PRMT2慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

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(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所，湖南 衡陽(yáng) 421001)

·技術(shù)與方法·

PRMT2慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

鐘警，楊心治，張艷敏，高?；ǎ匦衿?，文格波*

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所，湖南 衡陽(yáng) 421001)

目的構(gòu)建精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶2(PRMT2)慢病毒表達(dá)載體。方法通過(guò)PCR擴(kuò)增PRMT2 cDNA,將PRMT2 cDNA連接于GV308載體，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)后，將GV308/PRMT2與pHelper 1.0和pHelper 2.0共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，收獲病毒，通過(guò)Real time PCR測(cè)定滴度; 將PRMT2慢病毒表達(dá)載體侵染293T細(xì)胞，通過(guò)四環(huán)素誘導(dǎo)和Western blot檢測(cè)PRMT2慢病毒表達(dá)載體的表達(dá)能力。結(jié)果在感染PRMT2 慢病毒載體293T細(xì)胞中能檢測(cè)到PRMT2-3Flag融合蛋白的表達(dá)。結(jié)論成功構(gòu)建PRMT2的慢病毒表達(dá)載體。

PRMT2； 慢病毒載體； 基因治療

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其病因尚不清楚。近年來(lái)，乳腺癌的發(fā)病率呈低齡化和逐年上升趨勢(shì)。研究表明，乳腺癌的發(fā)生發(fā)展與多種因素有關(guān)，其中，雌激素/雌激素受體α(estrogen/estrogen receptor α,E2/ERα)參與了乳腺癌細(xì)胞的增殖、分化及凋亡，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用[1-3]。ERα在配體(雌激素)作用下形成同源二聚體，在不同的病理生理?xiàng)l件下，同源二聚體與不同靶基因啟動(dòng)子區(qū)中的雌激素反應(yīng)元件(estrogen response elements，ERE)結(jié)合，并在ERα眾多共調(diào)節(jié)因子作用下，激活靶基因轉(zhuǎn)錄[4-5]。精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶2(protein arginine methyltransferases，PRMT2)是PRMTs家族成員之一。研究表明，PRMT2僅具有微弱的甲基轉(zhuǎn)移酶活性，卻能以配體依賴的形式提高ERα的轉(zhuǎn)錄活性，被確認(rèn)為一種ERα的共調(diào)節(jié)因子[6]。PRMT2亦能提高其他核受體如雄激素受體和孕激素受體的轉(zhuǎn)錄活性[7]。最近的研究表明，PRMT2還可通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子甲基化、組蛋白甲基化和RNA差異剪接等多種機(jī)制發(fā)揮不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用[7-9]，并在細(xì)胞分化、炎癥反應(yīng)、NF-κB與瘦素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著一定作用[10-12]。由此可見(jiàn)，PRMT2的作用是非常復(fù)雜的。前期研究表明，PRMT2基因在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，在正常組織中表達(dá)于胞核，而在癌組織中則主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的胞漿，因此，推測(cè)，PRMT2極有可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本研究將構(gòu)建表達(dá)PRMT2的慢病毒載體，為闡明PRMT2在乳腺腫瘤發(fā)生的作用提供有效生物學(xué)工具。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

293T細(xì)胞培養(yǎng)使用含10%胎牛血清(Gibco)、2 mmol/L glutamine 和100 U青霉素的DMEM (Hyclone,UT)，在37 ℃ 5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 PRMT2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒載體構(gòu)建

提取293T細(xì)胞總RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后PCR獲得PRMT2 cDNA，引物序列如下：PRMT2-P1：5′-AAC CGT CAG ATC GCA CCG GCG CCA CCA TGG CAA CAT CAG GTG ACT G-3′，PRMT2-P2：5′-TCC TTG TAG TCC ATG AAT TCT CTC CAG ATG GGG AAG ACT T-3′，引物由捷瑞生物技術(shù)公司合成。PRMT2 cDNA經(jīng)AgeI/EcoRI 雙酶切后與GV308 載體(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司)連接。取連接產(chǎn)物5 μL轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)大腸桿菌，鋪瓊脂平板(含50 μg/mL 氨芐青霉素),37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。次日挑取單菌落，經(jīng)小量擴(kuò)增，提取質(zhì)粒并純化后送上海生工生物技術(shù)公司測(cè)序鑒定。

1.3 PRMT2過(guò)表達(dá)慢病毒在293T細(xì)胞內(nèi)的包裝

按陽(yáng)離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 (Invitrogen公司)試劑盒說(shuō)明操作，將PRMT2過(guò)表達(dá)慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒和pHelper 1.0與 pHelper 2.0通過(guò)共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中，37 ℃孵育過(guò)夜后改換含丙酮酸鈉和非必需氨基酸的DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),72 h后將細(xì)胞培養(yǎng)基以4 ℃ 3 000 r/min離心15 min，棄沉淀，將含有慢病毒顆粒的上清液分裝后，凍存于-80 ℃。

1.4 Real time定量PCR法測(cè)定病毒滴度

24孔板每孔加入500 μL培養(yǎng)基，接種約1 ×105個(gè)293 T細(xì)胞。次日，準(zhǔn)備7個(gè)每管含有90 μL培養(yǎng)基的無(wú)菌Ep管；將待測(cè)定病毒原液10 μL加入到第一個(gè)管中，混勻后，取10 μL加入到第二個(gè)管中，繼續(xù)相同操作直到最后一管。待測(cè)細(xì)胞每孔吸去90 μL培養(yǎng)基，分別加入稀釋好的病毒溶液，將細(xì)胞放入37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入新鮮培養(yǎng)基500 μL繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，抽提RNA進(jìn)行RT-qPCR檢查細(xì)胞中目的基因的拷貝數(shù)。Real time定量PCR目的基因引物序列如下：PRMT2-P3：5′-AAT TCC GTG GTG TTG TCG-3′；PRMT2-P4：5′-AAG GTC CGC TGG ATT GAG-3′。內(nèi)參引物序列如下：Actin1：5′-GTG GAC ATC CGC AAA GAC-3′； Actin2：5′-AAA GGG TGT AAC GCA ACT A-3′。反應(yīng)結(jié)束后得到Ct值，Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

1.5 Western blot

PRMT2表達(dá)慢病毒感染293T細(xì)胞后72 h,將細(xì)胞裂解液(10 mol/L HEPES,10 mmol/L KCl,1 mmol/L EDTA,pH 8.0,0.1% NP-40,1 mmol/L DTT,1 mmol/L PMSF和0.5 mmol/L Na3VO4)置冰上預(yù)冷，30 min后制備抽提細(xì)胞蛋白。12% SDS-PAGE 膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜。5%牛奶封閉45 min后，孵育Flag 一抗(1∶3 000)1 h，而后孵育羊抗小鼠IgG(1∶4 000) 1 h?；瘜W(xué)熒光系統(tǒng)( Pierce,IL)檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 PRMT2 Tet-on表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

參照Lentiviral Expression System說(shuō)明書(shū)構(gòu)建PRMT2慢病毒載體,并通過(guò)測(cè)序檢驗(yàn)(圖1)。結(jié)果顯示: PRMT2序列成功插入到GV308載體AgeI/EcoRI 雙酶切位點(diǎn),測(cè)序證實(shí)序列與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的堿基序列一致。

圖1 PRMT2慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建 A：GV308載體； B：載體酶切電泳(1：Marker，2：載體酶切產(chǎn)物，3：未酶切載體)； C：PRMT2基因PCR擴(kuò)增電泳圖 (1：Marker，2：擴(kuò)增產(chǎn)物)；D：重組載體PCR鑒定(1，2：陰性對(duì)照，3：陽(yáng)性對(duì)照，4：Marker，5～12：PRMT2 1～8號(hào)重組子)

2.2 PRMT2慢病毒載體的包裝及病毒滴度測(cè)定

病毒包裝質(zhì)粒混合物和GV308/PRMT2重組質(zhì)粒載體通過(guò)脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染293T宿主細(xì)胞48 h，收集培養(yǎng)基進(jìn)行病毒滴度測(cè)定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在本次滴度檢測(cè)中，10-4μL組樣品和Control組樣品的Ct值存在顯著差異，所以認(rèn)為在10-4μL組樣品中存在病毒顆粒。假定該組樣品含有至少1個(gè)病毒顆粒，則病毒的滴度為：2.0 ×108TU/mL(圖2，表1)。

圖2 病毒滴度檢測(cè) Real-time PCR檢測(cè)病毒滴度的熒光曲線，不同顏色曲線代表不同病毒滴度

表1不同濃度病毒感染后樣品組的Ct值及表達(dá)量分析

樣品組CtActinCtTargetgeneCtTargetgene均值△Ct=CtTargetgene均值-CtActinCON13.73------1μL13.9318.0618.0854.15518.1110-1μL13.9421.4821.57.56021.5210-2μL13.7525.6725.64511.89525.6210-3μL13.6628.8828.8315.17028.7810-4μL13.8932.0832.30518.41532.53

Ct Actin:Actin 循環(huán)數(shù)；Ct Target gene:靶基因循環(huán)數(shù)；Ct Target gene均值:兩次實(shí)驗(yàn)靶基因循環(huán)數(shù)的均值；△Ct=Ct Target gene 均值- Ct Actin:兩次實(shí)驗(yàn)靶基因循環(huán)數(shù)的均值與Actin 循環(huán)數(shù)的差值。

2.3 PRMT2慢病毒載體能在293 T細(xì)胞內(nèi)表達(dá)

為確認(rèn)PRMT2慢病毒是否可以在細(xì)胞內(nèi)表達(dá),選用PRMT2具有較低內(nèi)源性表達(dá)的293T細(xì)胞作為病毒感染模型。細(xì)胞經(jīng)病毒感染72 h后,用四環(huán)素誘導(dǎo)PRMT2蛋白表達(dá)，顯微鏡觀察293T 細(xì)胞形態(tài)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞形態(tài)逐漸演變成長(zhǎng)梭形，纖維細(xì)胞樣形態(tài)，呈現(xiàn)上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transition，EMT)現(xiàn)象(圖3)。提取總蛋白,通過(guò)Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PRMT2-3Flag融合蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明PRMT2-3Flag在293T細(xì)胞中具有表達(dá)(圖4)。

圖3 四環(huán)素誘導(dǎo)293T細(xì)胞表達(dá)PRMT2前后細(xì)胞形態(tài)改變(200×) A：無(wú)四環(huán)素誘導(dǎo)； B：四環(huán)素誘導(dǎo)后

圖4 PRMT2慢病毒表達(dá)載體在293T細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)PRMT2-3Flag融合蛋白 1：PRMT2慢病毒表達(dá)載體感染293T細(xì)胞，無(wú)四環(huán)素誘導(dǎo)；2：PRMT2慢病毒表達(dá)載體感染293T細(xì)胞，四環(huán)素誘導(dǎo)；3：陰性對(duì)照，293T細(xì)胞；4：陽(yáng)性對(duì)照，WB標(biāo)準(zhǔn)品——SURVIVIN-3FLAG-GFP.

3 討 論

PRMTs家族是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中常見(jiàn)的酶類，目前發(fā)現(xiàn)其有11個(gè)成員，具有不同的生物學(xué)功能[13-14]。近年的研究表明，PRMTs成員與腫瘤的生成及侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。Mathioudaki等研究表明，PRMT1的高表達(dá)與乳腺癌的進(jìn)展有關(guān)[15]。Yoshimatsu等采用基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PRMT1與PRMT6參與了肺癌和膀胱癌的增殖[16]。Al-Dhaheri等的研究表明，PRMT4(Coactivator-associated arginine methyltransferase 1,CARM1)是ERα陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞分化和增殖的重要決定因子[17]。Frietze等的研究表明，CARM1能夠通過(guò)上調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子E2F1而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖[18]。

我們前期的研究結(jié)果表明，PRMT2主要表達(dá)于乳腺、甲狀腺、卵巢和子宮等雌激素相關(guān)的組織器官，而在前列腺、睪丸等雄激素相關(guān)的組織器官中表達(dá)較低[19]。而且，我們采用熒光素酶雙報(bào)告基因檢測(cè)與免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在ERα陽(yáng)性乳腺癌MCF7細(xì)胞中，PRMT2能與ERα直接作用，在10nM雌激素作用下能顯著提高ERα的轉(zhuǎn)錄活性[20]。以上結(jié)果提示PRMT2可能在E2/ERα信號(hào)傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮著重要作用。Park等的研究表明，E2/ERα能夠上調(diào)snail與slug的表達(dá)，而下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)EMT的形成，誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[21]。我們推測(cè)，PRMT2有可能通過(guò)E2/ERα介導(dǎo)，上調(diào)snail的表達(dá)，而下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)EMT的形成，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。EMT是一種以上皮表型缺失和間質(zhì)表型獲得為主要特征的基本生理、病理現(xiàn)象，在胚胎發(fā)育以及細(xì)胞生長(zhǎng)增殖中起著重要作用[22]。近年的研究表明，EMT參與了上皮性腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[23]。因此，EMT分子調(diào)控機(jī)制的研究為預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移提供強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。我們成功構(gòu)建了PRMT2的慢病毒表達(dá)載體，感染293T細(xì)胞后在四環(huán)素的誘導(dǎo)下，部分細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯的間質(zhì)化改變，呈現(xiàn)EMT現(xiàn)象，這提示PRMT2高表達(dá)可能促進(jìn)EMT的形成，從而參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程，但PRMT2具體通過(guò)何種機(jī)制參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程還有待進(jìn)一步闡明。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了PRMT2的慢病毒載體，并獲得了較高滴度PRMT2重組病毒，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)在四環(huán)素誘導(dǎo)下，239T細(xì)胞中該重組病毒可成功被誘導(dǎo)表達(dá)PRMT2-3Flag融合蛋白，由于該病毒載體具有3Flag和Puromycin抗性篩選標(biāo)記，PRMT2重組病毒可進(jìn)一步用于細(xì)胞和動(dòng)物模型的建立，為進(jìn)一步構(gòu)建穩(wěn)定性表達(dá)PRMT2乳腺癌細(xì)胞株和獲得PRMT2轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為深入探索PRMT2在乳腺癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用機(jī)制提供了強(qiáng)有力的生物學(xué)工具。

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TheEstablishmentandIdentificationofLentiviruswithPRMT2Expression

ZHONG Jing,YANG Xinzhi,ZHANG Yanmin,et al

(InstituteofClinicalMedicine,theFirstAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo obtain Lentivirus with PRMT2 expression.MethodsPRMT2 cDNA was obtained from cDNA pool by RT-PCR,and the PRMT2 cDNA was ligated with GV308 vector; the GV308/PRMT2 plasmid confirmed by sequencing was cotranfected with pHelper 1.0 and pHelper 2.0 into 293T cells to obtain PRMT2 Lentivirus; titer of Lentivirus with PRMT2 expression was assessed by Real Time PCR; the expression of PRMT2 was induced by Doxycycline hyclate and detected by Western blot in PRMT2 Lentivirus infected 239T cells.ResultsPRMT2 Lentivirus could express PRMT2 in 239T cells.ConclusionLentivirus with the expression of PRMT2 was successfully established.

PRMT2; lentivirus; gene therapy

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.01.019

2014-09-04；

2014-11-29

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(31200573)、國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81272906)和湖南省自然科學(xué)基金(12JJ3116)

*通訊作者，Email:Zhongjing2002@hotmail.com

R737.9

A

(此文編輯：秦旭平)