PF4通過NF-κB上調(diào)巨噬細(xì)胞MMP-9表達

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(1.南華大學(xué)心血管病研究所暨動脈硬化學(xué)湖南省重點實驗室，湖南 衡陽 421001；2.宜昌市中心人民醫(yī)院病理科)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

*并列第一作者，E-mail：hongapril@sina.com.

PF4通過NF-κB上調(diào)巨噬細(xì)胞MMP-9表達

趙戰(zhàn)芝1，何釩1,2*，唐雅玲1，孫慧1

(1.南華大學(xué)心血管病研究所暨動脈硬化學(xué)湖南省重點實驗室，湖南 衡陽 421001；2.宜昌市中心人民醫(yī)院病理科)

目的觀察血小板因子4(PF4)是否通過核因子κB (NF-κB)上調(diào)THP-1單核源性巨噬細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)表達。方法佛玻酯誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞分別在NF-κB抑制劑(PDTC)缺乏或存在情況下與溶媒或PF4(100 μg/L)孵育一定時間，RT-PCR檢測MMP-9 mRNA水平；同時，巨噬細(xì)胞與PF4(25～200 μg/L)單獨或結(jié)合Toll樣受體4(TLR4)阻斷劑(抗體 HTA125，anti-TLR4)孵育，ELISA法檢測NF-κB含量。結(jié)果PF4較對照組上調(diào)巨噬細(xì)胞MMP-9 mRNA水平。而NF-κB抑制劑抑制PF4誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞MMP-9表達上調(diào)。PF4呈濃度依賴性增加巨噬細(xì)胞的NF-κB含量，最大效應(yīng)濃度為100 μg/L。TLR4阻斷劑逆轉(zhuǎn)PF4誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞NF-κB含量增加。結(jié)論PF4可能通過NF-κB上調(diào)巨噬細(xì)胞MMP-9的表達。TLR4可能是PF4-NF-κB通路中NF-κB的上游信號分子。

血小板因子4； 基質(zhì)金屬蛋白酶9； 巨噬細(xì)胞； 核因子κB； 動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)是一種發(fā)生于大、中等動脈壁的慢性炎癥性病變。隨著As斑塊的形成或破裂，可引起靶器官缺血性疾病甚至急性臨床事件的發(fā)生。炎癥在As中起重要作用[1]。業(yè)已證明，血小板是炎癥和As的重要紐帶。活化的血小板通過釋放多種活性因子影響As發(fā)展[2]。其中，血小板因子4(platelet factor 4,PF4)的含量最豐富，且已證實可促進As形成[3]，但機制尚未闡明?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)做為炎性細(xì)胞因子在血管重構(gòu)、斑塊的不穩(wěn)定性及其破裂中起著重要作用[4]。核因子κB (nuclear factor kappa B,NF-κB) 是‘Rel’家族中的轉(zhuǎn)錄因子，活化后介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與As的發(fā)生發(fā)展，包括斑塊形成、斑塊不穩(wěn)定及斑塊破裂等過程[5]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)在天然免疫中可介導(dǎo)細(xì)胞跨膜信號傳導(dǎo)。文獻[6]報道，TLR4/NF-κB信號參與炎癥反應(yīng)。在高脂飼喂的動脈粥樣硬化兔模型，TLR4/NF-κB信號通路被激活，血清炎癥因子分泌增加。在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激的單核細(xì)胞，TLR4/NF-κB的活化誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6 和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)分泌[7]。在PF4處理的內(nèi)皮細(xì)胞，E-選擇素的表達有賴于NF-κB 的活化[8]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)PF4可上調(diào)巨噬細(xì)胞MMP-9表達，但機制尚未闡明[9]。因此，本研究探索TLR4和NF-κB是否參與PF4上調(diào)巨噬細(xì)胞MMP-9表達的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，旨在探討PF4對As斑塊穩(wěn)定性的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

重組人血小板因子4購自Peprotech公司，脂多糖購自上海捷瑞公司，胎牛血清購自杭州四季青生物研究所，RPMI1640培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司，佛波脂(PMA)和NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)購自Sigma公司，TLR4抗體型阻斷劑(單克隆抗體 HTA125，anti-TLR4)購自Biolegend公司，Trizol Reagent和引物分別從上海生物工程技術(shù)公司購買和合成，cDNA第一鏈合成試劑盒購自Fermentas公司，Taq PCR MasterMix以及DNA marker 購自北京天根公司，NF-κB ELISA試劑盒購自廣州齊特科生物公司。THP-1單核細(xì)胞系購自上海細(xì)胞庫。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

THP-1單核細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，靜置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗前，細(xì)胞用160 nmol/L PMA孵育24 h，使其誘導(dǎo)成為巨噬細(xì)胞。換無血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，同步化后進行實驗。為分析MMP-9表達，巨噬細(xì)胞在有或無NF-κB抑制劑PDTC(25 μg/mL)預(yù)處理30 min后，與溶媒(PBS)、PF4(100 μg/L)或LPS(陽性對照)孵育4 h；為檢測NF-κB含量，巨噬細(xì)胞與PF4(0～200 μg/L)孵育12 h，或TLR4阻斷劑HTA125 (25 μg/mL)預(yù)處理30 min后，再加入PF4繼續(xù)孵育12 h。

1.3 RT-PCR反應(yīng)

收集細(xì)胞，采用Trizol Reagent提取總RNA。每個樣本取0.2 μg總RNA按cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。用Taq PCR MasterMix試劑進行PCR循環(huán)：95 ℃溫育5 min，95℃變性45 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共32個循環(huán)，72 ℃，繼續(xù)延伸10 min，4 ℃冷卻。反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，UVP型凝膠圖像分析系統(tǒng)攝圖。MMP-9和GAPDH產(chǎn)物大小依次為476 bp和240 bp。以各組目的基因與GAPDH基因灰度值比值代表目的基因mRNA的相對量。每組實驗重復(fù)3次。

1.4 ELISA分析

按NF-κB ELISA試劑盒說明書進行。細(xì)胞處理好后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液于4 ℃ 1 000 r/min離心8 min，吸取上清液。酶標(biāo)板微孔中依次加入100 μL的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品。再于標(biāo)準(zhǔn)品和樣品孔中加入50 μL的酶標(biāo)記溶液；37 ℃孵育60 min；清洗后每孔加入底物A、B液，37 ℃避光反應(yīng)15 min；加入終止液終止反應(yīng)；于酶標(biāo)儀450 nm波長下讀取各孔的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算NF-κB的含量，結(jié)果以μg/L表示。每組實驗重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 PF4上調(diào)THP-1源性巨噬細(xì)胞MMP-9 mRNA水平

如圖1所示，靜止的THP-1源性巨噬細(xì)胞有低豐度的MMP-9 mRNA表達，經(jīng)PF4(100 μg/L)處理4 h后，巨噬細(xì)胞MMP-9 mRNA水平較對照組升高約1倍(P<0.001)。

圖1 PF4對巨噬細(xì)胞MMP-9 mRNA表達的影響(n=3) M：marker；1：對照組；2：PF4組. 與對照組比較，#：P<0.001

2.2 PF4升高THP-1源性巨噬細(xì)胞NF-κB的含量

為了探索PF4上調(diào)巨噬細(xì)胞MMP-9表達是否通過NF-κB信號環(huán)節(jié)，實驗采用ELISA法檢測PF4對THP-1源性巨噬細(xì)胞上清液中NF-κB含量的影響。結(jié)果顯示，與PBS對照組比，不同濃度PF4(25～200 μg/L)處理巨噬細(xì)胞12 h后，NF-κB含量均升高，尤其以PF4 100 μg/L時最為顯著，較對照組升高約78%(P<0.001，圖2)。TLR4激活因子LPS也升高巨噬細(xì)胞NF-κB含量，但其程度略低于100 μg/L PF4組。

圖2 不同濃度PF4對巨噬細(xì)胞NF-κB含量的影響(n=3)1：對照組；2：25 μg/L PF4組；3：50 μg/L PF4組；4：100 μg/L PF4組；5：200 μg/L PF4組；6：100 μg/L LPS組. 與對照組比較；*： P<0.05,**： P<0.01，#： P<0.001

2.3 NF-κB阻斷劑逆轉(zhuǎn)PF4誘導(dǎo)的THP-1源性巨噬細(xì)胞MMP-9 mRNA水平升高

為了證實NF-κB是PF4上調(diào)MMP-9 mRNA表達的信號環(huán)節(jié)，實驗采用NF-κB抑制劑預(yù)處理細(xì)胞后，觀察PF4對巨噬細(xì)胞MMP-9 mRNA水平的影響。結(jié)果顯示，NF-κB抑制劑PDTC和PF4處理細(xì)胞后，其MMP-9 mRNA水平較PF4單獨孵育組降低約19%(P<0.05，圖3)。與上述結(jié)果一致的是，LPS/NF-κB抑制劑處理組也較LPS單獨處理組明顯下調(diào)MMP-9 的mRNA表達(P<0.05)。但NF-κB抑制劑單獨孵育組對巨噬細(xì)胞MMP-9 mRNA表達無顯著影響(P>0.05)。上述結(jié)果提示NF-κB可能是PF4上調(diào)MMP-9 mRNA表達的重要信號分子。

圖3 25 μg/mL NF-κB抑制劑對100 μg/L PF4上調(diào)巨噬細(xì)胞MMP-9 mRNA表達的影響(n=3) M：marker；1：對照組；2：PF4組；3：PF4+NF-κ B組；4：100 μg/L LPS組；5： NF-κ B+LPS組；6：NF-κ B組. 與對照組比較，#：P<0.001,**：P<0.01，* ：P<0.05；與PF4組比較，△：P<0.05；與LPS組比較，▲： P<0.05

2.4 TLR4阻斷劑逆轉(zhuǎn)PF4誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞NF-κB含量增加

為了進一步探索NF-κB與PF4、TLR4之間的內(nèi)在關(guān)系，本實驗觀察了TLR4阻斷劑對PF4上調(diào)巨噬細(xì)胞NF-κB含量的影響。如圖4所示，經(jīng)PF4與TLR4阻斷劑處理后，巨噬細(xì)胞釋放的NF-κB含量顯著降低，較PF4單獨孵育組降低約11%(P<0.05)。與此同時，LPS誘導(dǎo)的NF-κB含量增加也被TLR4阻斷劑顯著抑制(P<0.05)。以上結(jié)果提示，TLR4可能是PF4-NF-κB通路中NF-κB的上游信號分子。

3 討 論

長期以來，血小板被認(rèn)為在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[2]。作為血小板活化的標(biāo)記物及活化后釋放的含量最豐富的活性因子之一，PF4已被證實不但存在于動脈粥樣硬化早、晚期病變，而且促進動脈粥樣硬化形成[10]。在 PF4-/-ApoE-/-小鼠，其主動脈根部和主動脈內(nèi)膜面的動脈粥樣硬化病變面積均較ApoE-/-小鼠顯著減小[3]。在單核細(xì)胞，PF4可誘導(dǎo)細(xì)胞存活、表達細(xì)胞因子、產(chǎn)生氧自由基和粘附于受損的內(nèi)皮[11]；誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞募集到病變并分化為巨噬細(xì)胞[10]；在巨噬細(xì)胞，PF4抑制CD163表達，誘導(dǎo)炎性巨噬細(xì)胞的形成[12]；抑制LDL-R降解、促進巨噬攝取和酯化ox-LDL[13]。本實驗表明，PF4上調(diào)巨噬細(xì)胞MMP-9 mRNA表達，其機制可能與NF-κB有關(guān)。結(jié)果顯示：①PF4增加巨噬細(xì)胞的MMP-9mRNA水平；②NF-κB抑制劑削弱PF4誘導(dǎo)的MMP-9mRNA表達上調(diào)；③PF4增加巨噬細(xì)胞上清液NF-κB的含量；④TLR4阻斷劑能顯著逆轉(zhuǎn)PF4誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞NF-κB含量增加。以上結(jié)果提示NF-κB是PF4上調(diào)巨噬細(xì)胞MMP-9表達的重要信號環(huán)節(jié)。

圖4 TLR4阻斷劑對PF4增加巨噬細(xì)胞NF-κB含量的影響(n=3) 1：對照組；2：PF4組；3：PF4+ TLR4阻斷劑組；4：100 μg/L LPS組；5：TLR4阻斷劑+LPS組；6：TLR4阻斷劑組. 與對照組比較，#：P<0.001,*：P<0.05；與PF4組比較，：P<0.05；與LPS組比較，：ζ：P<0.05

細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和脂質(zhì)在動脈內(nèi)膜的積聚導(dǎo)致動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一類可以降解和重組細(xì)胞外基質(zhì)的酶類，參與動脈粥樣硬化的病理生理過程。文獻報道，動脈粥樣硬化斑塊破裂和隨后的血栓栓塞與局部MMP-9的高表達和高活性相關(guān)；急性冠脈綜合征患者的冠狀動脈病變組織MMP-9表達和循環(huán)MMP-9水平均顯著高于穩(wěn)定心絞痛患者，且循環(huán)MMP-9水平與心血管風(fēng)險顯著相關(guān)；與此一致的還有，頸動脈疾病患者的循環(huán)MMP-9水平增高，他們的臨床事件率也增高[14-15]。在血管重構(gòu)期間，炎性細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞是血管組織MMP-9的重要資源。多種炎性因子如TNF-α和IL-17等可誘導(dǎo)MMP- 9表達和活化[16]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，25～200 μg/L的PF4均可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞MMP-9mRNA和蛋白表達上調(diào)，最大效應(yīng)濃度為100 μg/L，且未出現(xiàn)細(xì)胞毒性作用[9]。本實驗采用100 μg/L PF4處理巨噬細(xì)胞，可顯著上調(diào)巨噬細(xì)胞MMP-9 mRNA水平，與前期結(jié)果一致。表明PF4可能通過促進MMP-9的表達，使斑塊不穩(wěn)定。但尚需進一步的在體實驗以證實PF4是否上調(diào)動脈粥樣硬化斑塊MMP-9的表達。

NF-κB是一種具有多向轉(zhuǎn)錄功能的核轉(zhuǎn)錄因子，與許多免疫炎癥相關(guān)基因表達密切相關(guān)。在As病變內(nèi)，NF-κB主要存在于單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞?；罨埃?xì)胞質(zhì)中的NF-κB與其抑制蛋白I κB以二聚體形式結(jié)合呈無活性狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞因子、缺氧、病毒等一些因子的刺激時，IκB可磷酸化，后經(jīng)泛素化-蛋白酶小體途徑降解，使得NF-κB從IκB 復(fù)合物中釋放出來，并由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)入到細(xì)胞核，在此與NF-κB特異性結(jié)合位點結(jié)合，調(diào)控其靶基因轉(zhuǎn)錄[17]。業(yè)已證明，NF-κB對多種炎癥細(xì)胞因子、粘附分子、趨化因子和生長因子等的表達起著至關(guān)重要的調(diào)控作用，參與As炎癥過程中的多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[5]。本實驗結(jié)果顯示不僅PF4可升高巨噬細(xì)胞上清液中NF-κB的含量，而且NF-κB抑制劑可逆轉(zhuǎn)PF4對MMP-9的誘導(dǎo)表達。表明NF-κB參與了PF4誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞MMP-9表達的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。有研究報道，細(xì)胞膜上的TLR4被LPS激活后，使NF-кB從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，從而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[17]。本實驗發(fā)現(xiàn)TLR4阻斷劑能顯著降低PF4誘升的巨噬細(xì)胞NF-κB含量，前期研究還發(fā)現(xiàn)TLR4阻斷劑可逆轉(zhuǎn)PF4上調(diào)巨噬細(xì)胞MMP-9表達[9]。結(jié)合上述實驗結(jié)果表明，NF-κB是PF4- TLR4-通路的下游信號分子。

總之，現(xiàn)在的結(jié)果表明PF4通過增加巨噬細(xì)胞NF-κB的含量，從而促進MMP-9基因的轉(zhuǎn)錄。

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PlateletFactor4Up-regulatestheExpressionofMatrixMetalloproteinase-9inMacrophagesviaNF-κB

ZHAO Zhanzhi,HE Fan,TANG Yalin,et al

(InstituteofCardiovascularDisease,KeyLaboratoryforAtherosclerologyofHunanProvince,UniversityofSouthChina,Hengyang，Hunan421001,China)

ObjectiveTo investigate whether PF4 modulates the MMP-9 expression of macrophages via Nuclear factor kappa B(NF-κB).MethodsTHP-1 monocytes were differentiated into monocyte-derived macrophages by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA).Macrophages were incubated with PF4 (100 μg/L) in the absence or presence of NF-κB inhibitor pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC),the MMP-9 expression of macrophages was determined by Reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).Macrophages were incubated with PF4 (25-200 μg/L) or vehicle (PBS),NF-κB content in cultured supernatant of macrophages was measured by ELISA assay.To evaluate the intracellular signal transduction pathways,macrophages were pretreated for 30min with the TLR4 blocker(monoclonal antibody HTA125，anti-TLR4) before the addition of PF4,NF-κB content was measured.ResultsMacrophages that were untreated showed a relatively low MMP-9 mRNA level;treatment with PF4 increased MMP-9 expression.However,the high levels of MMP-9 expression induced by PF4 were significantly attenuated in the presence of NF-κB inhibitor.PF4 increased concentration of NF-κB in a dose dependent manner,with the strongest increase at 100ng/mL.The increased the concentration of NF-κB induced by PF4 was significantly reduced when treated with TLR4 blocker.ConclusionPF4 may up-regulate MMP-9 expression in macrophages via NF-κB.TLR4 may be upstream signaling molecules of NF-κB in PF4- NF-κB signaling pathway.

platelet factor 4; matrix metalloproteinase-9; macrophages; nuclear factor kappa B； atherosclerosis

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.01.003

2014-05-12；

2014-09-22

國家自然科學(xué)基金(81100214)，南華大學(xué)博士啟動基金(2012XQD40).

R363

A

(此文編輯：朱雯霞)