CD82介導(dǎo)的人類甲狀腺癌細(xì)胞株FTC-133的生物學(xué)特性

陳周潯，周宏眾，Henning Dralle，Cuong Hoang-Vu

（1．溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 胃腸外科，浙江 溫州 325015；2．德國Martin-Luther-University Halle-Wittenberg 普通、內(nèi)臟、血管外科中心外科，外科腫瘤與實驗研究組，德國 哈雷 06102）

·論 著·

CD82介導(dǎo)的人類甲狀腺癌細(xì)胞株FTC-133的生物學(xué)特性

陳周潯1，周宏眾1，Henning Dralle2，Cuong Hoang-Vu2

（1．溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 胃腸外科，浙江 溫州 325015；2．德國Martin-Luther-University Halle-Wittenberg 普通、內(nèi)臟、血管外科中心外科，外科腫瘤與實驗研究組，德國 哈雷 06102）

目的：探討腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子CD82在調(diào)控人甲狀腺癌細(xì)胞侵潤和遷移中的作用以及發(fā)揮作用的相關(guān)分子機制。方法：采用基因工程技術(shù)，將含CD82全長基因的pCDNA3.1質(zhì)粒用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染，構(gòu)建過表達CD82基因的FTC-133細(xì)胞株，并將其與野型FTC-133細(xì)胞株進行生物性狀比對。利用MTT法及Transwell細(xì)胞遷移實驗檢測CD82對FTC-133細(xì)胞侵潤和遷移能力的影響。結(jié)果：與野生型或者空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，各轉(zhuǎn)染細(xì)胞（clone 1、2、3）在轉(zhuǎn)染后24、48及72 h的增殖率減少（P＞0.05）；與野生型或者空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，各轉(zhuǎn)染細(xì)胞（clone 1、2、3）在轉(zhuǎn)染后24、48及72 h的遷移能力明顯減少（P＜0.05）。結(jié)論：CD82可以明顯降低FTC-133細(xì)胞的增殖及侵襲能力，與甲狀腺癌發(fā)展與進程密切相關(guān)。

腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子；CD82；侵潤；遷移；甲狀腺腫瘤；FTC-133

浙江省2007-2011年甲狀腺癌報告發(fā)病率為8.37/10萬；甲狀腺癌的病死率為0.34/10萬。溫州沿海地區(qū)是本病的高發(fā)區(qū)，2007-2011年甲狀腺癌發(fā)病率每年以29.95%的速度呈快速上升趨勢[1]。目前認(rèn)為，甲狀腺癌的發(fā)生是腫瘤性甲狀腺細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移進而引起具有不完全特性的連續(xù)基因序列異常的結(jié)果。盡管現(xiàn)在對甲狀腺腫瘤有大量新的認(rèn)識，甲狀腺癌的去分化線性模型仍未被完全識別。很多患者在診斷時，就被發(fā)現(xiàn)體內(nèi)癌細(xì)胞發(fā)生了局部轉(zhuǎn)移或者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，90%的轉(zhuǎn)移發(fā)生在術(shù)后5年內(nèi)并伴有不理想的預(yù)后。甲狀腺癌臨床早期診斷的方法十分有限，同時存在治療過度的現(xiàn)象，使得許多甲狀腺良性病變患者遭受不必要的手術(shù)創(chuàng)傷。因此，臨床上需要探索更為敏感可靠的診斷方法或腫瘤標(biāo)志物以便做出早期診斷。目前已知甲狀腺癌的特異蛋白相對較少，需要尋找更多與病變相關(guān)的特異蛋白質(zhì)，并探討其在甲狀腺癌中的作用及其機制。CD82在內(nèi)的TM4超家族由超過20余種依附在細(xì)胞表面的糖蛋白組成，其成員在細(xì)胞信號傳導(dǎo)、遷移、增殖以及在腫瘤轉(zhuǎn)移形成的過程中起到重要的作用。目前可確定CD82在許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中有重要作用，關(guān)于CD82在甲狀腺癌細(xì)胞中的意義及相關(guān)環(huán)節(jié)的調(diào)控因子及機制的研究，本研究組最早進行過詳細(xì)報道[2]，本研究意在通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染手段提高甲狀腺濾泡樣癌細(xì)胞FTC-133的內(nèi)源性CD82，將轉(zhuǎn)染細(xì)胞與野型細(xì)胞做全面生物學(xué)性狀比較，旨在調(diào)查CD82與甲狀腺癌去分化、侵襲及轉(zhuǎn)移潛力的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 基因重組及轉(zhuǎn)染 運用pCDNA3.1質(zhì)粒進行構(gòu)建帶人類全長CD82-cDNA序列的真核表達質(zhì)粒pcDNA-CD82。CD82完整cDNA編碼序列（引物序列Forward：5’-CCTGCTGCTGTGTGGACGA-3’，Reverse：5’-GCACTGGT TTCGTGGAAGGA-3’）在一種真核表達載體pCDNA3.1內(nèi)（Invitrogen公司提供）被亞克隆。脂質(zhì)體2000（由Invitrogen公司，加州，卡爾斯巴德），Genetecin （G418抗體，GIBCO/Invitrogen）用于轉(zhuǎn)染與篩選。Genetecin實驗3周后，獲得在6孔板中進行培養(yǎng)的存活細(xì)胞。挑取單個抗性細(xì)胞克隆在Geneticin （G418）下常規(guī)培養(yǎng)擴增，得到高表達CD82的甲狀腺癌細(xì)胞克隆。

1.2 Western blotting法 參照《分子克隆》中的實驗方法，以β-actin的水平作為等量蛋白質(zhì)樣本的內(nèi)對照，每個標(biāo)本至少重復(fù)3次進行SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，室溫封閉2 h后，用TBST緩沖液漂洗3次，再加入抗人抗體，4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液漂洗3次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，室溫?fù)u床孵育1 h，增強化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯色，暗室內(nèi)X線底片感光成像。

1.3 細(xì)胞增殖實驗（MTT） 收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100μL，鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度至1 000～10 000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。5% CO2，37 ℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），5% CO2以及37 ℃孵育16～48 h，倒置顯微鏡下觀察。每孔加入20μL MTT溶液（5 mg/mL， 即0.5% MTT），繼續(xù)培養(yǎng)。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖洗2～3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。每孔加入150μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD 490 nm處測量各孔的吸光值。設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜）和對照孔 （細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解遞質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）。

1.4 細(xì)胞遷移實驗 采用Corning公司8μm孔徑的聚碳酯膜Transwell小室（24孔板）。在Transwell小室的下室中預(yù)先加入600μL 20% FCS的1640培養(yǎng)基，37 ℃平衡1 h，將細(xì)胞用PBS洗3次。胰酶消化后重懸于含10%的DMEM Ham’s（1:1）培養(yǎng)基中，取1×106/mL細(xì)胞100μL加入至Transwell上室。分別在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。取出Transwell 小室，從上室用棉棒擦凈未穿透微孔濾膜的細(xì)胞。PBS沖洗后用4%甲醛固定，行Giemsa染色在200倍顯微鏡下計數(shù)濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)，隨機計數(shù)5個視野中的細(xì)胞數(shù)目，每個標(biāo)本重復(fù)3次。以遷移細(xì)胞的數(shù)目（取實驗平均值）來表示細(xì)胞的遷移能力。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。數(shù)據(jù)以±s表示，獨立樣本采用t檢驗，實驗組間比較采用單因素分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FTC-133穩(wěn)定轉(zhuǎn)染下的CD82過度表達 通過使用RT-PCR實驗、蛋白質(zhì)印跡實驗分析在細(xì)胞株FTC-133上的CD82轉(zhuǎn)染是否成功。篩選后3個月，我們分離了細(xì)胞內(nèi)的總mRNA并采用RT-PCR證實表達。如圖1中轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆1（clone1）、克隆2（clone2）、克隆3（clone3）所示，各克隆CD82 mRNA表達水平如圖2所示，結(jié)果證實：轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)CD82 mRNA （clone1、clone2、clone3）相比野生型FTC-133（WT）以及空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞（mock）表達明顯。轉(zhuǎn)染篩選后3個月，我們分離提純各細(xì)胞的蛋白，并實施蛋白質(zhì)印跡實驗，各克隆CD82蛋白質(zhì)表達水平如圖2所示，結(jié)果證實：轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)CD82（clone1、clone2、clone3）蛋白質(zhì)相比WT以及mock表達明顯。

圖1 各細(xì)胞株的CD82 RT-PCR轉(zhuǎn)錄結(jié)果

圖2 各細(xì)胞株的CD82蛋白質(zhì)印跡實驗

2.2 免疫熒光實驗 CD82蛋白在細(xì)胞內(nèi)外表達分布如圖3所示：在CD82轉(zhuǎn)染克隆FTC-133細(xì)胞的細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)，CD82的免疫熒光染色顯示為強反應(yīng)；野生型FTC-133的CD82免疫反應(yīng)呈弱陽性或者呈陰性。細(xì)胞間的緊密接觸處也正是CD82強表達位點（圖中白色箭頭所指）。

2.3 高表達的CD82對細(xì)胞增殖率的影響 MTT測試用于對比野生型FTC-133與CD82轉(zhuǎn)染FTC-133的增殖率。圖4所示為CD82轉(zhuǎn)染細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后的24、48、72 h與WT及mock進行對比監(jiān)控，可見各轉(zhuǎn)染克隆細(xì)胞增殖率減少，但此差異并無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 免疫熒光實驗觀察CD82蛋白在細(xì)胞內(nèi)外表達分布（×200）

圖4 MTT法測定各細(xì)胞的增殖率

2.4 高表達CD82明顯抑制細(xì)胞的侵潤和遷移能力 使用改良的Transwell小室法，來對比野生型FTC-133細(xì)胞與CD82轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞運動遷及侵襲能力。結(jié)果（見圖5）顯示，過表達CD82以后，轉(zhuǎn)染后的各時間點（24、48、72 h）的CD82高表達FTC-133細(xì)胞相比WT及moke的侵潤和遷移能力均明顯受到抑制，且各組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖5 Transwell法確定細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后24、48、72 h內(nèi)的遷移細(xì)胞數(shù)

3 討論

在以前的課題研究工作中，我們調(diào)查了CD82在甲狀腺組織中的表達并分析了腫瘤患者病程中的預(yù)后指標(biāo)意義及腫瘤轉(zhuǎn)移的趨勢。除了根據(jù)組織學(xué)和腫瘤發(fā)展階段所規(guī)定的腫瘤特性外，每位患者的完整病史也可以說明一些相關(guān)的預(yù)后指征。將表達的結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)處理和比較，并分析其變化與各項臨床病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系，結(jié)果顯示CD82在所有良性甲狀腺腫組織中均呈高表達狀態(tài)，而在無轉(zhuǎn)移性原發(fā)甲狀腺癌中只有部分呈高或中度表達（轉(zhuǎn)錄水平為66.7%；蛋白水平為58.0%），在轉(zhuǎn)移性原發(fā)癌組織中呈弱或無表達。CD82的表達與腫瘤區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M），以及與分化型甲狀腺癌（FTC、PTC）腫瘤分期呈密切相關(guān)，且差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.001）。而與患者年齡、性別、癌腫大小（T）則無顯著相關(guān)性[2]?；诖私Y(jié)果，我們想進一步在細(xì)胞模型中對CD82進行功能研究。

CD82也可稱為KA11，IA4，C33或者R2，位于人類染色體11p11.2[3]。CD82是種糖基質(zhì)，屬于I I I型跨膜蛋白，并含有2種不同的細(xì)胞外環(huán)，較大的循環(huán)包含3種N-糖基化位點。N-和C-Terminus定位于細(xì)胞質(zhì)中[4]。CD82在細(xì)胞膜上的結(jié)構(gòu)與特殊位置使其在細(xì)胞信號傳導(dǎo)方面的作用非常關(guān)鍵，并可能調(diào)控細(xì)胞的生長、分化、細(xì)胞間黏合及運動[5-7]。CD82可與很多細(xì)胞膜表面分子結(jié)合，如TM4的其他成員、黏合素因子以及部分在細(xì)胞外基質(zhì)黏合過程中充當(dāng)重要成分的人類淋巴細(xì)胞抗原成分[8-9]。CD82可以與整合素和其他的家族成員相互作用調(diào)控細(xì)胞間的黏附與轉(zhuǎn)導(dǎo)。它們形成的復(fù)合物可以介導(dǎo)細(xì)胞間的信號通路廣泛的調(diào)控細(xì)胞的增殖、激活和運動[10-13]。 按黏附分子的結(jié)構(gòu)特點可將其分為以下4類：①黏合素家族的黏附分子；②免疫球蛋白超家族的黏附 分子；③凝集素家族；④鈣離子依賴的細(xì)胞黏附素 家族的黏附分子，或稱Cadherin。TM4與黏合素家族成員之間的相互作用非常密切[14-15]。黏合素是一種黏合蛋白，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞基質(zhì)之間、細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用。依賴于黏合素的細(xì)胞間的相互黏合是基于細(xì)胞信號傳導(dǎo)和細(xì)胞骨架重組的整合。PKC-TM4SF黏合素結(jié)構(gòu)有可能指示一種新型的信號復(fù)合體的產(chǎn)生。在耦合分子TM4SF蛋白質(zhì)影響下，PKC與特定的黏合素相互綁定。這種綁定很可能發(fā)生于TM4SF蛋白質(zhì)的大環(huán)狀結(jié)構(gòu)功能區(qū)與黏合素的“跟蹤區(qū)”之間，而PKC則與存在于細(xì)胞等離子一區(qū)和二區(qū)之間的TM4SF蛋白質(zhì)，或者細(xì)胞等離子端的TM4SF蛋白質(zhì)綁定。這就是說，黏合素的黏合功能是受TM4SF蛋白質(zhì)調(diào)控，而且黏合素與TM4SF的綁定也由于這種交叉作用在細(xì)胞表面趨于穩(wěn)定[3，16]。另有報道稱這種新型的信號復(fù)合體存在于正常細(xì)胞中，在腫瘤組織中無法被檢測出來。黏合素包含了細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)，黏著斑激素酶（FAK）的絡(luò)氨酸磷酸化并參與了對鈣陽離子的調(diào)控[17]?；谀壳皩M4SF與黏合素相互作用的研究，TM4SF蛋白質(zhì)在FAK絡(luò)氨酸磷酸化過程中，在調(diào)節(jié)細(xì)胞以及重組細(xì)胞骨架內(nèi)的肌動蛋白（也包括轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移）的過程中起到?jīng)Q定性作用[18]。通過體外構(gòu)建外植體培養(yǎng)模型，我們的結(jié)果進一步證實了調(diào)高內(nèi)源性CD82將會顯著地抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖與遷移能力，在免疫熒光實驗中我們可以清楚看到CD82在胞漿及胞外基質(zhì)的分布情況，其黏附能力抑或與胞外基質(zhì)中的各種黏附因子，如黏合素以及金屬蛋白酶等分子有關(guān)。CD82在細(xì)胞侵潤的下游信號和機制應(yīng)該和MMPs的表達相關(guān)[19-20]，MMPs在降解細(xì)胞外基質(zhì)促進細(xì)胞運動中發(fā)揮重要作用。在MMP家族的眾多成員中，MMP-2和MMP-9在細(xì)胞侵潤過程中是被研究最多且發(fā)揮最大作用的因子。有報道稱MMP-9活性受到抑制是通過TIMP-1的表達上調(diào)造成的，而且這一過程抑制了腫瘤的侵潤[21]。綜合本研究結(jié)果，我們認(rèn)為檢測CD82可作為甲狀腺癌轉(zhuǎn)移潛能的指標(biāo)，是其惡性轉(zhuǎn)變的重要促進因素，從而進一步證實CD82在甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究組預(yù)備下一步運用蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，利用各種功能蛋白質(zhì)的分子量及等電點差異，分離純化、分析目標(biāo)蛋白質(zhì)，篩選、分離、鑒定，從蛋白質(zhì)功能層面調(diào)查受CD82影響的各主要相關(guān)功能因子。

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（本文編輯：胡苗苗）

The analysis of biological characristics of CD82 mediated human thyroid carcinoma FTC-133 cells

CHEN Zhouxun1,ZHOU Hongzhong1,Henning Dralle2,Cuong Hoang-Vu2.
1.Department of Gastrointestinal Surgery,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325015; 2.Research Group of Experimental and Surgical Oncology,Department of General,Visceral and Vascular Surgery,Martin Luther University Halle-Wittenberg,D-06097 Halle,Germany,06102

Objective:To study the role of tumor suppressor gene CD82 in the regulation of thyroid carcinoma cell invasion/migration and its related molecular mechanisms.Methods:By using genetic engineering technology,the plasmid pCDNA3.1,which reconsturcted with the full length CD82 gene,was transfected into the thyroid carcinoma FTC-133 cells.By MTT and Transwell Assays,the proliferation rate and migration ability of these high expressed CD82 FTC-133 cells were compared with the wild-type cells FTC-133 cells.Results:24,48,72 hours after transfection,the transfected cells showed reduced proliferation rate (P＞0.05) and significant lower migration ability (P＜0.05) in comparison with the wild-type cells and mock cells (trasfected with empty plasmid).Conclusion:These results illustrate that CD82 can reduce FTC-133 cell proliferation and invasiveness,CD82 is closely related to development and progression of thyroid carcinoma.

tumor suppressor gene; CD82; invasiveness; migration; thyroid carcinoma; FTC-133

R135.1

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.05.007

2015-02-06

溫州市科技局科研基金資助項目（2014Y0195）。

陳周?。?974-），男，浙江溫州人，主治醫(yī)師，博士后。