糠醛對粘紅酵母生長與油脂積累的影響

雍子涵，張栩，譚天偉

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糠醛對粘紅酵母生長與油脂積累的影響

雍子涵，張栩，譚天偉

北京化工大學生命科學與技術學院國家能源生物煉制研發(fā)中心，北京 100029

雍子涵, 張栩, 譚天偉. 糠醛對粘紅酵母生長與油脂積累的影響. 生物工程學報, 2015, 31(10): 1484–1491.Yong ZH, Zhang X, Tan TW. Effects of furfural on the growth and lipid production of oleaginous yeast Rhodotorula glutinis. Chin J Biotech, 2015, 31(10): 1484–1491.

為了探究纖維素水解液中常見的發(fā)酵抑制物糠醛對粘紅酵母生長與油脂積累的影響，對比了不同的糠醛濃度 (0.1、0.4、0.6、1.5 g/L) 下粘紅酵母的生物量和油脂積累情況，并探究了1.0 g/L的糠醛對粘紅酵母不同碳源 (葡萄糖和木糖) 利用的影響。研究表明，當糠醛濃度達1.5 g/L時，粘紅酵母的延遲期延長至96 h，殘?zhí)歉哌_17.7 g/L，生物量最高6.6 g/L，僅為正常積累量的47%，油脂含量也減少了約50%；以木糖為碳源時，糠醛對粘紅酵母的抑制程度小于葡萄糖為碳源時的情況；在糠醛存在的逆境中，粘紅酵母傾向于生成更多的18碳脂肪酸或18碳不飽和脂肪酸。

糠醛，粘紅酵母，葡萄糖，木糖，生物量，油脂

在面臨能源短缺與環(huán)境污染這兩個巨大挑戰(zhàn)的今天，生物質資源受到了國際社會的廣泛關注[1]。我國作為一個傳統(tǒng)的農業(yè)大國，纖維素原料非常豐富，僅小麥秸稈，每年產量就可達1.1億t[2]。纖維素水解液中含有豐富的可發(fā)酵性糖，尤其是葡萄糖和木糖，可用于微生物產油脂[3-4]。微生物油脂在脂肪酸組成上與植物油非常相似，是生產工業(yè)用油和生物柴油的潛在原料[5]。據文獻報道，粘紅酵母屬產油菌株中油脂含量較高的，其油脂含量可達72％[1,6]。

然而，纖維素原料在預處理過程中會產生以乙酸、糠醛、五羥甲基糠醛等為代表的多種發(fā)酵抑制物阻礙微生物的正常生長[7-10]。前期的研究多集中在以釀酒酵母為代表的多種脫毒方法和一些相關機理[11-14]，近年來也有學者探究了纖維素水解液培養(yǎng)發(fā)酵性絲孢酵母[15-18]、彎曲隱球菌[19]以及圓紅冬孢酵母[20]等產油酵母的情況，而關于纖維素水解液發(fā)酵抑制物糠醛對產油酵母粘紅酵母生長的影響則鮮見報道。

本文在此基礎上著重探究了纖維素水解液發(fā)酵抑制物之一糠醛對粘紅酵母生長和油脂積累的影響，以及對葡萄糖和木糖利用的影響，從而為優(yōu)化纖維素水解液培養(yǎng)基提供實驗支持，并為深入探究糠醛對產油微生物的抑制機理和基因改良抗性高產油脂酵母提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

本實驗所用菌種粘紅酵母(CGMCC No. 2258) 由北京化工大學、國家能源生物煉制研發(fā)中心保藏，系從中國食品發(fā)酵所購買的粘紅酵母菌株經過多次誘變 所得。

1.1.2 主要儀器

全波長酶標掃描儀 (Thermo Labsystems Multiskan Spectrum)、搖床、臺式離心機、高效液相色譜儀 (Thermo Fisher Sciencetific, Utimate 3 000, USA)、電子天平、電熱恒溫水浴鍋、烘箱、紫外超凈臺、pH計、自動蒸汽滅菌鍋、氣相色譜儀。

1.1.3 培養(yǎng)基

葡萄糖基礎培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖40，KH2PO47，Na2SO42，(NH4)2SO42，MgSO4·7H2O 1.5，酵母粉1.5。

木糖基礎培養(yǎng)基 (g/L)：木糖34，KH2PO47，Na2SO42，(NH4)2SO42，MgSO4·7H2O 1.5，酵母粉1.5。

混合糖基礎培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖20，木糖17，KH2PO47，Na2SO42，(NH4)2SO42，MgSO4·7H2O 1.5，酵母粉1.5。

根據實驗設置，在相應基礎培養(yǎng)基中添加糠醛至相應濃度。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

本實驗采用500 mL搖瓶，1/5裝液量，10%種子液接種量，搖床培養(yǎng)條件為200 r/min、30 ℃。

1.2.2 分析方法

采用高效液相色譜儀測定葡萄糖和木糖的條件為：Aminex HPX-87H柱 (300 mm′7.8 mm, Bio-Rad Corp., USA)，65 ℃示差檢測器，流動相為 0.005 mol/L H2SO4，流速為0.6 mL/min?？啡┑臏y定條件為：C18有機酸柱 (250 mm′4.6 mm, Thermo Fisher Corp., USA)，35 ℃，紫外檢測器，220 nm, 流動相為水與甲醇的混合液 (75∶25,/)，流速為0.5 mL/min。

生物量：將培養(yǎng)液稀釋一定濃度后，在波長為600 nm下測其吸光度，通過標準曲線計算其生物量。

油脂產量采用磷酸香草醛法測定，參照文獻[21]。

采用氯仿-甲醇法提取出油脂后 (參照文獻[22])，采用氣相測定油脂組分，參照文獻[23]。

2 結果與分析

2.1 不同的糠醛濃度對粘紅酵母生長與油脂積累的影響

添加了糠醛的培養(yǎng)基中粘紅酵母生長速率明顯下降，且糠醛濃度越高，抑制現象越明顯 (圖1A)。結合糖耗曲線與糠醛濃度變化曲線 (圖1B和圖1C)，可以發(fā)現，當糠醛濃度降為0時，粘紅酵母才開始大量利用葡萄糖快速生長。當初始糠醛濃度達到1.5 g/L時，粘紅酵母在96 h之后才開始大量生長，即對照組的酵母已經由對數期轉入穩(wěn)定期時，1.5 g/L糠醛處理的酵母才開始由延遲期進入對數期。從最大生物量積累來看，添加了糠醛的培養(yǎng)基中生物量最高僅8 g/L (糠醛濃度為0.1 g/L時)，約占正常培養(yǎng)基生物量 (14 g/L) 的57%。值得一提的是，不同糠醛濃度下，粘紅酵母最終的生物量積累幾乎相當。另外，在初始糠醛濃度為0.1 g/L的培養(yǎng)基中，前48 h的生物量積累情況與對照組不相上下。這說明，糠醛濃度越低，粘紅酵母的延遲期越短。0.1 g/L的糠醛前期對粘紅酵母的延遲期影響并不大，但其生長活力受到限制，主要表現為48 h 之后，生物量便不再積累，進入穩(wěn)定期，而對照中的生物量仍繼續(xù)增加。

就葡萄糖利用情況而言 (圖1B)，糠醛濃度越高，葡萄糖消耗速度越慢，而且所消耗糖量也越來越少。當糠醛濃度達到1.5 g/L時，直到第4天，粘紅酵母才開始大量利用葡萄糖，但持續(xù)時間僅48 h左右，發(fā)酵至216 h時殘?zhí)侨愿哌_17.7 g/L。

從糠醛濃度變化上看 (圖1C)，24 h之后，0.1 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L實驗組的糠醛濃度幾乎降為0，120 h之后，1.5 g/L實驗組的糠醛濃度也幾乎降為0。結合生物量積累 (圖1A) 和糖耗情況 (圖1B)，不難發(fā)現，培養(yǎng)基中粘紅酵母的生長速率和糖耗速率與糠醛的濃度變化密切相關。

從油脂產量和油脂含量來看，糠醛濃度越高，其對油脂合成的抑制程度越大 (圖1D和1E)。當糠醛濃度達1.5 g/L時，粘紅酵母油脂產量遠遠低于對照組中的油脂產量，而油脂含量與未添加糠醛的基礎培養(yǎng)基情況相比，降低了約50%。

綜上分析，糠醛對粘紅酵母在葡萄糖培養(yǎng)基中的生長和油脂積累均存在著明顯的抑制作用，并且抑制程度與糠醛濃度呈正相關?？啡舛冉禐?之后粘紅酵母才開始大量利用葡萄糖進行生長，但即使是0.1 g/L的初始糠醛濃度下，其殘?zhí)且哺哌_12.4 g/L。當糠醛濃度達 1.5 g/L時，粘紅酵母的延遲期延長至96 h，殘?zhí)歉哌_17.7 g/L，生物量積累最高6.6 g/L，僅為正常積累量的47%，油脂含量也減少了約50%，糠醛的抑制作用已經相當嚴重了。

2.2 糠醛對粘紅酵母不同單一碳源利用的影響

基于2.1的研究結果，選取1.0 g/L的糠醛濃度，探究了糠醛對粘紅酵母不同單一碳源利用的影響。從生物量積累來看 (圖2A)，發(fā)酵前24 h，添加糠醛的不同碳源培養(yǎng)基中，酵母幾乎都沒有生長，處于適應調整階段，24 h之后才開始大量生長，進入對數生長期，48 h后便進入穩(wěn)定生長期，并且持續(xù)相當長一段時間。整體比較，各培養(yǎng)基最大生物量表現為，對照組：葡萄糖(13.7 g/L) >混合糖(12.2 g/L) >木糖(11.6 g/L)，處理組：混合糖~葡萄糖(5.6 g/L) >木糖(4.8 g/L)。處理組中等比例混合碳源與單一葡萄糖 (六碳糖) 培養(yǎng)基中的粘紅酵母生長情況相當，這說明糠醛對木糖利用的抑制程度小于對葡萄糖利用的抑制程度。

從油脂積累來看 (圖2B)，對照組在穩(wěn)定期的中后期 (96?120 h)油脂逐漸達到最高值，而處理組在前24 h油脂幾乎沒有積累，這與其在此期間生物量沒有積累的情況相一致，24?48 h油脂逐漸積累到最大值，48 h之后油脂產量保持穩(wěn)定，這也與其在48 h之后生物量保持穩(wěn)定的情況相一致。總體比較，對照組培養(yǎng)基中的最大油脂積累情況為：葡萄糖(2.5 g/L) >混合糖(2.3 g/L) >木糖(1.5 g/L)，處理組培養(yǎng)基中的最大油脂積累情況為：混合糖(0.7 g/L) >葡萄糖 (0.45 g/L) >木糖(0.33 g/L)，這也在一定程度上說明了木糖為碳源時糠醛對粘紅酵母的抑制程度小于對葡萄糖為碳源時的抑制程度。

從葡萄糖消耗情況來看 (圖2C)，添加糠醛的葡萄糖培養(yǎng)基與混合糖培養(yǎng)基中，前24 h葡萄糖幾乎都沒有消耗，24 h之后才開始大量消耗，但是72 h之后葡萄糖濃度便幾乎不再變化，葡萄糖利用率僅為30%?35%。而對照組中，葡萄糖則表現為持續(xù)消耗，直至最終消耗完畢。

圖2D為木糖濃度的變化情況，對照組中，木糖培養(yǎng)基中的木糖濃度表現為持續(xù)下降，其中前72 h下降較快，72 h之后相對緩慢?；旌咸桥囵B(yǎng)基中木糖在前48 h幾乎不變化，72 h之后才開始大量消耗，這是因為混合糖培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度在72 h時已消耗完畢，在葡萄糖消耗完之后粘紅酵母才開始大量利用木糖。處理組中，木糖培養(yǎng)基中的木糖濃度在前24 h幾乎沒有變化，24 h之后才開始消耗木糖，但72 h之后便幾乎不再利用木糖，木糖濃度穩(wěn)定在 22 g/L左右，木糖利用率僅21%?31%?；旌咸桥囵B(yǎng)基中的木糖幾乎沒有消耗，這與葡萄糖沒有消耗完的情況相一致，因為在葡萄糖和木糖共同存在時，粘紅酵母在利用完葡萄糖之后才會開始大量利用木糖。

2.3 不同碳源下糠醛對粘紅酵母油脂主要組分的影響

由圖3可知，在不同碳源的培養(yǎng)基中，粘紅酵母所產的主要脂肪酸種類是一致的，分別為16碳的軟脂酸 (16∶0)和18碳的硬脂酸 (18∶0)、油酸 (18∶1)、亞油酸 (18∶2)，但相應的比例有所差別。

基礎培養(yǎng)基中，葡萄糖為碳源時粘紅酵母傾向于積累大量的油酸 (68%)，其次是軟脂酸 (16%)、亞油酸 (11%)和硬脂酸 (5%)。木糖為碳源時，粘紅酵母傾向于積累大量的硬脂酸 (44%)，其次是油酸 (34%)、亞油酸 (13%) 和軟脂酸 (8%)?；旌咸菫樘荚磿r，相應的油脂含量則介于二者之間。

添加糠醛后，葡萄糖為碳源時粘紅酵母傾向于生成更多的18碳脂肪酸 (其中油酸含量仍然是最高的)，16碳的軟脂酸含量有所下降 (約占11%)。木糖為碳源時情況則相反，其軟脂酸含量有所上升 (約占15%)，硬脂酸含量明顯下降 (約占25%)，其他的成分含量均上升了，其中油酸含量上升為最大 (約占41%)?；旌咸菫樘荚磿r，變化幅度介于二者之間，整體變化趨勢與葡萄糖為碳源時一致。

圖3 糠醛對不同碳源下粘紅酵母所產油脂的主要成分相對含量影響

總體而言，添加糠醛后，不同碳源的培養(yǎng)基中，粘紅酵母產生的主要脂肪酸不僅種類不變，相應的含量分配也趨于一致，由高到低分別為：油酸、硬脂酸、亞油酸、軟脂酸，18碳的脂肪酸占85%?92%，其中油酸的比重占41%?55%。這說明，在糠醛存在的逆境中，粘紅酵母傾向于生成更多的長鏈脂肪酸或長鏈不飽和脂肪酸以抵御逆境。這可能與糠醛的抑制機理相關，具體原因還有待進一步探究。

3 結論

綜上分析，糠醛明顯抑制粘紅酵母的生長和油脂積累，并且其抑制程度與糠醛濃度呈正相關。糠醛對粘紅酵母的抑制作用主要體現在延遲期的延長和對數生長期的縮短、生物量積累的減少、油脂積累的減少、糖利用能力下降等多方面。糠醛對葡萄糖利用的抑制程度大于對木糖利用的抑制程度。從油脂的主要成分與比例分配上來看，糠醛存在時，粘紅酵母傾向于生成更多的18碳長鏈脂肪酸或18碳長鏈不飽和脂肪酸以抵御逆境。關于糠醛對粘紅酵母的抑制機制還有待進一步探究。

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(本文責編 陳宏宇)

Effects of furfural on the growth and lipid production of oleaginous yeast

Zihan Yong, Xu Zhang, and Tianwei Tan

,,,100029,

In order to illustrate the effects of furfural, one of the most common inhibitory compounds in lignocellulosic hydrolysate, on oleaginous yeast, we investigated the effects of different concentrations of furfural (0.1, 0.4, 0.6 and 1.5 g/L) on the biomass and lipid production of, as well as the effects of 1.0 g/L furfural on the utilization of glucose and xylose. Results showed that: when the furfural concentration reached 1.5 g/L, the lag phrase time was extended to 96 h, and the residual glucose was up to 17.7 g/L, with maximum biomass of only 6.6 g/L, which accounted for 47% of that in the basic medium (furfural-free), and the corresponding lipid content was reduced about 50%. Furfural showed lighter inhibitory degree onwhen xylose acted as the carbon source than glucose was the carbon source; more C18 fatty acids or unsaturated C18 fatty acids were generated in the presence of furfural.

furfural,,glucose, xylose, biomass, lipid

10.13345/j.cjb.140555

November 17, 2014; Accepted:January 30, 2015

National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (Nos. 2013AA050702, 2012AA022304).

Xu Zhang. Tel: +86-10-64450593; Fax: +86-10-64416428; E-mail:zhangxu@mail.buct.edu.cn

國家高技術研究發(fā)展計劃 (863計劃) (Nos. 2013AA050702, 2012AA022304) 資助。

2015-03-20

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150320.1200.001.html