龍葵正丁醇提取物對(duì)Lewis肺癌移植瘤生長(zhǎng)的影響

金 旺，高聚偉，潘 磊，陳培豐

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江杭州310053； 2.浙江省中山醫(yī)院，浙江杭州310005；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江杭州310006）

龍葵正丁醇提取物對(duì)Lewis肺癌移植瘤生長(zhǎng)的影響

金 旺1，高聚偉2，潘 磊3，陳培豐3

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江杭州310053； 2.浙江省中山醫(yī)院，浙江杭州310005；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江杭州310006）

目的：觀察龍葵正丁醇提取物對(duì)Lewis肺癌移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用。方法：建立Lewis肺癌模型，將40只C57BL/ 6J荷瘤小鼠隨機(jī)分成荷瘤空白對(duì)照組、環(huán)磷酰胺組、龍葵正丁醇提取物高、中、低劑量組5組，每組8只。給藥15 d后處死小鼠，剝離腫瘤組織，稱重，計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率；解剖其胸腺、脾臟組織，稱重，計(jì)算胸腺和脾臟指數(shù)。結(jié)果：龍葵正丁醇提取物高、中、低劑量對(duì)Lewis肺癌移植瘤的抑瘤率分別為32.14%、13.93%和15.36%。龍葵正丁醇提取物高劑量組胸腺指數(shù)增長(zhǎng)率為134.31%，龍葵正丁醇提取物中劑量組脾指數(shù)增長(zhǎng)率為128.73%。結(jié)論：龍葵正丁醇提取物對(duì)Lewis肺癌移植瘤生長(zhǎng)具有一定程度的抑制作用，并能提高荷瘤小鼠胸腺和脾臟指數(shù)。

龍葵；正丁醇；抑瘤率；胸腺指數(shù)；脾臟指數(shù)

龍葵是茄科茄屬植物龍葵的全草，為一年至多年生草本植物。龍葵性寒、微甘，有小毒，有清熱解毒、活血利水、止咳祛痰等功效［1］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明其具有抗腫瘤、解熱鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等作用［2-3］。本實(shí)驗(yàn)建立在Lewis肺癌移植瘤模型的基礎(chǔ)上，觀察龍葵正丁醇提取物對(duì)荷瘤小鼠的一般狀態(tài)、體重、腫瘤生長(zhǎng)、胸腺和脾臟指數(shù)的影響，為其抗癌作用機(jī)制的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及瘤株 近交系C57BL/6J純系小鼠，上海斯萊克動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0003，在浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。Lewis肺癌細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 龍葵購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房，產(chǎn)地為浙江臨安，經(jīng)該院徐錫山主任藥師鑒定為茄科茄屬植物龍葵（Solanum nigrum L.）的干燥全草。參考文獻(xiàn)［4-5］方法稱取干燥的龍葵飲片5 kg，用8倍量的正丁醇80℃提取2 h，提取液除菌，100℃水浴箱濃縮得浸膏，即為龍葵正丁醇提取物，置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。注射用環(huán)磷酰胺（CTX）：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：1033021。生理鹽水（NS）：杭州民生藥業(yè)有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：312020910。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將接種Lewis肺癌14 d的C57BL/6J荷瘤小鼠，脫頸椎處死，無(wú)菌冰浴條件下剝離瘤組織，選取生長(zhǎng)良好的腫塊，去除壞死組織，按腫瘤（g）∶生理鹽水（mL）為1∶3比例用組織勻漿器制備瘤細(xì)胞懸液，200目網(wǎng)篩過(guò)濾，1 500 r/min，5 min，用PBS調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度約4×106/mL，作為制備小鼠Lewis肺癌模型的細(xì)胞懸液。建模前小鼠禁食不禁水12 h，75%酒精消毒小鼠右腋下皮膚3次，用l mL無(wú)菌注射器取細(xì)胞懸液0.2 mL（含8×105個(gè)活細(xì)胞），無(wú)菌條件下接種于小鼠左腋窩皮下，拔出針頭，用酒精棉球輕壓針眼處片刻，防止細(xì)胞懸液流出。接種瘤細(xì)胞后，送同動(dòng)物飼養(yǎng)室繼續(xù)飼養(yǎng)。接種24 h后，荷瘤小鼠用隨機(jī)化數(shù)字表法隨機(jī)分為荷瘤空白對(duì)照組、環(huán)磷酰胺組、龍葵正丁醇提取物高、中、低劑量組5組，每組8只。給藥劑量參照人鼠給藥劑量換算方法［6］計(jì)算。

其中dA、dB是A、B兩種動(dòng)物的每kg體質(zhì)量劑量（mg/kg）；RA、RB是動(dòng)物體型系數(shù)，人為100，小鼠為59；WA、WB是動(dòng)物的體質(zhì)量（kg）值。

分組后開(kāi)始給藥，每日1次，連續(xù)15 d。除環(huán)磷酰胺組外其余各組均按0.2 mL/10 g灌胃給藥，用藥劑量分別為：荷瘤空白對(duì)照組給予生理鹽水0.2 mL/ 10 g；龍葵正丁醇提取物高、中、低劑量組分別為160 mg/kg、80 mg/kg、40 mg/kg。環(huán)磷酰胺組予環(huán)磷酰胺注射液，按20 mg/kg劑量每次0.2 mL腹腔注射，接種第3天起給藥，每隔2 d給藥1次，共5次。停藥后24 h，稱體重，脫頸椎處死小鼠，放入超凈臺(tái)內(nèi)，固定于蠟版上。然后剖開(kāi)皮膚，完整剝離瘤塊，稱重。解剖其胸腺、脾臟組織，稱重。

1.3 指標(biāo)觀察

1.3.1 荷瘤小鼠生活狀況 每天記錄各組小鼠體重，觀察小鼠存活情況、精神狀態(tài)、皮毛色澤，并記錄。

1.3.2 抑瘤率 按瘤重計(jì)算腫瘤抑制率。

其中，y代表腫瘤抑制率，a代表空白對(duì)照組平均瘤質(zhì)量（g），代表給藥組平均瘤質(zhì)量（g）。

1.3.3 胸（脾）腺指數(shù) 依據(jù)下列公式計(jì)算小鼠胸腺、

脾指數(shù)。

其中，y代表胸腺（脾）指數(shù)，a代表胸腺（脾）質(zhì)量（mg），b代表小鼠體質(zhì)量（g）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）描述，兩組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)荷瘤小鼠生活狀況的影響

接種后1 d～7 d，各組荷瘤小鼠身形勻稱，皮毛光滑，反應(yīng)靈活，進(jìn)食進(jìn)水正常，組間差異不明顯。自第8天起，荷瘤空白對(duì)照組小鼠體形開(kāi)始消瘦，皮毛蓬松枯槁，活動(dòng)遲緩甚至蜷縮不動(dòng)。環(huán)磷酰胺組小鼠皮毛失去光澤，稀疏脫落，反應(yīng)遲鈍，行動(dòng)遲緩。龍葵正丁醇提取物各劑量組小鼠的反應(yīng)性也較遲鈍，體毛缺少光澤，少量脫落，但較荷瘤空白對(duì)照組和環(huán)磷酰胺組情況為好。在實(shí)驗(yàn)第13天，在實(shí)驗(yàn)條件均一，無(wú)人為操作失誤的情況下，荷瘤空白對(duì)照組有1只小鼠死亡，結(jié)合此小鼠腫瘤較大、形體消瘦、皮毛蓬松枯槁，考慮為腫瘤負(fù)荷過(guò)大致衰竭死亡，其余各組無(wú)死亡小鼠。

2.2 對(duì)荷瘤小鼠體質(zhì)量的影響

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，各組小鼠體質(zhì)量均有增加。15 d時(shí)，荷瘤空白對(duì)照組體質(zhì)量增加（1.36±0.3）g；龍葵正丁醇提取物中劑量組增加最多，為（2.75±0.39）g；環(huán)磷酰胺組增加不明顯，僅為（0.18±0.29）g。龍葵正丁醇提取物中劑量組、環(huán)磷酰胺組與荷瘤空白對(duì)照組體質(zhì)量增加值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。龍葵正丁醇提取物各治療組小鼠平均體重與環(huán)磷酰胺組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01，P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 龍葵正丁醇提取物對(duì)荷瘤小鼠體質(zhì)量的影響（x±s）

2.3 對(duì)荷瘤小鼠腫瘤質(zhì)量及抑瘤率的影響

與荷瘤空白對(duì)照組比較，龍葵正丁醇提取物各組小鼠的平均瘤重均有不同程度的降低（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4 對(duì)荷瘤小鼠胸腺和脾指數(shù)的影響

與荷瘤空白對(duì)照組比較，龍葵正丁醇提取物高、低劑量組胸腺指數(shù)均有提高，其中高劑量組與荷瘤空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），胸腺指數(shù)增長(zhǎng)率為134.31%。龍葵正丁醇提取物各劑量組脾指數(shù)均有提高，其中葵正丁醇提取物中劑量組與荷瘤空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），脾指數(shù)增長(zhǎng)率為128.73%。結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 龍葵正丁醇提取物對(duì)荷瘤小鼠腫瘤質(zhì)量的影響 （x±s）

表3 龍葵正丁醇提取物對(duì)荷瘤小鼠胸腺指數(shù)及脾指數(shù)的影響 （x±s）

3 討論

龍葵是臨床常用抗腫瘤中藥之一。呂苑忠等［7］用龍葵補(bǔ)腎合劑治療中晚期肝癌，顯示該合劑具有提高中、晚期肝癌患者生活質(zhì)量，減少并發(fā)癥和毒副作用的優(yōu)勢(shì)。黃東彬等［8］用龍葵合劑治療中晚期非小細(xì)胞肺癌，認(rèn)為龍葵合劑在扶正基礎(chǔ)上抑制腫瘤生長(zhǎng)，達(dá)到最小副作用基礎(chǔ)上的抗癌治療，符合“帶瘤生存”的理念。吳鋸凌等［9］用龍葵葶藶湯聯(lián)合DDP胸腔內(nèi)灌注治療肺癌，可顯著提高肺癌大量惡性胸腔積液的臨床療效，降低化療不良反應(yīng)發(fā)生率，提高患者機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。

在探討龍葵抗癌機(jī)理方面，常樂(lè)等［10］研究表明龍葵多糖能顯著抑制人胃癌MGC-803細(xì)胞的增殖，并具有時(shí)間及濃度依賴性，認(rèn)為龍葵多糖能阻止人胃癌細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，阻止細(xì)胞周期進(jìn)程。李志雄等［11］研究發(fā)現(xiàn)龍葵堿可以通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)前列腺癌Du145及LNCaP細(xì)胞凋亡的發(fā)生，能將兩種細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在S期，產(chǎn)生抑制細(xì)胞增殖的作用。陳培豐等［12］觀察到龍葵正丁醇萃取物對(duì)荷H22肝癌小鼠具有一定的腫瘤抑制作用，其機(jī)理可能與改善荷瘤機(jī)體細(xì)胞因子異常，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能有關(guān)。曲中原等［13］認(rèn)為龍葵堿抗腫瘤機(jī)制可能與其影響腫瘤細(xì)胞膜流動(dòng)性和封閉性以及膜蛋白、影響紅細(xì)胞免疫功能、抑制腫瘤新生血管生成、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡等有關(guān)。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用系統(tǒng)溶劑法對(duì)中藥龍葵進(jìn)行初步提取分離，觀察龍葵正丁醇提取物對(duì)lewis肺癌移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用。結(jié)果顯示龍葵正丁醇提取物灌胃治療后，荷瘤小鼠的生活狀況有不同程度的改善，體重質(zhì)量增加程度高于荷瘤空白對(duì)照組（P＜0.05）。并對(duì)荷瘤小鼠移植瘤的生長(zhǎng)有一定抑制作用，龍葵正丁醇提取物低、中、高劑量組抑瘤率分別為15.36%、13.93%、32.14%。

研究表明，T淋巴細(xì)胞在宿主對(duì)腫瘤組織的免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵的作用。胸腺和脾臟是T淋巴細(xì)胞成熟、增殖和分化的主要部位，其臟器指數(shù)是衡量機(jī)體免疫功能的初步指標(biāo)［14］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)龍葵正丁醇提取物具有一定的提高荷瘤小鼠胸腺和脾臟指數(shù)的作用，其作用存在一定劑量效應(yīng)關(guān)系，提示對(duì)這兩個(gè)免疫器官的保護(hù)作用也可能是其抗腫瘤的作用機(jī)制之一。

由此可知，龍葵正丁醇提取物有改善荷瘤小鼠一般狀況、增加體質(zhì)量、改善生存質(zhì)量的作用，并可在一定程度上抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)和保護(hù)胸腺和脾臟，其作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

［1］趙國(guó)平，戴慎，陳仁壽.中藥大辭典［M］.2版.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006：873.

［2］徐東花，于春月，韓成花.龍葵的化學(xué)成分及藥理作用研究［J］.黑龍江中醫(yī)藥，2007，36（2）：46-47.

［3］李紅念，梅全喜，張志群，等.龍葵的化學(xué)成分與藥理作用研究進(jìn)展［J］.今日藥學(xué)，2011，21（11）：713-715.

［4］盧艷花.中藥有效成分提取分離技術(shù)［M］.2版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2008：2-7.

［5］劉建文.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003：22-23.

［6］孫敬方.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：357.

［7］呂苑忠，孔慶志，熊振芳.龍葵補(bǔ)腎合劑治療中晚期肝癌臨床療效觀察［J］.湖北中醫(yī)雜志，2009，31（11）：7-8.

［8］黃東彬，管靜.龍葵合劑治療晚期非小細(xì)胞肺癌54例臨床觀察［J］.內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2013，32（16）：21-22.

［9］吳鋸凌，顧亮.龍葵葶藶湯治療肺癌大量惡性胸腔積液及對(duì)患者細(xì)胞免疫功能的影響［J］.中國(guó)中醫(yī)急癥，2014，23（2）：242-243.

［10］常樂(lè)，劉藝.龍葵多糖對(duì)人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的影響［J］.牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，33（4）：24-26.

［11］李志雄，梁蔚波，唐暉，等.龍葵堿對(duì)前列腺癌LNCaP及Du145細(xì)胞系的作用及機(jī)制［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2013，34（8）：1 153-1 156.

［12］陳培豐，潘磊，高聚偉，等.龍葵正丁醇萃取物對(duì)肝癌H22荷瘤小鼠的抑瘤作用及其免疫功能的影響［J］.中國(guó)中醫(yī)藥科技，2013，20（2）：141-142.

［13］曲中原，鄒翔，鄒曉祺，等.龍葵堿藥理作用研究進(jìn)展［J］.黑龍江醫(yī)藥，2014，27（4）：795-797.

［14］Lopez D M，Charyulu V，Adkins B.Influence of breast cancer on thymic function in mice［J］.J Mammary Gland Biol Neoplasia，2002，2（7）：191-199.

（編輯：翟春濤）

Effects of n-butanol extract from Solanum Nigrum L.on metastatic tumor growth

Jin Wang1，Gao Juwei2，Pan Lei3，Chen Peifeng3
（1.First Clinical Medical College to Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou Zhejiang 310053；2.Zhongshan Hospital of Zhejiang Province，Hangzhou Zhejiang 310005；3.First Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou Zhejiang 310006）

Objective：To observe the inhibiting effects of n-butanol extract from Solanum Nigrum L.on metastatic tumor growth in mice with lewis lung cancer.Methods：40 C57BL/6J mice set up Lewis Lung tumor model were randomly divided into tumor-burdened blank control group，cyclophosphamide group，n-butanol extract high，medium and low dosage group with 8 mice in each group.The mice were given drug respectively in 15 days and subsequently were killed.Tumor tissue were striped and weighed so as to calculate the tumor growth inhibition rate.Mice′s thymus and spleen were dissected and weighed so as to calculate index of thymus and spleen.Results：The inhibition rate of n-butanol extract high，medium and low dosage group were 32.14%，13.93%and 15.36%.The thymus index growth rate of n-butanol extract high dosage group was 134.31%；the spleen index growth of n-butanol extract medium dosage was 128.73%.Conclusion：The n-butanol extract from Solanum nigrum L.has certain inhibition effect on lewis lung cancer growth and the extract can increase mice′s thymus and spleen index.

Solanum nigrum L.；n-butanol；inhibition rate；thymus index；spleen index

R285.5

A

1671-0258（2015）01-0024-03

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（2009CA015）

金旺，在讀碩士，E-mail：592694497@qq.com

陳培豐，主任醫(yī)師，教授，E-mail：CPF12345@163.com