芹菜素激活c-Src/NADPH氧化酶/ROS通路誘導(dǎo)HO-1表達(dá)從而抑制小鼠巨噬細(xì)胞過(guò)度分泌細(xì)胞因子

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(1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科；2.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科；3.南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所；湖南 衡陽(yáng) 421001)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

芹菜素激活c-Src/NADPH氧化酶/ROS通路誘導(dǎo)HO-1表達(dá)從而抑制小鼠巨噬細(xì)胞過(guò)度分泌細(xì)胞因子

曾賽麗1，吳廣2，謝莉1，張秀峰1，譚小武1，何振華1，游曉星3，趙蘭華3，曾焱華3*

(1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科；2.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科；3.南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所；湖南 衡陽(yáng) 421001)

目的觀察芹菜素對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響，并探討其分子機(jī)制。方法體外培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7，用不同濃度的芹菜素處理后，加入LPS刺激0～16 h。Western blot檢測(cè)血紅素氧合酶-1(HO-1)的表達(dá)以及c-Src和NADPH氧化酶p47phox亞基的磷酸化；熒光探針H2DCFDA檢測(cè)活性氧(ROS)的產(chǎn)生；ELISA檢測(cè)TNF-α和IL-6的產(chǎn)生。結(jié)果芹菜素作用RAW 264.7細(xì)胞30 min即可誘導(dǎo)c-Src和NADPH氧化酶亞基p47phox磷酸化。采用50 μmol/L c-Src抑制劑PP1預(yù)處理細(xì)胞后，p47phox磷酸化水平明顯降低。同時(shí)，芹菜素能上調(diào)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)ROS的含量，而NADPH氧化酶抑制劑DPI可抑制其產(chǎn)生。芹菜素也能誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞表達(dá)HO-1，而采用PP1、DPI或ROS抑制劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)預(yù)處理細(xì)胞后，HO-1表達(dá)水平明顯降低。此外，芹菜素處理能下調(diào)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α和IL-6，而采用siRNA沉默HO-1表達(dá)后，能在一定程度上降低芹菜素對(duì)細(xì)胞因子的抑制效應(yīng)。結(jié)論芹菜素可能通過(guò)激活c-Src/NADPH氧化酶/ROS通路誘導(dǎo)HO-1表達(dá)，從而抑制小鼠巨噬細(xì)胞過(guò)度分泌細(xì)胞因子。

芹菜素；血紅素氧合酶-1；小鼠巨噬細(xì)胞

膿毒血癥是指各種致病性微生物或其毒性產(chǎn)物持續(xù)存在于血液或組織中，并引起全身炎癥反應(yīng)和器官功能損害為特征的一種臨床綜合征，全球每年發(fā)病人數(shù)可達(dá)1800萬(wàn)以上。在美國(guó)，膿毒血癥在ICU中的發(fā)病率可達(dá)30%～50%。革蘭陰性細(xì)菌的脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是引起膿毒血癥最常見的致病物質(zhì)[1]。早期革蘭陰性細(xì)菌感染后，可通過(guò)固有免疫系統(tǒng)識(shí)別LPS，隨后迅速激活單核、巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，并誘導(dǎo)多種促炎細(xì)胞因子如TNF-α，IL-1，IL-6以及一氧化氮、巨噬細(xì)胞趨化蛋白-1等物質(zhì)的產(chǎn)生，從而促進(jìn)免疫系統(tǒng)清除病原體[2]。但如果致炎因素持續(xù)存在或炎癥失控，最終可導(dǎo)致嚴(yán)重的組織損傷以及多器官功能衰竭[3,4]。傳統(tǒng)治療急性炎癥反應(yīng)主要采用固醇類和非甾體類藥物治療，但由于這些藥物副作用嚴(yán)重而使其應(yīng)用受限[5]，因此尋求新的抗炎輔助藥物對(duì)各類炎癥相關(guān)疾病的治療具有重要意義。

芹菜素(apigenin，APG)是廣泛分布于水果、蔬菜(尤其是芹菜、大蒜和大白菜)中的一種黃酮類化合物，具有抗腫瘤、抗血小板聚集、抗氧化等多種生物學(xué)作用[6]。此外，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)也表明APG具有一定的抗炎效應(yīng)。如，Wang等研究發(fā)現(xiàn)，APG可通過(guò)ERK途徑抑制巨噬細(xì)胞分泌TNF-α和IL-1β[7]。此外，APG也可誘導(dǎo)小鼠原代肝細(xì)胞表達(dá)血紅素氧合酶-1(Heme oxygenase-1，HO-1)，同時(shí)也能抑制尼古丁和LPS誘導(dǎo)牙周韌帶細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子[8]。也有研究表明，APG能抑制NF-κB的活性[6]，但APG是否還存在其它的作用機(jī)制目前仍不明了。本研究旨在觀察APG對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞的影響，并初步探索其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Invitrogen；APG、β-actin多克隆抗體為Sigma-Aldrich產(chǎn)品。鼠抗人p-c-Src，p-p47phox以及鼠抗人total-Src和total-p47phox購(gòu)自Cell Signaling?？寡t素氧合酶-1(Heme oxygenase-1，HO-1)、以及各類二抗購(gòu)自Santa Cruz。二亞苯基碘(Diphenyleneiodonium，DPI)、N-乙酰-半胱氨酸(N-acetyl-cysteine，NAC)以及2′,7′-二氯二氫熒光黃二乙酸酯(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，H2DCFDA)、鈷原卟啉(Cobalt protoporphyrin，CoPP)購(gòu)自Sigma-Adrich。HO-1 siRNA購(gòu)自Santa Cruz，TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒購(gòu)自R&D System。磷酸酶、蛋白酶抑制劑購(gòu)自Roche，siRNA轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Qiagen。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與處理RAW 264.7細(xì)胞(ATCC)用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素，4.5 mg/mL L-谷氨酰胺以及4.5 g/mL的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。2～3 d換液一次，待細(xì)胞生長(zhǎng)至密度為80%時(shí)，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，?xì)胞加入不同濃度的APG作用0～16 h，或隨后加入1 μg/mL LPS刺激8 h。

1.3細(xì)胞總蛋白提取細(xì)胞處理結(jié)束后的細(xì)胞用冰冷PBS(pH7.4)漂洗1次，隨后加入100 μL裂解緩沖液A(10 mmol/L HEPES pH 7.9，1.5 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L DTT，5 μmol/L 亮抑蛋白酶肽，2 μmol/L胃酶抑素A，1 μmol/L 抑肽酶，20 μmol/L PMSF和1×磷酸酶抑制劑混合物)，通過(guò)反復(fù)凍融以充分裂解細(xì)胞。隨后1 000×g離心10 min，獲取上清再次離心15 min(10 000×g)后即為胞漿總蛋白。

1.4 Western blot 采用含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液(25mmol/L Tris-HCl pH7.4，150mmol/L NaCl，1% NP-40，1% SDS)裂解細(xì)胞，并用Bradford法于595nm波長(zhǎng)處測(cè)定蛋白濃度。取等量蛋白經(jīng)8%～10% SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉后，分別加入一抗和HRP標(biāo)記二抗孵育，ECL顯影。

1.5 ROS測(cè)定以H2DCFDA為熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。其原理是不發(fā)熒光的H2DCFDA能被過(guò)氧化物、氫過(guò)氧化物等氧化分解為二氯熒光黃而產(chǎn)生熒光，通過(guò)測(cè)定熒光的強(qiáng)度來(lái)反應(yīng)ROS的含量。即，細(xì)胞中加入終濃度5 μmol/L的H2DCFDA染液，37 ℃避光孵育30 min。PBS洗細(xì)胞3次，重懸細(xì)胞，熒光分光光度計(jì)(SynergyHT，Bio-TeK)測(cè)量熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm)，計(jì)算熒光的相對(duì)值(Relative fluorescence intensity)。

1.6 TNF-α和IL-6測(cè)定當(dāng)生長(zhǎng)于6孔板中的細(xì)胞長(zhǎng)滿80～90%視野時(shí)，棄培養(yǎng)基，并加入不同濃度的APG作用1 h后加入LPS作用8 h。操作方法按照試劑盒提供的雙抗體夾心法進(jìn)行。通過(guò)測(cè)定450 nm處的吸光度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算分泌至細(xì)胞外的TNF-α和IL-6含量。

1.7細(xì)胞轉(zhuǎn)染約5×105細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中18～24 h。隨后按照Qiagen提供的操作步驟，將100 nmol/L HO-1 siRNA或?qū)φ誷iRNA混合物孵育細(xì)胞。孵育4h后，用PBS漂洗細(xì)胞，換成完全培養(yǎng)基培養(yǎng)用于下一步研究。

2 結(jié) 果

2.1 APG誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞c-Src磷酸化采用20 μmol/L APG作用RAW264.7細(xì)胞30 min即可誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞中c-Src磷酸化，60 min后達(dá)到峰值，隨后逐漸降低并持續(xù)至4 h，而細(xì)胞內(nèi)總c-Src含量保持恒定(圖1)。

圖1 APG誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞c-Src磷酸化

2.2 APG誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞中NADPH氧化酶p47phox亞基磷酸化Western blot結(jié)果顯示，空白對(duì)照組細(xì)胞NADPH氧化酶亞基p47phox磷酸化水平極低，20 μmol/L APG孵育30 min后，磷酸化p47phox有所增加，1 h后達(dá)到峰值。而同時(shí)采用50 μmol/L c-Src抑制劑PP1處理細(xì)胞1 h后，p47phox磷酸化水平明顯降低(圖2)。

圖2 APG經(jīng)c-Src誘導(dǎo)p47phox亞基磷酸化

2.3 APG激活NADPH氧化酶誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生20 μmol/L APG處理RAW264.7細(xì)胞4 h后，可有效增加細(xì)胞內(nèi)ROS的含量。而細(xì)胞在APG處理前給予10 μmol/L DPI預(yù)處理1 h，結(jié)果顯示ROS含量明顯降低(圖3)。

圖3 APG與DPI對(duì)ROS產(chǎn)生的影響 與對(duì)照組(0 μmol/L APG)相比，*P<0.05；與20 μmol/L APG相比，#P<0.05

2.4 APG對(duì)HO-1表達(dá)的影響0～20 μmol/L APG作用RAW264.7細(xì)胞16 h后，可顯著誘導(dǎo)其表達(dá)HO-1，并且呈一定的劑量依賴性(圖4A)。隨后用20 μmol/L APG作用細(xì)胞4 h后即可誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞表達(dá)HO-1，隨APG作用時(shí)間的延長(zhǎng)，HO-1表達(dá)水平逐漸遞增，持續(xù)到12 h～16 h(圖4B)。

圖4 APG誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞表達(dá)HO-1 A.不同濃度APG誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞表達(dá)HO-1；B.20 μmol/L APG在不同時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞表達(dá)HO-1

2.5 APG經(jīng)c-Src/NADPH氧化酶/ROS誘導(dǎo)HO-1表達(dá)RAW264.7細(xì)胞在APG處理前，分別用50 μmol/L c-Src抑制劑PP1、10 μmol/LNADPH氧化酶抑制劑DPI和10 mmol/L ROS抑制劑NAC預(yù)處理1 h，隨后再用20 μmol/L APG孵育16 h。結(jié)果顯示，PP1、DPI和NAC處理后，HO-1蛋白表達(dá)水平顯著降低(圖5)。

圖5 PP1、DPI、NAC對(duì)APG誘導(dǎo)HO-1表達(dá)的影響

2.6 APG上調(diào)HO-1表達(dá)從而負(fù)調(diào)控TNF-α和IL-6過(guò)度分泌RAW264.7細(xì)胞經(jīng)APG處理后，可顯著下調(diào)LPS誘導(dǎo)其分泌TNF-α和IL-6。而RAW264.7細(xì)胞采用siRNA干擾HO-1表達(dá)后，與未轉(zhuǎn)染組相比，TNF-α和IL-6含量明顯增高。此外，LPS刺激前采用10 μmol/L HO-1激動(dòng)劑CoPP誘導(dǎo)4 h也得到了類似結(jié)果(圖6)。

圖6 HO-1對(duì)TNF-α和IL-6分泌的影響 與LPS相比，*P<0.05

3 討 論

巨噬細(xì)胞在各種病原微生物引起的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。各種細(xì)菌和病毒均可活化巨噬細(xì)胞并誘導(dǎo)其分泌一系列炎癥細(xì)胞因子和介質(zhì)。盡管在急性期這些物質(zhì)對(duì)清除病原體感染、維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)方面具有積極作用，但巨噬細(xì)胞的持續(xù)活化也是引起各種病理性損傷的重要原因[3]。因此采用藥物干預(yù)炎癥反應(yīng)發(fā)生的強(qiáng)度，是有效預(yù)防各類病理?yè)p傷的重要途徑。HO-1是催化血紅素降解為膽紅素、Fe2+和CO的限速酶，又稱為熱休克蛋白32。HO-1為誘導(dǎo)型，多種病理生理狀態(tài)可誘導(dǎo)其表達(dá)等[9]。Stuart等研究表明，LPS通過(guò)上調(diào)HO-1的表達(dá)，從而抑制單核細(xì)胞系THP-1過(guò)度分泌細(xì)胞因子[10]。此外，在動(dòng)物模型中，誘導(dǎo)HO-1表達(dá)可調(diào)節(jié)流感病毒引起的免疫反應(yīng)[11]。而HO-1基因敲出動(dòng)物對(duì)氧化應(yīng)激以及多器官功能衰竭的敏感性增加[12]，因此HO-1的表達(dá)可能是宿主細(xì)胞免受氧化應(yīng)激與炎癥損傷的一種獲得性保護(hù)機(jī)制。在本研究當(dāng)中，我們證實(shí)APG能上調(diào)HO-1的表達(dá)。但其調(diào)控機(jī)制尚不明了。一般認(rèn)為，HO-1的表達(dá)主要受核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的調(diào)控，此外，PKC，PI3K/Akt和NAPDH氧化酶也參與了HO-1的表達(dá)[13]。為了進(jìn)一步探討APG的調(diào)控機(jī)制，本研究對(duì)HO-1可能的調(diào)控分子進(jìn)行了觀察。c-Src是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶，c-Src未激活時(shí)，其527位酪氨酸殘基(Tyr527)處于磷酸化狀態(tài)而使c-Src呈空間卷曲。各種因素導(dǎo)致c-Src激活后，Tyr527發(fā)生去磷酸化，同時(shí)誘導(dǎo)其Tyr416殘基磷酸化而使c-Src處于開放構(gòu)象而激活[14]。有研究顯示，多種病原體致病物質(zhì)可通過(guò)激活c-Src而誘導(dǎo)HO-1表達(dá)[15]。本研究也證實(shí)，巨噬細(xì)胞經(jīng)APG處理30min后即可檢測(cè)出磷酸化c-Src。c-Src激活后能發(fā)揮廣泛的酪氨酸激酶作用，如激活NAPDH氧化酶/ROS信號(hào)通路而誘導(dǎo)多種抗氧化、抗炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)[15]。NADPH氧化酶是一個(gè)多組分活化的酶復(fù)合體，主要由質(zhì)膜結(jié)合成分(包括gp91phox，p22phox，小GTP酶結(jié)合蛋白R(shí)ap1A)及胞漿成分組成(p47phox，p67phox，p40phox，小GTP酶結(jié)合蛋白 Rac2，Cdc42等)組成。外源性因素刺激下可誘導(dǎo)NADPH 氧化酶胞漿亞基p47phox磷酸化，隨后轉(zhuǎn)位到質(zhì)膜或顆粒體膜，從而組裝成有功能的NADPH氧化酶。因此p47phox的磷酸化是NAPDH氧化酶激活的標(biāo)志[16]。在人體單核、巨噬細(xì)胞或中性粒細(xì)胞中，NADPH 氧化酶可通過(guò)一系列電子傳遞催化ROS的生成(氧化爆發(fā))，這是氧化應(yīng)激或炎癥條件下ROS的主要來(lái)源。ROS是生物體內(nèi)產(chǎn)生的活性含氧化合物的總稱，包括超氧陰離子(O2·)、過(guò)氧化氫(H2O2)、羥自由基(HO·)、一氧化氮(NO·)等。過(guò)量的ROS可引起細(xì)胞大分子的氧化損傷，適量的ROS是調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能狀態(tài)的重要信號(hào)分子。本研究結(jié)果顯示，APG處理后可誘導(dǎo)p47phox磷酸化，并能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生。且采用c-Src抑制劑PP1處理后，p47phox磷酸化水平明顯降低。此外，采用NADPH氧化酶抑制劑DPI處理后，ROS含量也明顯減少，表明APG處理后可激活c-Src/NADPH氧化酶/ROS通路。最后，分別采用c-Src、NAPDH氧化酶、ROS抑制劑PP1、DPI和NAC處理細(xì)胞后，HO-1的表達(dá)顯著降低。這表明APG誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)受c-Src/NADPH氧化酶/ROS調(diào)控。

HO-1可通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用及免疫調(diào)控作用。為了進(jìn)一步探討為了明確HO-1在負(fù)調(diào)控炎癥反應(yīng)中的作用，本研究通過(guò)靶向沉默HO-1表達(dá)以及藥物誘導(dǎo)的方式對(duì)TNF-α和IL-6的分泌進(jìn)行了觀察。RNA干擾HO-1表達(dá)后，與單純LPS處理相比，TNF-α和IL-6分泌顯著增高。同時(shí)采用CoPP誘導(dǎo)HO-1表達(dá)后，TNF-α和IL-1β水平再次降低。以上結(jié)果表明HO-1表達(dá)能在一定程度上調(diào)控炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度，從而發(fā)揮對(duì)免疫功能的調(diào)控。

總之，本研究證實(shí)APG對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子具有抑制作用。APG通過(guò)激活c-Src/NAPDH氧化酶/ROS信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)。當(dāng)然，除了NADPH氧化酶以及ROS外，HO-1的表達(dá)還受PI3K/Akt以及蛋白激酶C的調(diào)控，在隨后的研究當(dāng)種我們將會(huì)對(duì)其開展更深一步探討。

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ApigeninInducesHO-1Expressionbyc-Src/NADPHOxidase/ROStoProtectAgainstExcessiveCytokinesSecretioninMurineMacrophages

ZENG Saili,WU Guang,XIE Li,et al

(DepartmentofRespiratoryMedicine,TheSecondAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,Hunan,China)

ObjectiveTo investigate the effect and the mechanism of Apigenin on lipopolysaccharides (LPS)-induced cytokines production in murine macrophages.MethodsThe murine macrophage cell line RAW 264.7 cells were cultured in vitro,and were treated with different concentration of Apigenin followed by LPS stimulation.Expression of heme oxygenase-1 (HO-1),phosphorylation of c-Src and p47phox,the subunit of NADPH oxidase were detected by Western blot;The intracellular formation of reactive oxygen species (ROS) was detected by using the fluorescent probe H2DCFDA;Secretion of TNF-α and IL-6 were detected by ELISA.ResultsWestern blot indicated that phosphorylated c-Src and p47phoxwere induced by apigenin after 30min of incubation.While 50 μmol/L of PP1,an inhibitor of c-Src,could significantly inhibit p47phoxphosphorylation.In addition,Apigenin could also induce RAW264.7 cells accumulation of ROS,and this effect could be abrogated by the NAPDH oxidase inhibitor,DPI.HO-1 could be induced by Apigenin,and pretreatment of PP1,DPI and the ROS scavenger N-acetyl-cysteine (NAC) could block HO-1 production.Furthermore,apigenin could inhibit LPS-induced secretion of TNF-α and IL-6,and transfection of HO-1 siRNA could antagonize this action.ConclusionApigenin can induce HO-1 expression by c-Src/NADPH oxidase/ROS to protect against excessive cytokines secretion in murine macrophages.

Apigenin; Heme oxygenase-1; Murine macrophages

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.04.003

2015-04-22；

2015-05-23

國(guó)家自然科學(xué)基金(31370207).

*通訊作者，E-mail：zengyihua21cn@126.com.

R967

A

(此文編輯：秦旭平)