阿利吉侖對大鼠腎纖維化TGF-β1/Smad信號通路的影響

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(1.南華大學(xué)護理學(xué)院，湖南 衡陽，421001；2.衡陽市中心醫(yī)院；3.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

阿利吉侖對大鼠腎纖維化TGF-β1/Smad信號通路的影響

李健芝1，庾江東2，胡麗1，梁瑜3*

(1.南華大學(xué)護理學(xué)院，湖南 衡陽，421001；2.衡陽市中心醫(yī)院；3.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

目的探討阿利吉侖對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)纖維化的作用及機制。方法24只雌性SD大鼠隨機分為3組,Sham組、UUO組及aliskiren組，除Sham組外，UUO組及aliskiren組均行左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)。aliskiren組術(shù)前1 d開始灌胃給藥，阿利吉倫50 mg/(kg·d),每日1次，連續(xù)2周。術(shù)后第14天處死大鼠,留取梗阻側(cè)腎組織行HE染色和Masson染色，光鏡下觀察各組大鼠腎組織病理變化，免疫組化和Western印跡檢測腎組織TGF-β1、Smad2和Smad7蛋白表達水平。結(jié)果阿利吉侖可明顯減輕大鼠腎間質(zhì)炎性細胞浸潤、纖維組織增生及腎小管擴張和萎縮。免疫組化和Western印跡結(jié)果均顯示：與Sham組相比，UUO組TGF-β1、Smad2表達明顯上升，而Smad7表達明顯下降(均P<0.05)；與UUO組相比，aliskiren組TGF-β1、Smad2表達明顯下降，Smad7表達明顯上升(均P<0.05)。結(jié)論TGF-β1/Smad信號通路與腎間質(zhì)纖維化有關(guān)，阿利吉侖可抑制腎間質(zhì)纖維化，其機制可能與下調(diào)TGF-β1、Smad2的表達和上調(diào)Smad7的表達有關(guān)。

TGF-β1； Smad2； Smad7； 纖維化； 阿利吉侖； 梗阻性腎病

腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟疾病進展至終末期腎病的共同途徑，與腎小球硬化相比，腎間質(zhì)纖維化嚴重程度與腎功能的關(guān)系更為密切[1]。TGF -β/Smads信號通路參與了腎間質(zhì)纖維化的進程[2]。目前，臨床上在治療慢性腎臟疾病時，主要圍繞減少AngⅡ的生成及抑制其效應(yīng)而首選ACEI或ARB保護腎功能。阿利吉侖是一種新型直接腎素抑制劑(direct renin inhibitor，DRI)，主要通過抑制腎素的催化活性中心，從源頭上阻斷RAS的激活。因此，我們推測阿利吉侖能通過抑制TGF-β1/Smads通路發(fā)揮抗腎間質(zhì)纖維化作用。本研究擬構(gòu)建單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)大鼠模型，觀察阿利吉侖對腎間質(zhì)纖維化大鼠TGF-β1、Smad2、Smad7表達的影響，探討阿利吉侖抑制腎間質(zhì)纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4～6周齡清潔級健康雌性SD大鼠24只,體重220～250 g，購自南華大學(xué)試驗動物部。BCA蛋白定量試劑盒，TGF-β1，Smad2，Smad7及GAPDH 兔抗鼠多克隆抗體，SABC免疫組織化學(xué)試劑盒，DAB顯色劑，武漢博士德生物有限公司；PVDF膜，美國Pierce 公司；阿利吉侖，Novartis International AG，批號:0078-0486-15，規(guī)格:每片150 mg。

1.2 UUO模型建立及分組

24只大鼠隨機分為3組：假手術(shù)組(Sham組)、模型組(UUO組)、阿利吉倫治療組(aliskiren組)，每組8只。UUO組及aliskiren組行左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)，Sham組只分離左側(cè)輸尿管,不結(jié)扎。aliskiren組大鼠從建立UUO模型前1d開始灌胃給藥，阿利吉倫50 mg/( kg·d),每日1次，連續(xù)2周。Sham組、UUO組用等體積的生理鹽水灌胃。各組均于術(shù)后14天處死,留取左側(cè)腎標(biāo)本，部分用10%中性甲醛固定，行常規(guī)病理及免疫組化檢測，部分迅速保存于-80 ℃冰箱，備western blot檢測用。

1.3 腎組織病理學(xué)檢查

腎組織經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋、常規(guī)切片，厚度3 μm，行HE染色和Masson染色來評估腎小管間質(zhì)損傷程度。對每張切片隨機選擇20個腎皮質(zhì)視野,按文獻[3]描述的方法進行半定量評分，腎小管間質(zhì)病變按以下3個參數(shù)決定：蛋白管型和腎小管的擴張、壞死、萎縮；炎性細胞浸潤；間質(zhì)纖維化的程度。每個參數(shù)按0～3分評定(0=正常，1=輕度受損，2=中度受損，3=重度受損)。每個視野小管間質(zhì)的評分為0～9分。每張切片由兩位病理醫(yī)生雙盲法分別評分,取平均值。

1.4 免疫組織化學(xué)對TGF-β1，Smad2，Smad7的表達進行定位和半定量分析

采用SABC法，具體步驟參照SABC試劑盒說明。每張腎組織切片在400倍鏡下隨機選取5個面積相同的視野，攝取圖像，應(yīng)用Image-proplus圖像分析系統(tǒng)對TGF-β1，Smad2，Smad7的結(jié)果進行自動分析，計算平均光密度值。

1.5 Western印跡檢測TGF-β1，Smad2，Smad7的表達量

取-80 ℃保存的腎組織，加適量裂解液后勻漿，離心，取上清，BCA法測定蛋白濃度。取等量組織蛋白樣本經(jīng)10% SDS-PAGE膠電泳。濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加TGF-β1(1∶500)、Smad2(1∶500)、Smad7(1∶500)抗體，4 ℃孵育過夜。辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗工作液(1∶2 000)，室溫孵育2 h，膜發(fā)光底物工作液(ECL)A和B兩種試劑各取0.5 mL混合后顯色1 min，置入暗匣中拿到暗房，顯影1～5 min，定影1 min，沖洗，晾干，曝光，掃描蛋白條帶。以GAPDH為內(nèi)參照，采用Labwork4.0圖像分析軟件進行半定量分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析,計量資料以表示,多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。P<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 實驗動物數(shù)量分析

實驗共納入24只SD大鼠，分為3組，UUO組和aliskiren組各死亡1只，其余30只進入結(jié)果分析。

2.2 一般情況觀察

大鼠單側(cè)輸尿管切除后，UUO組和aliskiren組大鼠均有不同程度的精神萎靡、厭食、體重減輕、毛發(fā)雜亂等表現(xiàn)。aliskiren組的上述表現(xiàn)明顯輕于UUO組。Sham組大鼠活動自如，精神狀態(tài)、皮毛及食量均好，體重增加。

2.3 腎臟病理改變

光鏡下假手術(shù)組腎臟腎小管結(jié)構(gòu)正常，間質(zhì)未見增寬,無炎性細胞浸潤,小管基底膜光滑完整。模型組腎小管上皮細胞彌漫空泡變性，多數(shù)腎小管擴張、萎縮，多灶狀炎性細胞浸潤和腎間質(zhì)纖維化。aliskiren組間質(zhì)內(nèi)炎性細胞呈小灶狀浸潤，少許上皮細胞腫脹，少許腎小管輕度擴張，腎間質(zhì)未見明顯纖維化(見圖1A)。腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)半定量評分結(jié)果顯示：與sham組相比，UUO組和aliskiren組分值明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與UUO組相比,aliskiren組分值明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖1B。

圖1 各組大鼠腎組織病理改變 A：HE染色(100×)和Masson染色(400×)；B：腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)半定量評分. 與Sham組比較，*：P<0.05；與UUO組比較，#：P<0.05

2.4 免疫組織化學(xué)對TGF-β1，Smad2，Smad7的表達進行定位和半定量分析結(jié)果

用兔抗鼠TGF-β1，Smad2，Smad7多克隆抗體作一抗,生物素標(biāo)記的二抗對各組腎組織的TGF-β1，Smad2，Smad7蛋白表達進行檢測。免疫組化結(jié)果顯示，TGF-β1、Smad2和Smad7主要表達于皮髓交界的腎小管間質(zhì)區(qū)以及腎小管上皮細胞，腎小球中未見明顯表達(見圖2A)。半定量分析結(jié)果顯示：與Sham組相比，UUO組TGF-β1、Smad2表達明顯上升，而Smad7表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。與UUO組相比，aliskiren組TGF-β1、Smad2表達明顯下降，Smad7表達明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見圖2B。

2.5 TGF-β1，Smad2，Smad7的表達

用兔抗鼠TGF-β1，Smad2，Smad7多克隆抗體作一抗,GAPDH為內(nèi)參照,對各組腎組織的TGF-β1，Smad2，Smad7蛋白表達進行檢測，結(jié)果用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析得出TGF-β1，Smad2，Smad7蛋白表達的相對吸光度。Western印跡結(jié)果顯示：與Sham組相比，UUO組TGF-β1、Smad2表達明顯上升，而Smad7表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。與UUO組相比，aliskiren組TGF-β1、Smad2表達明顯下降，Smad7表達明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。各組TGF-β1、Smad2和Smad7蛋白表達趨勢改變與免疫組化結(jié)果相似，見圖3。

3 討 論

腎間質(zhì)纖維化關(guān)鍵的形態(tài)學(xué)改變是以ECM的過度沉積、成纖維細胞大量增生、小管萎縮及間質(zhì)炎性細胞浸潤為特征。其發(fā)生機制極其復(fù)雜，涉及多種細胞、細胞因子、細胞外間質(zhì)及多個信號傳導(dǎo)通路參與，受到多種因素的調(diào)節(jié)作用[4]。

轉(zhuǎn)化生長因子β1是最重要的致9纖維化細胞因子，能促進ECM產(chǎn)生，抑制ECM降解，并誘導(dǎo)上皮細胞生長停滯及凋亡。如圖2所示，TGF-β1廣泛分布于皮髓交界的腎小管間質(zhì)區(qū)以及腎小管上皮細胞，UUO組腎小管上皮及間質(zhì)細胞中TGF-β1分泌明顯活躍。Western blot結(jié)果進一步顯示，UUO組TGF-β1表達明星升高，提示TGF-β1在UUO所致慢性腎間質(zhì)纖維化的進程中具有重要的作用。

圖2 各組大鼠腎組織TGF-β1、Smad2、Smad7的表達 A：免疫組化染色(400×)；B：免疫組化半定量評分，與Sham組比較，*：P<0.05；與UUO組比較，#：P<0.05

圖3 各組大鼠腎組織TGF-β1、Smad2、Smad7的蛋白表達 與Sham組比較，*：P<0.05；與UUO組比較，#：P<0.05

TGF-β1主要通過Smad蛋白家族傳遞信號而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。TGF-β1/Smads通路是腎纖維化發(fā)生中最關(guān)鍵的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，也是器官纖維化發(fā)生中最重要的信號通路[5-6]。TGF-β1與Ⅱ型受體(TβRII)結(jié)合后，激活轉(zhuǎn)化生長因子-Ⅰ型β受體(TβRI)激酶，導(dǎo)致Smad2和Smad3蛋白磷酸化，隨后磷酸化Smad2和Smad3與Smad4結(jié)合，形成Smad2,3,4復(fù)合物，轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，包括Smad7。Smad7是抑制性Smad，Smad7與TβRⅠ蛋白結(jié)合，抑制活化的TβRⅠ對Smad2和Smad3的磷酸化[9]，增加泛素介導(dǎo)的TβRⅠ自身的降解[10]，從而阻抗TGF-β1的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制腎纖維化的發(fā)生及發(fā)展。

單側(cè)輸尿管梗阻是目前公認的導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化病理學(xué)改變的經(jīng)典模型，通過該模型可以有效地評價藥物對腎間質(zhì)纖維化的療效[9]。從模型組大鼠的腎臟病理變化和腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)半定量評分結(jié)果來看,我們成功地復(fù)制了單側(cè)輸尿管梗阻模型。

腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)(RAAS) 慢性持續(xù)激活是心血管疾病、腎臟病、糖尿病發(fā)生與發(fā)展的重要因素。RAAS中起主要作用的是血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)。既往研究表明，ACEI或ARB 阻斷RAAS會導(dǎo)致血漿腎素活性的代償性增加和AngⅠ的蓄積，反過來激活RAAS，出現(xiàn)“血管緊張素Ⅱ逃逸”現(xiàn)象[10]。

阿利吉侖是一種新型DRI，主要通過抑制腎素的催化活性中心從源頭上阻斷RAS的激活。使用DRI不會增加AngⅠ的濃度，故無“AngⅡ逃逸”現(xiàn)象。DRI和醛固酮受體拮抗劑的作用以及多類藥物聯(lián)合治療的效果雖越來越受到關(guān)注，但因臨床數(shù)據(jù)尚不充分，有待更多、更大規(guī)模的臨床試驗的觀察和證實。Feldman等[11]利用轉(zhuǎn)基因大鼠(mRen-2)-27研究了阿利吉侖對糖尿病大鼠的作用，結(jié)果顯示阿利吉侖不僅能夠防止大鼠產(chǎn)生蛋白尿，而且可以抑制腎臟的TGF-β1和Ⅰ型膠原的表達，減少腎小球、腎小管以及皮質(zhì)血管的腎素受體表達，從而產(chǎn)生腎臟保護作用。Kavvadas等[12]利用轉(zhuǎn)基因大鼠研究了阿利吉侖對高血壓腎病的作用，發(fā)現(xiàn)阿利吉侖不僅能降低血壓，而且能減輕腎間質(zhì)纖維化。為深入探討其治療作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，本實驗首先觀察該藥對大鼠單側(cè)輸尿管梗阻模型腎間質(zhì)纖維化的防治作用。用阿利吉侖灌胃后，大鼠的一般情況改善，腎纖維化程度也較模型組顯著減輕，提示阿利吉侖能有效防治腎纖維化。采用免疫組化和Western blot的方法檢測了各組大鼠腎組織TGF-β1/Smads通路中的幾個關(guān)鍵分子TGF-β1、Smad2和Smad7的蛋白表達水平。結(jié)果顯示：模型組的TGF-β1、Smad2表達較假手術(shù)組顯著升高，Smad7顯著降低。阿利吉侖能明顯下調(diào)TGF-β1、Smad2的表達，上調(diào)Smad7的表達，從而抑制TGF-β1/Smads信號通路,與國內(nèi)研究結(jié)果一致[13-15]。

總之，阿利吉侖可能通過下調(diào)TGF-β1、Smad2的表達，上調(diào)Smad7的表達從而抑制促纖維化信號通路TGF-β1/Smads激活，發(fā)揮其抗腎纖維化作用。

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EffectsofAliskirenonRatRenalInterstitialFibrosisTGF-β1/SmadSignalPathway

LI Jianzhi,YU Jiangdong,HU Li,et al

(NursingSchool,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan,421001)

ObjectiveTo investigate the mechanism of aliskiren on renal interstitial fibrosis in rats exerted unilateral ureteral obstruction.Methods24 female Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into 3 groups:Sham-operated group(Sham),UUO group (UUO) and aliskiren treated group(aliskiren).Except for Sham group,the UUO and aliskiren group underwent left ureteral ligation.Rats in aliskiren group were performed with intragastric administration of aliskiren (50mg/ kg·d) at 1 day before surgery,once per day and lasted for 2 weeks.All rats were sacrificed at 14 days after surgery.The pathological changes of the obstruction renal tissues were examined by HE and Masson staining.Immunohistochemistry and Western blot were applied to detect the protein expression of TGF-β1，Smad2 and Smad7.ResultsAliskiren could significantly reduce inflammatory cell infiltration,fibroplasia,the expansion and atrophy of the tubular.Compared with Sham group,the protein expression of TGF-β1 and Smad2 was increased significantly，but Smad7was decreased significantly in UUO group(allP<0.05).Compared with UUO group,the protein expression of TGF-β1 and Smad2 was decreased significantly,Smad7 was increased significantly in aliskiren group(allP<0.05).ConclusionAliskiren could relieve the renal interstitial fibrosis and fibrosis,and the mechanism of effects may be related to its down regulation TGF-β1，Smad2 and up regulation Smad7.

TGF-β1； Smad2； Smad7； Fibrosis； Aliskiren； Obstructive nephropathy

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.01.006

2014-07-28;

2014-10-22

衡陽市科學(xué)技術(shù)局(2013KS34).

*通訊作者，E-mail:nhliangyu@163.com.

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(此文編輯：秦旭平)