細(xì)菌sRNA與抗菌藥物的藥理作用及耐藥性

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(中南大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)系，湖南 長沙 410078)

·專家論壇·

細(xì)菌sRNA與抗菌藥物的藥理作用及耐藥性

張旺，李元建*

(中南大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)系，湖南 長沙 410078)

sRNA； 抗菌作用； 耐藥性

非編碼微小RNA即microRNA在細(xì)胞生長、增殖、分化、凋亡等生命過程中起重要的調(diào)控作用，幾乎參與所有疾病的病理生理過程，為近年研究的熱點課題。原核細(xì)胞也存在非編碼RNA，稱為小RNA(small non-coding RNA，sRNA)。sRNA作為一種應(yīng)答元件，通過與靶mRNA堿基互補(bǔ)配對抑制靶基因mRNA翻譯或(和)降解mRNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控細(xì)菌多種功能，影響細(xì)菌生長與繁殖[1,2]。雖然sRNA的發(fā)現(xiàn)(1967年)早于microRNA(1993年)，但其功能研究卻晚于后者。新近研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌sRNA與抗菌藥物的作用和耐藥性密切相關(guān)。

1 sRNA的生物學(xué)特性

sRNA是一類廣泛存在于原核生物，長度為50～300 nt的核苷酸。自1967年從大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)中分離出第一個sRNA(6SRNA)以來[3]，經(jīng)過半個世紀(jì)的研究，該細(xì)菌中已發(fā)現(xiàn)約100種sRNA[4]，隨后的研究證明其他細(xì)菌如沙門氏菌(salmonella)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，P.aeruginosa)、單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，L.monocytogenes)、幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)等同樣存在sRNA[5-11]。

細(xì)菌sRNA的編碼區(qū)主要位于基因間區(qū)(intergenic region，IGR)，某些位于編碼基因5′和3′非翻譯區(qū)(untranslated regions，UTR)[12]。根據(jù)sRNA的調(diào)節(jié)作用不同可將sRNA分為4類：調(diào)節(jié)蛋白活性sRNA，順式非編碼sRNA(cis-encoded sRNA)，反式非編碼sRNA(trans-coded sRNA)和規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs)[8,13,14]。目前研究較多的為順式非編碼sRNA和反式非編碼sRNA，其中順式非編碼sRNA由靶mRNA的反義鏈編碼，存在一段序列與靶mRNA完全互補(bǔ)配對(配對堿基通常大于75 nt)，具有高特異性、高親和力的特點，而反式非編碼sRNA其編碼基因與靶mRNA相距較遠(yuǎn)[10,13,14]。原核生物中的sRNA作用方式類似于真核生物microRNA，通過不完全互補(bǔ)配對降解mRNA或(和)抑制mRNA的翻譯[10,13,14]，從而參與調(diào)節(jié)細(xì)菌的生長、繁殖。然而，細(xì)菌sRNA的結(jié)構(gòu)、功能及作用機(jī)制與真核生物miRNA不完全相同(表1)。

表1真核生物miRNA與細(xì)菌sRNA的比較

真核生物microRNA細(xì)菌sRNA參考文獻(xiàn)長度19～25nt50～500nt來源多以莖環(huán)結(jié)構(gòu)存在于較長的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中,經(jīng)胞液中Dicer核酸酶剪切轉(zhuǎn)錄始于一段能折疊成穩(wěn)定莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列,終止于不依賴Rho的轉(zhuǎn)錄終止子15～18結(jié)構(gòu)前體莖環(huán)剪切加工而來具有穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu),不需要加工16,17,19分類順式非編碼RNA,反式非編碼RNA多為反式非編碼RNA,少數(shù)為順式非編碼RNA13,14作用機(jī)制形成核糖核蛋白體與靶mRNA配對,抑制mR-NA的翻譯,促進(jìn)降解Hfq協(xié)助下與靶mRNA配對,抑制mRNA的翻譯,促進(jìn)降解13～16,19,20生物學(xué)功能真核生物轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控,在細(xì)胞自身及細(xì)胞間發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,幾乎參與所有病理生理過程原核生物轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控,調(diào)節(jié)細(xì)菌多種生理過程及應(yīng)激反應(yīng)14,21～24

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌sRNA的主要生物學(xué)功能之一是感應(yīng)外界環(huán)境刺激，通過調(diào)控細(xì)胞代謝及應(yīng)激反應(yīng)以適應(yīng)環(huán)境變化。例如，鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii，A.baumannii)對溫度和滲透壓刺激的反應(yīng)可能受AbsR25調(diào)節(jié)[25]，而大腸桿菌對低溫(低于25℃)刺激的反應(yīng)則通過反式非編碼的sRNA DsrA所調(diào)節(jié)[26]；在ryhB基因敲除的傷寒沙門菌(Salmonella Typhimurium，S.Typhimurium)，H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激顯著增強(qiáng)，并證明OxyR能直接與ryhB相互作用，從而調(diào)節(jié)ryhB的表達(dá)[27]。有趣的是，sRNA還能參與抗菌藥物的作用，并與細(xì)菌的耐藥性密切相關(guān)，如阿奇霉素(2 μg/mL)能直接和間接抑制銅綠假單胞菌rsmY/Z的表達(dá)，阻斷細(xì)菌的群體感應(yīng)及生物被膜的形成[28]；鮑曼不動桿菌AbsR25能調(diào)節(jié)藥物外流蛋白編碼基因的表達(dá)[25]。

2 sRNA介導(dǎo)抗菌藥物的殺菌作用

抗菌藥物可特異性地干擾細(xì)菌的生長代謝過程(包括阻斷DNA復(fù)制和RNA合成，抑制蛋白合成與代謝酶活性)，破壞其結(jié)構(gòu)與功能，產(chǎn)生殺菌或抑菌效應(yīng)。基于sRNA對細(xì)菌生長與繁殖起重要的調(diào)控作用，人們推測sRNA可能是尋找抗菌藥物的新靶點。研究發(fā)現(xiàn)，洋蔥伯克霍爾德桿菌(Burkholderia cenocepacia，B.cenocepacia)sRNA mtvR過表達(dá)能顯著降低阿米卡星和慶大霉素的最小抑菌濃度(分別降低了7倍和4倍)以及顯著提高β-內(nèi)酰胺類抗生素(頭孢他啶和亞胺培南)的敏感性(分別提高了3倍和4倍)[29]。大腸桿菌sRNA ryhB能促進(jìn)CirA表達(dá)，后者與其配體大腸菌素Ia結(jié)合誘導(dǎo)靶細(xì)胞死亡；研究發(fā)現(xiàn)，ryhB及cirA缺失突變菌株，大腸菌素Ia處理誘導(dǎo)細(xì)菌死亡的作用被取消[30]。在金黃色葡萄球菌，sRNA SprX過表達(dá)顯著提高金黃色葡萄球菌對糖肽類抗生素的敏感性，其機(jī)制是通過L3環(huán)調(diào)節(jié)第V階段產(chǎn)孢蛋白G(stage V sporulation protein G，SpoVG)而發(fā)揮作用[31]。阿奇霉素(2 μg/mL)能直接和間接抑制銅綠假單胞菌rsmY/Z的表達(dá)，阻斷細(xì)菌的群體感應(yīng)及生物被膜的形成，可能是該藥的殺菌機(jī)制之一[29]。上述研究表明，某些抗菌藥物通過影響細(xì)菌sRNA的表達(dá)而調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，從而提高細(xì)菌對藥物的敏感性，發(fā)揮抗菌作用。sRNA介導(dǎo)抗菌藥物的作用加深了對某些藥物作用機(jī)制的認(rèn)識，并為尋找抗菌藥物提供新思路。例如，主要影響蛋白質(zhì)合成的阿奇霉素也能下調(diào)sRNA(RsmY/Z)的表達(dá)而損傷細(xì)胞膜的功能[29]。已知多種殺菌藥物(氨芐西林，卡那霉素，諾氟沙星及萬古霉素)殺菌機(jī)制涉及氧化應(yīng)激反應(yīng)[32]，但其確切機(jī)制尚未明了。鼠傷寒沙門菌(Salmonella enterica sv.Typhimurium)sRNA ryhB-1和ryhB-2缺失可導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平增加[27]。治療傷寒的氨芐西林等藥物誘導(dǎo)氧化應(yīng)激是否通過影響sRNA表達(dá)而發(fā)揮作用有待研究?？咕幬镆罁?jù)作用機(jī)制不同分為干擾細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，改變細(xì)胞膜通透性，抑制蛋白合成，影響核酸及葉酸代謝5大類，sRNA是否獨立于上述抗菌藥物的作用機(jī)制，以及與這些抗菌機(jī)制的關(guān)系值得研究。

許多抗菌藥物如抗生素為細(xì)菌的二級代謝產(chǎn)物，約2/3的天然抗生素從天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor，S.coelicolor)中獲得。另一方面，某些細(xì)菌的二級代謝產(chǎn)物能殺滅與其寄生于同一宿主的其他細(xì)菌，例如熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens，P.fluorescens)能分泌氰化氫、AprA外切蛋白酶和2,4-二乙?；g苯三酚，這些二級代謝產(chǎn)物能殺滅寄生于同一植物根際的真菌。sRNA能調(diào)控二級代謝產(chǎn)物的表達(dá)，可能是尋找抗菌藥物的新途徑。例如，在天藍(lán)色鏈霉菌過表達(dá)sRNA scr239和cnc2189.1可顯著減少二級代謝抗生素放線紫紅素的生成，而敲除菌株中生成則增加[33]。三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物能有效調(diào)節(jié)熒光假單胞菌GacS-GacA二元信號系統(tǒng)依賴的sRNA(RsmX、RsmY和RsmZ)，進(jìn)而調(diào)節(jié)二級代謝產(chǎn)物的生成和抗菌活性[34]。

3 sRNA與細(xì)菌耐藥性

無論是真核細(xì)胞還是原核細(xì)胞，對外界刺激產(chǎn)生適應(yīng)性變化是其固有特性，而sRNA在調(diào)節(jié)細(xì)菌適應(yīng)性中起重要作用。細(xì)菌耐藥性是細(xì)菌對抗菌藥物的自然反應(yīng)，長時間高濃度接觸抗菌藥物，細(xì)菌可通過改變自身結(jié)構(gòu)或狀態(tài)(改變藥物作用靶位結(jié)構(gòu)，影響生物被膜通透性及提高藥物轉(zhuǎn)運蛋白活性)產(chǎn)生獲得性耐藥。sRNA作為細(xì)菌廣泛存在的調(diào)節(jié)元件，調(diào)節(jié)細(xì)菌對抗生素的適應(yīng)性而介導(dǎo)細(xì)菌耐藥。Jing Y,等[6]首次報道了抗菌藥物對細(xì)菌sRNA表達(dá)的影響，基因芯片結(jié)果顯示，利奈唑胺等四種藥物處理多重耐藥金黃色葡萄球菌(Multidrug-Resistant Staphylococcus aureus，MRSA)后，39個sRNA表達(dá)變化顯著。其他學(xué)者也證明多種抗菌藥物的耐藥性與sRNA表達(dá)變化有關(guān)，如替加環(huán)素處理誘導(dǎo)傷寒沙門菌sRNA表達(dá)，其中sYJ20可能參與傷寒沙門菌對替加環(huán)素的耐藥[5]；生物信息學(xué)預(yù)測，鮑曼不動桿菌sRNA AbsR25的靶基因中有3個與藥物轉(zhuǎn)運相關(guān)[25]。在大腸桿菌中，sRNA ralR及其靶基因ralA雙缺失突變菌株對磷霉素的敏感性顯著高于野生型菌株[35]；兩性霉素B的耐藥涉及PhoP/PhoQ二元信號系統(tǒng)，后者通過sRNA mgrR負(fù)性調(diào)節(jié)耐藥相關(guān)基因eptB[36]；氨芐西林誘導(dǎo)sRNA sdsR的表達(dá)，后者與DNA錯配修復(fù)基因mutS堿基互補(bǔ)配對而抑制細(xì)菌的錯配修復(fù)，從而導(dǎo)致大腸桿菌耐藥[37]。然而，sRNA調(diào)控某些細(xì)菌耐藥的確切機(jī)制尚未完全闡明，且與已知的耐藥機(jī)制之間的關(guān)系也尚待研究。

4 結(jié) 語

新近研究表明細(xì)菌sRNA不但在細(xì)菌的生長、繁殖等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，也介導(dǎo)了抗菌藥物的殺菌作用，這為進(jìn)一步研究抗菌藥物的作用機(jī)制及尋找抗菌新藥提供了思路。另一方面，sRNA在細(xì)菌對外界適應(yīng)性變化中起重要調(diào)節(jié)作用，為闡明細(xì)菌耐藥性提供了新的解釋。然而，有關(guān)sRNA介導(dǎo)抗菌藥物的作用及耐藥性的研究目前仍處于起步階段，還有許多問題有待深入探討：① sRNA介導(dǎo)抗菌藥物的作用及細(xì)菌耐藥機(jī)制尚未完全闡明，包括sRNA的種類及其上、下游的調(diào)控機(jī)制；② sRNA的生物學(xué)效應(yīng)依賴于分子伴侶Hfq，sRNA與Hfq相互作用的認(rèn)識還有存在爭議，Hfq能促進(jìn)sRNA與靶mRNA的結(jié)合并形成穩(wěn)定sRNA-mRNA復(fù)合物，另有學(xué)者認(rèn)為，Hfq能與sRNA競爭結(jié)合靶mRNA而抑制靶mRNA的表達(dá)和翻譯[30]，闡明兩者相互作用有助于認(rèn)識sRNA的作用機(jī)制；③已知真核細(xì)胞能主動分泌miRNA，發(fā)揮臨近細(xì)胞與遠(yuǎn)程調(diào)節(jié)作用[22]。細(xì)菌也能分泌sRNA[38,39]，但分泌型sRNA的生物學(xué)意義尚不清楚。隨著研究的深入，對sRNA的生物學(xué)及藥理學(xué)的認(rèn)識必將獲得更大進(jìn)步。

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10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.01.001

2014-08-26；

2014-09-20

國家自然科學(xué)基金(81273513).

*通訊作者，E-mail：yuan_jianli@yahoo.com.

李元建 教授

專家簡介： 李元建，男，藥理學(xué)教授，博士生導(dǎo)師。享受政府特殊津貼，衛(wèi)生部有突出貢獻(xiàn)的中青年專家。兼任湖南省心血管研究重點實驗室主任。《國際病理科學(xué)與臨床雜志》主編，《中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志》、《中國動脈硬化雜志》、《中南大學(xué)學(xué)報—醫(yī)學(xué)版》等雜志編委。主編與參編教材或?qū)Ｖ?1部。先后獲衛(wèi)生部青年科研基金、美國心臟學(xué)會博士后資助、教育部優(yōu)秀年輕教師基金及重點跟蹤資助、教育部跨世紀(jì)優(yōu)秀人才培養(yǎng)計劃基金、教育部重大項目、國家自然科學(xué)基金面上與重點項目、973項目子課題、湖南省自然科學(xué)基金、湖南省重點實驗室基金等20余項基金?？蒲蟹较驗樾难芩幚恚饕芯績?nèi)容為心血管新藥研發(fā)及藥物作用機(jī)制。先后獲省部級科研成果16項。指導(dǎo)的研究生獲全國博士論文獎1人，全國優(yōu)秀博士論文提名獎5人。發(fā)表科研論文260余篇，其中被SCI收錄論文210篇。

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(此文編輯：秦旭平)