下降明顯。與5-Fu共培養(yǎng)后，SGC7901細(xì)胞株轉(zhuǎn)染組細(xì)胞半數(shù)抑制濃度降低，藥物敏感性增強(qiáng)，與未轉(zhuǎn)染組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論HSP27參與了SGC7901 5-FU耐藥株中的細(xì)胞耐藥，是誘導(dǎo)細(xì)胞多藥耐藥的重要分子機(jī)制，可以作為臨床治療靶點(diǎn)來(lái)提高胃癌患者對(duì)化療的敏感性。

【關(guān)鍵詞】胃癌；5-FU；HSP27

基金項(xiàng)目：江西省衛(wèi)生廳一般科技項(xiàng)目(編號(hào)：20091213)

通訊作者：宋榮峰

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.10.003

中圖分類號(hào)：R735.2

收稿日期(2015-04-21修回日期 2015-08-03)

The Mechanism of HSP27 Regulation of 5-FU Resistant in Human Gastric

Cancer Cell Lines

SONGRongfeng,ZHANGHuiqing,XIONGYan，etal.JiangxiCancerHospital,Nanchang,330029

Abstract【】ObjectiveTo investigate the mechanism of HSP27 of 5-FU resistant in human gastric cancer cell lines.MethodsHuman gastric cancer cell lines(HGC27,BGC823,SGC7901,MKN28)were cultured,and the cells which were resistant to 5-FU were selected by CCK assay and flow cytometry.The expression of HSP27 in these cells were detected by Western Blotting.And 2 cell lines were co-cultured with different concentration of 5-Fu,then the half inhibition concentration was detected by CCK assay.ResultsCCK assay showed that SGC7901 cell line was relatively resistant to 5-Fu,and the HCG27 cell line was relatively sensitive to 5-Fu.The flow cytometry results suggested that the expression of HSP27 in the SGC7901 cells was the highest(72.10±1.89)%.Nevertheless,it was the lowest in the HGC27 cells(22.12±1.33)%.After transfection by HSP27-siRNA,the expression levels of HSP27 in two cell lines was significant decreased (P<0.05);however,co-cultured with 5-Fu,the half inhibition concentration of SGC7901 cell lines was decreased,meanwhile the sensitivity to 5-Fu was enhanced.ConclusionHSP27 is involved in the 5-Fu resistance of SGC7901 cells,it induced an important molecular mechanism of multi-drug resistance and could be applied as a therapeutic target in order to increase the sensitivity of chemotherapy.

【Key words】Gastric cancer;5-FU;HSP27

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:1430～1433)

在中國(guó)胃癌的發(fā)病率和死亡率居高不下，發(fā)病率位居第二，死亡率則為第三，是我國(guó)惡性腫瘤中危害最為嚴(yán)重的疾病之一。盡管隨著胃癌的診療水平不斷提高，但是大部分胃癌確診已屬晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)，化療成為治療的主要手段[1]。氟尿嘧啶(5-FU)作為目前胃癌化療的基礎(chǔ)用藥，其耐藥性也越來(lái)越受到關(guān)注。有研究表明，HSP27在多種腫瘤特別是腺癌起源者中異常高表達(dá)，其高表達(dá)與腫瘤耐藥關(guān)系密切。研究證實(shí)，HSP27是結(jié)腸癌5-FU耐藥的新的調(diào)節(jié)子，但在胃癌細(xì)胞中未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道[2]。本研究將探索HSP27在人胃癌細(xì)胞系5-FU耐藥中的調(diào)節(jié)作用，從而為逆轉(zhuǎn)胃癌5-FU耐藥的新途徑提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要試劑

人胃癌細(xì)胞系HGC27、BGC823、SGC7901、MKN28由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院健康科學(xué)研究所惠贈(zèng)，RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液(Gibco公司)，0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)(Gibco公司)，胎牛血清(Sigma公司)，Cell Counting Kit-8(日本，Dojindo) 兔抗人HSP27多克隆抗體購(gòu)自Abcam 公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

HGC27、BGC823、SGC7901、MKN28 4株胃癌細(xì)胞分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMIl640培養(yǎng)基中，并置于5%CO2、37 ℃條件下的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞增殖的CCK檢測(cè)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4株胃癌細(xì)胞經(jīng)0.5%胰酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)，制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞濃度為1×104/ml接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 ul進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞活性恢復(fù)，加入5-Fu，藥物濃度為0 mg/L、1 mg/L、5 mg/L、 10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L，每個(gè)濃度設(shè)計(jì)3復(fù)孔，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，于每孔加入10 μl的CCK-8，再置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，測(cè)定450 nm波長(zhǎng)吸光度值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)HSP27的表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HGC27、BGC823、SGC7901、MKN28 4株胃癌細(xì)胞，PBS洗凈后分別加入FITC標(biāo)記的P-gp抗體40 μl，混勻，避光，4 ℃孵育30 min。PBS終止反應(yīng)，離心1 000 r/min，4 ℃ 離心5 min，棄上清，PBS洗2次。流式細(xì)胞儀檢測(cè)FITC熒光強(qiáng)度，Cell-quest軟件進(jìn)行5-Fu耐藥株、5-Fu敏感株的HSP27表達(dá)分析。

1.5siRNA干擾和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

HSP siRNA由上海生工合成，HSP siRNA序列(5'-UAGCCAUGCUCGUCCUGCCUU-3′)。應(yīng)用Lipofectamine TM2000轉(zhuǎn)染劑并按照說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將2×104cells/ml的耐藥株胃癌細(xì)胞SGC-7901和敏感細(xì)胞株HCG27分別接種于6孔板，每株胃癌細(xì)胞分為3組：空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染Lipofectamine組、轉(zhuǎn)染HSP-siRNA組，在37 ℃、50 ml條件下孵育，孵育4 h，24 h收集細(xì)胞。

1.6Western bolt檢測(cè)轉(zhuǎn)染后siRNA干擾后胃癌細(xì)胞中HSP蛋白的表達(dá)

分別收集3組經(jīng)處理的耐藥株及敏感株胃癌細(xì)胞(1×107)：空白對(duì)照組(Non-control)、轉(zhuǎn)染Lipofectamine組(Li-control)及轉(zhuǎn)染HSP-siRNA組(siRNA group),加入適量含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液RIPA。離心12 000 rpm 4 ℃ 10 min，取上清，BCA 法蛋白定量。計(jì)算含50 ng蛋白的溶液體積即為上樣量,經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜(Millipore公司產(chǎn)品)后封閉,加入一抗(HSP抗體,P-pg抗體,Santa C ruz公司產(chǎn)品)4 ℃孵育過(guò)夜,加入二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG,Zymed 公司產(chǎn)品)室溫下孵育1～2 h；ECL顯影，暗室中X 光膠片曝光1 min或5 min，放入沖片機(jī)沖洗。膠片掃描，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。以曝光條帶的強(qiáng)弱分析HSP27蛋白表達(dá)的高低。同時(shí)設(shè)立β-actin(Santa C ruz公司產(chǎn)品)為內(nèi)對(duì)照。

2結(jié)果

2.1CCK檢測(cè)5-Fu對(duì)不同胃癌細(xì)胞株生長(zhǎng)的抑制作用

不同濃度的5-Fu(0 mg/L、1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L)分別用于作用HGC27、BGC823、SGC7901、MKN28 4株胃癌細(xì)胞72 h，通過(guò)繪制生長(zhǎng)曲線圖(圖1)，發(fā)現(xiàn)5-Fu對(duì)4株胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)都具有抑制作用，其中對(duì)HGC27的抑制效果最顯著，IC50為5.85 mg/L；對(duì)SGC7901抑制率最低，為17.00 mg/L。

圖1　CCK檢測(cè)5-Fu對(duì)不同胃癌細(xì)胞株生長(zhǎng)的抑制情況

2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)4株胃癌細(xì)胞株中HSP27蛋白表達(dá)情況

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，4株胃癌細(xì)胞株中HSP27表達(dá)水平各不相同，在SGC7901中表達(dá)水平最為顯著為 (72.10±1.89)%，BGC823為(63.92±2.94)%，MKN28中的表達(dá)水平為(45.40±2.62)%，在HGC27中的表達(dá)水平為(22.12±1.33)%，顯著低于5-Fu耐藥株SGC7901中HSP27的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)(圖2)。

圖2　流式細(xì)胞儀檢測(cè)4株胃癌細(xì)胞株中HSP27蛋白表達(dá)情況

2.3Western bolt檢測(cè)siRNA干擾后5-Fu胃癌耐藥株與敏感株中HSP27的表達(dá)

根據(jù)CCK檢測(cè)結(jié)果，SGC7901細(xì)胞株是4株胃癌細(xì)胞中5-Fu相對(duì)耐藥株，而HCG27是5-Fu相對(duì)敏感株，選擇SGC7901及HCG27胃癌細(xì)胞系作為HSP27 siRNA干擾細(xì)胞株，Westerb blot 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，siRNA干擾后細(xì)胞株SGC7901和HCG27中HSP27蛋白表達(dá)水平均明顯下降，灰度掃描顯示相對(duì)比值分別為(1.375±0.301)和(1.259±0.289)，見(jiàn)圖3、圖4。

N：空白對(duì)照組，C：Lipofectamine轉(zhuǎn)染組，SiRNA:siRNA干擾組

N：空白對(duì)照組，C：Lipofectamine轉(zhuǎn)染組，SiRNA:siRNA干擾組

2.4干擾前后SGC7901及HCG27細(xì)胞對(duì)5-FU敏感性的變化

轉(zhuǎn)染24 h后，與5-Fu共培養(yǎng)后，未轉(zhuǎn)染組SGC7901 和 HGC27的IC50分別為17.24 mg/L和5.78 mg/L，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞IC50分別為8.54 mg/L和5.12 mg/L，耐藥株SGC7901細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度明顯降低，藥物敏感性增強(qiáng)，與未轉(zhuǎn)染組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

圖5　3組SGC7901細(xì)胞株的對(duì)5-FU敏感性的變化

3討論

熱休克蛋白27是小分子熱休克蛋白家族的醫(yī)院，其具有保護(hù)機(jī)體生理細(xì)胞免受熱、毒物、缺氧、自由基等損傷的作用，可促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確組裝和糾正錯(cuò)誤的蛋白結(jié)構(gòu)，具有分子伴侶的作用[3-5]。最新研究還發(fā)現(xiàn)，HSP27參與了腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，包括促進(jìn)細(xì)胞的增生、分化和抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡等，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用[6]，HSP27在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，且與乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌和胃癌等患者的預(yù)后密切相關(guān)[7-10]。目前，國(guó)內(nèi)臨床上治療惡性腫瘤的主要措施為化療和根治性手術(shù)治療等，術(shù)前常規(guī)化療可有效縮小腫瘤體積，提高手術(shù)的成功率，但部分患者對(duì)化療藥物順鉑、5-FU等具有耐藥性，國(guó)外有學(xué)者通過(guò)將HSP27 cDNA轉(zhuǎn)染小鼠，獲得高表達(dá)HSP細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)其對(duì)順鉑等具有高抵抗能力[11]。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究也發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)HSP的腫瘤細(xì)胞株對(duì)阿霉素具有較高的抵抗作用。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)了HSP27高表達(dá)與腫瘤的化療耐藥等密切相關(guān)[12-15]。因此，本研究將探索HSP27在人胃癌細(xì)胞系5-FU耐藥中的調(diào)節(jié)作用，從而為逆轉(zhuǎn)胃癌5-FU耐藥的新途徑提供理論依據(jù)。

本研究通過(guò)篩選5-FU胃癌細(xì)胞株耐藥株和敏感株，采用siRNA干擾技術(shù)，沉默細(xì)胞內(nèi)HSP27的表達(dá)，并與5-FU共培養(yǎng)后關(guān)系細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，siRNA干擾后細(xì)胞內(nèi)HSP蛋白表達(dá)下降，表明RNA干擾技術(shù)成功沉默了HSP27的表達(dá)，而與5-FU共培養(yǎng)后，胃癌細(xì)胞耐藥株SGC7901對(duì)5-FU的敏感性增強(qiáng)，半數(shù)抑制濃度降低，表明HSP27可以在一定程度上逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞對(duì)5-FU的耐藥，增強(qiáng)了維系細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性。上述結(jié)果表明，胃癌細(xì)胞內(nèi)HSP27的表達(dá)水平與細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性密切相關(guān)，HSP27將可作為臨床治療的新靶點(diǎn)。

目前關(guān)于HSP27誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞化療耐藥的機(jī)制研究不多，尚無(wú)明確結(jié)論，化療藥物5-FU主要是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤生長(zhǎng)的作用[16]。大量研究表明，HSP27可以特異性干擾線粒體途徑的胱天蛋白水解酶誘導(dǎo)的凋亡，并可與凋亡蛋白Caspase3結(jié)合，而Caspase3 可通過(guò)裂解底物PARP使細(xì)胞損失對(duì)DNA損傷的修復(fù)功能，促進(jìn)凋亡的發(fā)生，當(dāng)HSP27與后者結(jié)合后，抑制了凋亡，從而促進(jìn)了細(xì)胞的生長(zhǎng)[17-20]，通過(guò)從機(jī)制上進(jìn)一步研究HSP27參與腫瘤化療耐藥的可能機(jī)制，才能更好地干擾HSP27的表達(dá)，為臨床提供理論依據(jù)。

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(編輯：甘艷)