結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥與rpoB基因突變特征的關(guān)系探討

鄒 悅肖 謙蘇海濤

結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥與rpoB基因突變特征的關(guān)系探討

鄒 悅1肖 謙2蘇海濤3

目的分析青島地區(qū)結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥與rpoB基因突變特征的關(guān)系。方法青島地區(qū)14株利福平敏感的結(jié)核分枝桿菌以及54株利福平耐藥的結(jié)核分枝桿菌的rpoB基因段應(yīng)用PCR-DNA測(cè)序法給予分析。結(jié)果54株利福平耐藥菌株中，其中44株出現(xiàn)了rpoB基因81bp核心區(qū)突變，而其中14株利福平敏感菌株中未出現(xiàn)rpoB基因81bp核心區(qū)突變，比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；其中38株利福平低濃度耐藥菌株中出現(xiàn)了30株rpoB基因81bp核心區(qū)突變，其中16株利福平高濃度耐藥菌株中出現(xiàn)了14株rpoB基因81bp核心區(qū)突變，比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；其中18株非耐多藥菌株中出現(xiàn)了14株rpoB基因81bp核心區(qū)突變，其中36耐多藥菌株中出現(xiàn)了30株rpoB基因81bp核心區(qū)突變，比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。結(jié)論rpoB基因81bp核心區(qū)突變是青島地區(qū)結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平耐藥的主要機(jī)制。

分枝桿菌；結(jié)核；利福平；突變；青島

結(jié)核病是全球以及目前我國嚴(yán)重的一種公共衛(wèi)生問題［1］。我國是被WHO列為“耐藥結(jié)核病需引起警示”的國家之一，研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)我國利福平（RFP）耐藥率為7.5%，并且耐多藥率（MDB-TB）為6.8%［2］。本研究旨在分析青島地區(qū)利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌的rpoB基因突變特征。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 來源于2009年1月～2012年12月青島市胸科醫(yī)院確診68株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的肺結(jié)核患者痰標(biāo)本，其中包括54株耐藥菌株，14株利福平敏感菌株。利福平耐藥菌株中包括16株高濃度耐藥菌株，38株低濃度耐藥菌株；36株耐多藥菌株，18株非耐多藥菌株。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 采用加拿大BBI公司生產(chǎn)的PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀，采用美國ABI公司生產(chǎn)的370測(cè)序列分析儀，采用湘儀離心機(jī)儀器有限公司生產(chǎn)的YXJ-2離心機(jī)，采用上海精益有機(jī)玻璃制品儀器廠生產(chǎn)的H6-1微型電泳槽，采用Gene Genius公司生產(chǎn)的凝膠成像系統(tǒng)。

1.1.3 主要試劑 6×DNA Loading Dye、dNTP、TaqDNA聚合酶、MgCl2、10×PCR Buffer（生工）；10×TAE；生工SK1141PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌DNA的抽提 取100 μL菌懸液加自制的裂解液[（50 mmol/L NaOH、10 mmol/L Tris.HCl（pH 8.0）、1% Triton X-100、1% NP-40、0.5 mmol/L EDTA（pH8.0））200 μL，混勻，100 ℃煮沸10 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液作模板。置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增 根據(jù)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv的 rpoB基 因（Gene ID： 888164） 序 列 設(shè) 計(jì) 引物：上 游5′- AGGACGTGGAGGCGATCA-3′， 下 游5′-AACGGGTTGACCCGCGCGTA -3′，擴(kuò)增rpoB基因基因片段長度為307 bp片段， 該片段包括了易發(fā)生突變的81bp核心區(qū)。

1.2.3 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 采用50 μL體系，包括模板1 μL、上下游引物各1μL、dNTP 10 mmol/L 1 μL、Taq Buffer 5 μL、25 mmol/L MgCl25 μL、5 U/μL Taq酶0.5 μL、水36.3 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55～60 ℃退火35 s，72 ℃延伸40～50 s，72 ℃修復(fù)延伸5～8 min，35個(gè)循環(huán)。

1.2.4 測(cè)序 用PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒（生工SK1141）回收DNA擴(kuò)增片段，送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序，在GeneBank中查到rpoB基因（Gene ID：888164）的序列進(jìn)行比對(duì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用PEMS 3.1軟件分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

見圖1。本研究所有結(jié)核分枝桿菌臨床分離株基因擴(kuò)增后長度為307bp的片段，并且顯示擴(kuò)增陽性率為100%。

圖1 1%瓊脂糖電泳，150 V、100 mA 20 min電泳觀察

2.1 DNA測(cè)序結(jié)果

14株利福平敏感菌株中均未發(fā)生rpoB基因81bp核心區(qū)突變，而54株利福平耐藥菌株中有44株發(fā)生了rpoB基因81bp核心區(qū)突變，基因突變率為81.48%（44/54）；44株中30株（占68.18%）為531位點(diǎn)TCG→TTG突變，10株（占22.72%）為526位點(diǎn)CAC→TAC突變，2株（占4.55%）為81bp核心區(qū)511位CTG→CCG突變，2株（占4.55%）為511位點(diǎn)CTG→CCG和526位點(diǎn)CAC→AAC雙位點(diǎn)突變。38株利福平低濃度耐藥菌株中有30株發(fā)生了rpoB基因81bp核心區(qū)突變，突變率為78.95%（30/38），其中22株為81bp核心區(qū)531位點(diǎn)TCG→TTG變異，4株為526位點(diǎn)CAC→TAC突變，2株（占4.55%）為511位點(diǎn)CTG→CCG突變，2株（占4.55%）為511位點(diǎn)CTG→CCG和526位點(diǎn)CAC→AAC雙點(diǎn)突變；16株利福平高濃度耐藥菌株中有14株發(fā)生了rpoB基因81bp核心區(qū)突變，突變率為87.50%（14/16），其中8株為531位點(diǎn)TCG→TTG突變，6株為526位點(diǎn)CAC→TAC突變。18株非耐多藥菌株中有14株發(fā)生了rpoB基因81bp核心區(qū)突變，突變率為77.78%（14/18），其中10株（占68.18%）為531位TCG→TTG突變，2株（占22.72%）為526位點(diǎn)CAC→TAC突變，2株（占4.55%）為511位點(diǎn)CTG→CCG突變；而36株耐多藥菌株中有30株發(fā)生了rpoB基因81bp核心區(qū)突變，突變率為83.33%（22/24），其中20株（占68.18%）為531位點(diǎn)TCG→TTG突變，8株（占22.72%）為526位點(diǎn)CAC→TAC突變，2株（占4.55%）為511位點(diǎn)CTG→CCG和526位點(diǎn)CAC→AAC雙點(diǎn)突變。見圖2～圖5。

圖2 511位點(diǎn)CTG→CCG突變（對(duì)側(cè)鏈）

圖3 526位點(diǎn)CAC→TAC突變（對(duì)側(cè)鏈）

圖4 531位點(diǎn)TCG→TTG突變（對(duì)側(cè)鏈）

2.2 rpoB基因81bp核心區(qū)突變特征與利福平耐藥表型的關(guān)系

見表1。54株利福平耐藥菌株中，其中44株出現(xiàn)了rpoB基因81bp核心區(qū)突變，而其中14株利福平敏感菌株中未出現(xiàn)rpoB基因81bp核心區(qū)突變，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 利福平耐藥表型與rpoB變異關(guān)系

2.3 利福平耐藥濃度與rpoB基因81bp核心區(qū)突變的關(guān)系

見表2。其中38株利福平低濃度耐藥菌株中出現(xiàn)了30株rpoB基因81bp核心區(qū)突變，其中16株利福平高濃度耐藥菌株中出現(xiàn)了14株rpoB基因81bp核心區(qū)突變，比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 利福平耐藥濃度與rpoB81bp核心區(qū)突變關(guān)系

2.4 利福平耐藥菌株是否耐多藥與rpoB基因81bp核心區(qū)突變關(guān)系

見表3。其中18株非耐多藥菌株中出現(xiàn)了14株rpoB基因81bp核心區(qū)突變，其中36耐多藥菌株中出現(xiàn)了30株rpoB基因81bp核心區(qū)突變，比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 利福平耐藥菌株是否耐多藥與rpoB基因81bp核心區(qū)突變關(guān)系

3 討論

利福平是一種快速殺菌劑，該藥物作用機(jī)制主要是經(jīng)與結(jié)核分枝桿菌RNA聚合酶的β亞單位結(jié)合，其中編碼β亞單位的基因被命名為rpoB基因［3］。本研究表明，81.48%（44/54）的利福平耐藥菌株存在rpoB基因81bp核心區(qū)突變，而14株對(duì)利福平敏感的結(jié)核分枝桿菌臨床分離菌株中未發(fā)現(xiàn)rpoB基因81bp核心區(qū)突變，這說明rpoB基因81bp核心區(qū)突變是青島地區(qū)結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平耐藥的主要機(jī)制，提示該突變作為青島地區(qū)利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌診斷的分子標(biāo)記靶點(diǎn)具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值，這將在早期診斷、早期選擇敏感藥物治療耐藥結(jié)核病提供較大幫助。

rpoB基因81bp核心區(qū)突變率對(duì)利福平高濃度耐藥菌株與利福平低濃度耐藥菌株以及是否耐多藥，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，一定程度上表明rpoB基因81bp核心區(qū)突變與耐藥濃度及耐藥程度不相關(guān)。還有18.52%利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌未發(fā)現(xiàn)rpoB的變異，說明青島地區(qū)還存在利福平耐藥的其他機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。此次研究樣本量較小，難以全面反映整個(gè)青島地區(qū)的利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌rpoB的變異特征，這些需要以后加大樣本量，進(jìn)行深入的研究，以期獲得更加全面的科學(xué)依據(jù)。

［1］肖東樓，趙明剛，王宇等．中國結(jié)核病防治規(guī)劃實(shí)施工作指南［M］．北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2009：1．

［2］全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組，全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室．2010年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告［J］．中國防癆雜志，2012，34（8）：485-508．

［3］朱敏，范玉美，盛國平，等．浙江省耐藥結(jié)核分枝桿菌katG、rpoB、embB基因突變特點(diǎn)［J］．研究醫(yī)學(xué)研究雜志，2008，37（3）：26-29．

The Relationship between the Mycobacterium Tuberculosis Rod Rifampicin Resistant and the Characteristics of the RpoB Gene Mutation

ZOU Yue1XIAO Qian2SU Haitao31 Thoracic 2，Chest Hospital in Qingdao City，Qingdao 266043，China，Medical insurance department of Qingdao Ninth People's Hospital，Qingdao 266000，China，3 Thoracic and three branch，Chest Hospital in Qingdao City，Qingdao 266043，China

ObjectiveTo investigate the relationship between mycobacterium tuberculosis rod rifampicin resistant and the characteristics of the rpoB gene mutation．Methods14 cases of the mycobacterium tuberculosis which sensitive to the rifampicin and 54 cases of rpoB gene of mycobacterium tuberculosis with rod rifampicin resistant， which were analysed with PCR-DNA sequencing．ResultsIn 54 strains of rifampicin ， 44 strains of them have rpoB 81bp core mutations， while 14 strains which sensitive to the rifampicin have no rpoB 81 bp core mutations， with significant difference（P＜0．05）; 30 strains have rpoB 81bp core mutations in all 38 strains with rifampicin low concentration drug resistance; 14 strains have rpoB 81bp core mutations in all 16 strains of rifampicin high concentration drug resistance， with statistical difference（P＜ 0．05）; 14 strains have rpoB 81bp core mutations in all 18 strains of non-resistant; 30 strains have rpoB 81bp core mutations in all 36 strains of multidrug resistance， with statistical difference（P＜0．05）．ConclusionRpoB 81bp core mutation is the primary mechanisms of mycobacterium tuberculosis in Qingdao to the rifampin-resistance．

Mycobacterium，Tuberculosis，Rifampicin，Mutation，Qingdao

R3

B

1674-9316（2015）29-0199-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2015．29．146

1 266043青島市胸科醫(yī)院胸二科

2 266000青島市第九人民醫(yī)院醫(yī)保科

3 266043青島市胸科醫(yī)院胸三科