檳榔堿對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝的影響

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(南華大學附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南 衡陽 421001)

·基礎(chǔ)醫(yī)學·

檳榔堿對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝的影響

歐瓊，黃余良，張群鋒

(南華大學附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南 衡陽 421001)

目的探討檳榔堿對去卵巢骨質(zhì)疏松(OP)大鼠骨代謝的影響。方法50只健康SD雌性大鼠隨機分為對照組、模型組、低、中和高劑量檳榔堿組(1、5、20 mg/kg，每天灌胃1次)。12周后檢測尿鈣和尿脫氧吡啶啉(Dpd)及血清鈣、血清磷、血堿性磷酸酶(ALP)和雌二醇(E2)水平。采用雙能X射線吸收法測量大鼠右側(cè)股骨的骨密度(BMD)。取股骨進行3點彎曲生物力學試驗。結(jié)果與對照組比較，模型組大鼠血清E2水平和BMD顯著降低(P<0.05)，尿鈣、尿Dpd、血清鈣、血清磷和ALP水平均顯著增加(均P<0.05)，左側(cè)股骨的生物力學指標包括最大載荷、最大撓度、彈性載荷和彎曲能量均顯著降低(均P<0.05)。與模型組比較，中和高劑量檳榔堿組大鼠股骨的BMD顯著增加(P<0.05)，尿鈣、尿Dpd、血清鈣、血清磷和ALP水平顯著降低(均P<0.05)，左側(cè)股骨的最大載荷、最大撓度、彈性載荷和彎曲能量均顯著增加(均P<0.05)。結(jié)論檳榔堿改善了去卵巢OP大鼠的骨代謝，增強其骨密度，改善骨生物力學指標。

檳榔堿； 去卵巢； 骨質(zhì)疏松； 骨密度

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種代謝性骨骼疾病，以骨量減少、骨代謝活躍、骨強度下降，伴隨骨轉(zhuǎn)換增強出現(xiàn)松質(zhì)骨、骨脆性增加和易發(fā)生骨折為特征[1]。OP好發(fā)于60歲以上老年人，在絕經(jīng)后的婦女中發(fā)病率更高，被稱為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)[2]。研究發(fā)現(xiàn)PMOP的發(fā)生與絕經(jīng)后卵巢萎縮導(dǎo)致體內(nèi)雌激素水平降低有關(guān)，目前PMOP的治療主要采用激素替代療法，但是激素替代療法存在嚴重的副作用，如可能會增加乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌等的風險[3]，因此尋找新的防治PMOP的途徑具有重要的意義。檳榔堿是棕櫚科植物檳榔的種子的活性成分，檳榔堿具有殺菌、驅(qū)蟲、促消化、抗血栓形成、抗衰老和抗動脈粥樣硬化等作用[4-7]。本研究擬采用切除大鼠的卵巢模擬PMOP，觀察檳榔堿對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝、骨密度和骨生物力學特征的影響的影響，為檳榔堿的抗骨質(zhì)疏松作用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

檳榔堿(Sigma公司)，脫氧吡啶啉ELISA法檢測試劑盒(上海億欣生物科技有限公司)，尿鈣鄰甲酚酞絡(luò)合酮法檢測試劑盒(南京天鼎生物技術(shù)研究所)，雌二醇放免法檢測試劑盒(北京東雅生物工程公司)。LUNAR-DPXIC型骨密度儀(GE公司)，CSS44100型電子萬能試驗機(中國長春材料試驗機研究所)，VI—MRXII型酶標儀(美國Dynex公司)，HITACH717全自動生化分析儀(日本日立公司)和全自動γ計數(shù)儀(上海第二儀器廠)。

1.2 動物模型制備

成年清潔級雌性健康的未交配Sprague-Dawley (SD)大鼠50只，6個月齡，體重250±20 g，購自南華大學實驗動物學部。大鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，禁食過夜，自由飲水，準備去卵巢的大鼠，用3.6%水合氯醛(10 mL/kg體重)通過腹腔注射麻醉，仰面固定，腹部常規(guī)消毒，做腹正中切口，先找到子宮，然后沿每側(cè)子宮找到卵巢，分離周圍組織，結(jié)扎后完整摘除雙側(cè)卵巢。大鼠自然清醒，術(shù)后用青霉素(4萬單位/只)治療3天。

1.3 實驗分組

SD大鼠通過隨機數(shù)字表法分為對照組(10只)和去卵巢組(40只)，對照組大鼠進行假手術(shù)，去卵巢組大鼠進行雙側(cè)卵巢切除。然后將40只去卵巢大鼠隨機法分為去卵巢骨質(zhì)疏松模型組(模型組)、檳榔堿低、中和高劑量組，每組10只大鼠。檳榔堿低、中和高劑量組分別按1、5和20 mg/kg每天灌胃1次[8]。大鼠由專人飼養(yǎng)，每籠6只，自由進食和飲水，12 h光照，溫度22±3℃。實驗時間為12周，在實驗過程中沒有大鼠意外死亡。

1.4 股骨骨密度檢測

實驗進行12周后，3.6%水合氯醛(10 mL/kg體重)腹腔注射麻醉，打開胸腔，通過心臟放血，處死大鼠，迅速剔出大鼠的兩側(cè)股骨，剔除周圍的軟組織。右側(cè)股骨用于檢測股骨骨密度(boneminaral density，BMD)，左側(cè)股骨用于生物力學檢測。然后用LUNAR-DPXIC型骨密度儀，采用雙能X射線吸收法和手動橢圓形方式測量大鼠右側(cè)股骨中段的BMD。

1.5 股骨生物力學3點彎曲試驗

將大鼠的左側(cè)股骨置于CSS-44100型電子萬能試驗機上，將股骨中點作為加力點，支座跨距為20 mm，加載速度為5 mm/min，最大載荷為200 N，加載至骨折，測量股骨內(nèi)徑、外徑，采用計算機記錄結(jié)果，并分析最大載荷、最大撓度、彈性載荷和彎曲能量。

1.6 骨代謝相關(guān)生化指標測定

實驗進行12周后，3.6%水合氯醛(10 mL/kg體重)腹腔注射麻醉，打開胸腔，通過心臟放血處死大鼠。取膀胱中的尿液，采用鄰甲酚酞絡(luò)合酮法測定尿鈣水平，ELISA方法測定尿脫氧吡啶啉(deoxypyridinoline,Dpd)水平，結(jié)果以每mmol肌酐(creatinine,Cr)表示。取血清，采用全自動生化分析儀測定血清鈣、血清磷和血堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)水平，采用放免法測量血清雌二醇(estradiol,E2)水平。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 檳榔堿對去卵巢OP大鼠BMD的影響

雙側(cè)卵巢切除后12周，取各組大鼠的右側(cè)股骨，用雙能X線吸收法分別測定各組大鼠右側(cè)股骨中段的BMD。與對照組比較，對模型組大鼠右側(cè)股骨的BMD顯著降低(P<0.05)；與對模型組比較，檳榔堿中、高劑量組大鼠右側(cè)股骨的BMD顯著增加(均P<0.05)(見圖1)。

圖1 檳榔堿對去卵巢骨質(zhì)疏松(OP)大鼠骨密度的影響(n=20) 1：對照組；2：模型組；3：1 mg/kg檳榔堿組；4：5 mg/kg檳榔堿組；5：20 mg/kg檳榔堿組. 與對照組比較，*：P<0.05；與模型組比較，#：P<0.05

2.2 檳榔堿對去卵巢OP大鼠生物力學特征的影響

與對照組比較，對模型組大鼠左側(cè)股骨最大載荷、最大撓度、彈性載荷和彎曲能量均顯著降低(P<0.05)；與對模型組比較，檳榔堿中、高劑量組大鼠左側(cè)股骨的最大載荷、最大撓度、彈性載荷和彎曲能量均顯著增加(均P<0.05)(見表1)。

2.3 對去卵巢OP大鼠尿鈣和尿脫氧吡啶啉水平的影響

與對照組比較，模型組大鼠血清E2水平顯著降低(P<0.05)，檳榔堿沒有影響大鼠體內(nèi)的E2水平(P>0.05)。與對照組比較，模型組大鼠尿鈣和尿Dpd水平顯著增加(均P<0.05)。與模型組比較，檳榔堿中、高劑量組大鼠尿鈣和尿Dpd水平顯著降低(均P<0.05)(見表2)。

2.4 對去卵巢血清鈣、血清磷和血堿性磷酸酶水平的影響

與對照組比較，模型組大鼠血清磷和ALP水平顯著增加(均P<0.05)。與模型組比較，檳榔堿中、高劑量組組大鼠血清磷和ALP水平顯著降低(均P<0.05)(見表2)。

表1檳榔堿對去卵巢OP大鼠生物力學特征的影響

組別最大載荷(N)彈性載荷(N)最大撓度(mm)彎曲能量(N/mm)對照組96.42±7.3565.94±8.191.52±0.1915.72±2.03模型組82.71±9.64a51.93±5.37a1.21±0.11a12.39±1.16a1mg/kg檳榔堿組84.23±8.0353.74±4.931.23±0.1712.75±1.845mg/kg檳榔堿組95.73±6.77b62.86±8.05b1.48±0.15b14.86±1.27b20mg/kg檳榔堿組98.25±10.25b69.04±7.66b1.61±0.13b17.94±1.91b

與對照組比較，a：P< 0.05；與模型組比較，b：P< 0.05

表2檳榔堿對去卵巢OP大鼠血清雌二醇、鈣、磷和堿性磷酸酶以及尿鈣和尿脫氧吡啶啉水平的影響(n=10)

組別血清雌二醇(pmol/L)尿鈣(mg/L)尿脫氧吡啶啉/肌酐(nmol/mmol)血清鈣(mmol/L)血清磷(mmol/L)堿性磷酸酶(U/L)對照組77.53±7.590.82±0.0613.54±1.463.18±0.322.35±0.2775.23±6.41模型組12.45±1.32a1.91±0.18a23.84±2.42a4.82±0.61a4.37±0.51a158.72±16.39a1mg/kg檳榔堿組11.89±1.241.80±0.1921.78±2.564.67±0.843.97±0.45149.38±13.745mg/kg檳榔堿組12.81±1.071.24±0.11b17.64±1.82b3.84±0.343.08±0.33b105.67±11.03b20mg/kg檳榔堿組13.06±1.280.89±0.07b14.67±1.26b3.32±0.312.49±0.28b87.61±7.26b

與對照組比較，a：P< 0.05；與模型組比較，b：P< 0.05

3 討 論

OP的主要病理特征是在骨代謝過程中骨形成和骨吸收之間的失衡，導(dǎo)致機體內(nèi)的鈣磷代謝紊亂，最后導(dǎo)致骨質(zhì)丟失和骨密度降低。OP多發(fā)生于絕經(jīng)后的老年女性，卵巢切除大鼠是研究PMOP的經(jīng)典動物模型，大鼠切除卵巢后，體內(nèi)雌激素的水平急劇降低，誘導(dǎo)破骨細胞分化和增殖，使骨形成減少而骨吸收增加，卵巢切除大鼠松質(zhì)骨的骨量減少，骨小梁數(shù)量減少，骨強度下降，伴隨骨轉(zhuǎn)換增強出現(xiàn)松質(zhì)骨骨丟失，最終引發(fā)OP[9]。松質(zhì)骨骨丟失是伴隨骨轉(zhuǎn)換增強而進行的，卵巢切除大鼠這種特性很好地模仿了女性正常絕經(jīng)后高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松發(fā)生時的骨丟失狀態(tài)。雌性大鼠在6～9個月骨的生長進入靜止期，骨骺開始閉合，10個月左右達到峰值骨量，骨的代謝進入一個相對穩(wěn)定的時期[10]。

骨形成和骨吸收是骨代謝中兩個緊密相聯(lián)的過程。骨組織中含有大量的鈣和磷，骨組織被吸收時鈣和磷釋放入血，使血鈣和血磷水平增加，然后鈣可從尿液中排出，使尿鈣水平增加，因此尿鈣、血鈣和血磷水平可反映骨吸收和骨丟失的情況[11]。Dpd是骨骼內(nèi)I型膠原的重要組成成分，是骨骼的特異性標志物，參與骨膠原合成過程中膠原分子間的連接。骨組織被吸收時，骨溶解使骨膠原蛋白水解，而釋放出Dpd進入血液中，最后從腎臟排出。因此尿Dpd水平可反映骨吸收的情況[12]。ALP是評價骨形成和骨轉(zhuǎn)換最常用的指標。血清中ALP大約有50%來源于骨骼，ALP的活性可反映成骨細胞活性和狀態(tài)，雌激素的減少使其對破骨細胞的抑制作用減弱，骨的吸收增加，隨之骨形成也增加，導(dǎo)致高轉(zhuǎn)換型OP，ALP水平也相應(yīng)增加[13]。本研究中通過切除6個月齡的SD大鼠的雙側(cè)卵巢來模擬PMOP的發(fā)生，在卵巢切除12周后，卵巢切除大鼠與假手術(shù)對照組比較，血清E2水平和BMD降低，骨密度顯著降低，尿鈣、尿Dpd、血清鈣、血清磷和ALP水平明顯增加，說明骨代謝處于高轉(zhuǎn)換狀態(tài)，表明PMOP模型建立成功。

檳榔是南方尤其是湖南地區(qū)比較流行的咀嚼食品，檳榔又是一種中藥。檳榔堿是從棕櫚科植物檳榔的果子中提取的一種胺類生物堿，也是檳榔種子中含量最為豐富的生物堿之一和主要的藥理活性成分。研究顯示檳榔堿具有多種藥理作用，包括驅(qū)蟲、促進消化、防治阿爾茨海默病、抗衰老、抗抑郁和抗動脈粥樣硬化等藥理作用[14-16]。本實驗結(jié)果表明檳榔堿增加了模型組大鼠的BMD，降低了尿鈣、尿Dpd、血清鈣、血清磷和ALP水平。這些結(jié)果表明表明檳榔堿抑制了卵巢切除誘導(dǎo)的PMOP發(fā)生，參與骨代謝的調(diào)節(jié)和PMOP的發(fā)生發(fā)展，因此檳榔堿有望成為PMOP治療的新途徑和新策略，但其抗PMOP的機制還不清楚，有待進一步的研究。

總之，本研究結(jié)果表明檳榔堿改善了去卵巢OP大鼠的骨代謝，增強骨密度，改善骨生物力學指標。本研究為PMOP的防治提供了新的線索和策略。

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EffectofArecolineontheBoneMetabolisminOvariectomizedRatswithOsteoporosis

OU Qiong,HUANG Yuliang,ZHANG Qunfeng

(DepartmentofGynaecologyandObstetrics,theSecondAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo investigate the effect of arecoline on the bone metabolism in ovariectomized rats with osteoporosis.MethodsThe fifty SD female rats were randomly divided into sham control,ovariectomized osteoporosis model,and low,middle and high dose arecoline group.Arecoline (1,5 and 20 20 mg/kg) was administered by lavage every day.After 12 weeks,the levels of urine calcium and deoxypyridinoline (Dpd),serum calcium,serum phosphorus,serum alkaline phosphatase (ALP) and estradiol (E2) were measured.Bone mineral density (BMD) was measured by a dual-energy X-ray absorptiometry.3 point bend testing of femur was accomplished.ResultsCompared with the sham control group,the levels of E2and BMD were significantly decreased (allP<0.05),the levels of urine calcium and Dpd,serum calcium,serum phosphorus and serum ALP were significantly increased (allP<0.05) and the biomechanical indexes including maximum load,maximum deflection,elastic load and bending energy were significantly decreased (allP<0.05) in the ovariectomized osteoporosis model group.Compared with the ovariectomized osteoporosis model group,the level of BMD were significantly increased,the levels of urine calcium and Dpd,serum calcium,serum phosphorus and serum ALP were significantly decreased (allP<0.05) and the maximum load,maximum deflection,elastic load and bending energy were significantly increased (allP<0.05) in the ovariectomized osteoporosis model group.ConclusionArecoline improves the bone metabolism,increases BMD and improves the biomechanical indexes of bone.

arecoline; ovariectomized; osteoporosis; boneminaral density

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.01.007

2014-09-04；

2014-12-27

R71

A

(此文編輯：朱雯霞)