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    四川省引進(jìn)外種豬群體的ESR基因PvuⅡ位點(diǎn)多態(tài)性分析

    2015-12-27 12:25:38張培文巫小倩張順華
    豬業(yè)科學(xué) 2015年3期
    關(guān)鍵詞:約克夏長白豬杜洛克

    張培文,趙 雪,何 玲,巫小倩,張順華,朱 礪

    (四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,四川雅安 625014)

    四川省引進(jìn)外種豬群體的ESR基因PvuⅡ位點(diǎn)多態(tài)性分析

    張培文,趙 雪,何 玲,巫小倩,張順華,朱 礪*1

    (四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,四川雅安 625014)

    采用PCR-RFLPs方法,對(duì)四川引進(jìn)外種豬(杜洛克、長白豬和約克夏)ESR基因的多態(tài)性進(jìn)行研究。并對(duì)ESR基因的基因頻率和基因型頻率進(jìn)行分析,結(jié)果表明:杜洛克出現(xiàn)了AA、AB、BB3種基因型,基因型頻率分別為76.32%、18.42%和5.26%,A、B基因頻率分別為85.53%和14.47%;長白豬中僅出現(xiàn)AA和AB2種基因型,且基因型頻率分別為67.74%和32.26%,其中,等位基因A、B頻率分別為83.87%和16.13%;在約克夏中存在AA、AB、BB3種基因型,頻率分別為22.22%、61.90%和15.87%,等位基因A與等位基因B頻率相當(dāng),分別為53.18%和46.82%。

    杜洛克;長白豬;約克夏;ESR基因;PCR-RFLP

    0 引言

    豬是世界上最重要的肉用動(dòng)物之一,而中國既是養(yǎng)豬大國,也是豬肉消費(fèi)大國。但在我國養(yǎng)豬業(yè)中,處于繁育體系“金字塔”頂端的核心種質(zhì)群一直處于較為薄弱的狀態(tài),對(duì)引種的依賴性較強(qiáng)。為了擺脫“引種-退化-再引種”的不良循環(huán),我們應(yīng)加強(qiáng)對(duì)引進(jìn)種豬的再一次選育[1]。

    豬的產(chǎn)仔數(shù)是極其重要的經(jīng)濟(jì)性狀,提高母豬產(chǎn)仔數(shù)可增加商品肉豬的產(chǎn)量,給現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)帶來非常大的經(jīng)濟(jì)效益。目前,關(guān)于豬產(chǎn)仔數(shù)的研究中,報(bào)道了大量的主基因,如雌激素受體(ESR)基因、催乳素受體(PRLR)基因、卵泡促激素β亞基(FSHβ)基因、備解素(OPN)基因等。ESR基因是影響繁殖性能的重要功能基因,且該基因在國內(nèi)外被廣泛研究,并運(yùn)用于后備種豬的標(biāo)記輔助選擇(MAS)[2-4]。

    1994年, 美 國Iowa大 學(xué) 的Rothschild等[5-7]發(fā)現(xiàn)了豬雌激素受體基因(Estrogen receptor gene, ESR),并確定其是產(chǎn)仔數(shù)性狀的主效基因或者是與產(chǎn)仔數(shù)主效基因緊密連鎖的基因,并且找到了將ESR基因酶切為AA、AB、BB3種基因型的多態(tài)性位點(diǎn)PvuⅡ,研究發(fā)現(xiàn),BB為優(yōu)勢基因型,且不同基因型的繁殖性能表現(xiàn)為BB>AB>AA的趨勢;等位基因B為優(yōu)勢基因。在此之后,大量的對(duì)不同豬種的研究得出了相同結(jié)論,盡管所研究的這些豬種存在著不同的遺傳背景[8-9]。本次試驗(yàn)以319頭種豬(包括杜洛克38頭、長白豬155頭,約克夏126頭)的耳組織為樣本,提取耳組織中的DNA,采用PCR-RFLP分型技術(shù)對(duì)ESR基因進(jìn)行檢測,從而分析引進(jìn)種豬的ESR基因分布情況。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    試驗(yàn)材料來自四川某豬育種公司核心育種場新引進(jìn)的種豬耳組織樣品(包括杜洛克38頭、長白豬155頭、約克夏126頭)。-20 ℃下75%酒精保存,用于基因組DNA制備。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 DNA提取

    取火柴頭大小的豬耳組織樣品,放于75%的酒精中洗凈,在1.5 mL的離心管中剪碎,利用TIANGEN DNA提取試劑盒提取DNA,按照試劑盒步驟操作。獲取的DNA樣品放置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)

    引物合成。PCR引物序列參照文獻(xiàn)[7],引物由華大基因合成:

    Forward primer:5’-CCTGTTT TTACAGTGACTTTTACAGAG-3’

    Reverse primer:5’-CACTTCGA GGGTCAGTCCAATTAG -3’

    ESR基因的擴(kuò)增,擴(kuò)增反應(yīng)總體積為25μL,其中TIANGEN 2×PreMasterMix 12.5μL;上游引物1μL;下游引物1μL;DNA模板2μL;DEPC水8.5μL。ESR基 因反應(yīng)條件:第1步94℃預(yù)變性3min,第2步94℃變性30 s,第3步退火60 ℃ 30 s,第4步72 ℃延伸5 min,重復(fù)第2步到第4步35個(gè)循環(huán),最后再72℃延伸5 min,于12 ℃保存。PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,紫外檢測儀檢測照相并分析。

    1.2.3 PvuⅡ酶切與電泳檢測

    利用PvuⅡ酶對(duì)反應(yīng)所得120bpESR基因進(jìn)行酶切,整個(gè)反應(yīng)體系為15μL,包括酶切反應(yīng)緩沖液buffer1.5μL;擴(kuò)增產(chǎn)物溶液10μL;限制性內(nèi)切酶PvuⅡ0.5μL;加DEPC水至15.0μL。將混合液于37℃條件下水浴過夜(8 h以上)。將酶切后產(chǎn)物利用3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,紫外燈檢測儀檢測照相并分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 ESR的PCR擴(kuò)增

    抽取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因的目的片段,所得片段大小120 bp(圖1)。圖譜上觀測無彌散和拖尾現(xiàn)象,表明擴(kuò)增目的條帶效果良好,與期望結(jié)果一致。

    2.2 ESR基因的酶切電泳分析

    通過限制性內(nèi)切酶PvuⅡ酶切,可能出現(xiàn)3種結(jié)果,分別為AA(120bp/120bp)、AB基 因 型(120bp/65bp、55bp)和BB基因型( 65bp、55bp/65bp、55bp)。本試驗(yàn)中,杜洛克(見圖2)、約克夏(見圖4)均出現(xiàn)了AA、AB、BB 3種基因型、而長白豬(見圖3)僅出現(xiàn)了AA、AB 2種基因型。(本次試驗(yàn)中,由于所用瓊脂糖濃度較低,且電泳時(shí)間較短,導(dǎo)致55bp與65bp片段未分開)

    2.3 ESR基因的群體遺傳特性分析

    對(duì)杜洛克、長白豬、約克夏種豬的ESR基因利用PCR-RFLP技術(shù)進(jìn)行基因分型,根據(jù)文獻(xiàn)中基因分型的判定標(biāo)準(zhǔn)[6],3個(gè)豬種ESR基因的基因型分布以及群體遺傳特性分析結(jié)果見表1??倶颖竞?19頭,包括杜洛克38頭、長白豬155頭,約克夏126頭。

    圖1 ESR基因PCR產(chǎn)物電泳的結(jié)果

    圖2 杜洛克ESR基因PCR-RFLPs 3%瓊脂糖凝膠電泳

    圖3 長白豬ESR基因PCR-RFLPs 3%瓊脂糖凝膠電泳

    圖4 約克夏ESR基因PCR-RFLPs 3%瓊脂糖凝膠電泳

    由表1可知,杜洛克出現(xiàn)3種基因型,其中AA基因型頻率最高,為76.32%,其次為AB型,基因型頻率為18.42%,BB基因型僅為5.26%;且其A等位基因頻率高達(dá)85.53%。長白豬中,僅出現(xiàn)AA和AB 2種基因型,且AA基因型頻率為67.74%,AB基因型為32.26%;其中等位基因A的頻率為83.87%,等位基因B的頻率為16.13%。在約克夏中,基因型頻率最高的為AB基因型,頻率為61.90%,緊接著為AA基因型,為22.22%,最低的為BB基因型,頻率為15.87%,在約克夏中,等位基因A與等位基因B頻率相當(dāng),分別為53.18%和46.82%。

    表1 ESR基因的基因頻率和基因型頻率的分布

    3 討論

    本次試驗(yàn)所測得杜洛克等位基因B的頻率為14.47%,比田勇等[10]研究的47.06%低,而李鳳娥等[11]2000年試驗(yàn)得出杜洛克B基因的頻率為0。在對(duì)長白豬的研究中,本次試驗(yàn)所得B基因頻率為16.13%,之前有大量關(guān)于長白豬的研究中分別得出其等位基因B頻率為7.69%、19%、10%等[12]。對(duì)約克夏的研究中,張淑君等[13]報(bào)道了其B基因頻率為47.06%,后來田勇等[10]研究得出了相同結(jié)果,而本試驗(yàn)中,所得B等位基因頻率為46.82%,比前人研究略低。導(dǎo)致這種結(jié)果的原因可能是試驗(yàn)豬群以及樣本大小存在差異等。

    ESR基因是影響豬繁殖性能的主效基因,是目前為止選擇產(chǎn)仔數(shù)最好的標(biāo)記。據(jù)前人研究得出豬產(chǎn)仔數(shù)與ESR基因型之間有BB>AB>AA的趨勢[5-7]。劉建華等[14]對(duì)杜洛克、長白豬和約克夏ESR基因進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)ESR基因?qū)ωi頭胎產(chǎn)仔數(shù)有顯著影響,BB和AA純合子頭胎總產(chǎn)仔數(shù)與活產(chǎn)仔數(shù)分別相差3.361和1.1913,每個(gè)等位基因B的加性效應(yīng)分別是1.680和0.597。田勇等[10]研究發(fā)現(xiàn),在杜洛克中,初產(chǎn)胎次B基因的加性效應(yīng)為3.56和2.10,在經(jīng)產(chǎn)胎次中B基因的加性效應(yīng)為1.90和1.38;在長白豬中,初產(chǎn)胎次B基因的加性效應(yīng)為2.70和1.25,在經(jīng)產(chǎn)胎次中B基因的加性效應(yīng)為1.62和2.24;在杜洛克中,初產(chǎn)胎次B基因的加性效應(yīng)為2.29和1.92,在經(jīng)產(chǎn)胎次中B基因的加性效應(yīng)為0.76和1.15。

    在本試驗(yàn)中,在杜洛克、長白以及約克夏3個(gè)豬種中BB基因型頻率均低,分別為5.26%、0、15.87%;且在杜洛克與長白豬中,AA基因型頻率均大于60%;而在約克夏中AB基因型為主要基因型,占到61.90%。通過以上數(shù)據(jù),我們可以對(duì)引進(jìn)的這一批種豬的繁殖性能有一個(gè)大概的了解。我們應(yīng)綜合種豬的其他性狀,并對(duì)ESR基因的優(yōu)勢等位基因B進(jìn)行保留,對(duì)引進(jìn)的種豬進(jìn)行再一次選育。豬的繁殖性狀屬于低遺傳力性狀,非遺傳效應(yīng)對(duì)其影響較大。因此,除了堅(jiān)持遺傳標(biāo)記輔助選擇外,還需要注意為種豬提供較好的營養(yǎng)、防疫及飼養(yǎng)環(huán)境等其他綜合的非遺傳條件,以確保種豬的最佳繁殖性能。

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    2014-02-09)

    國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào):2013BAD20B07),四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào):2013NZ0041),科技部和四川省科技富民強(qiáng)縣項(xiàng)目資助

    朱礪,教授,博士生導(dǎo)師,研究方向:豬的遺傳育種

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