瓜蔞皮提取物對大鼠血管內(nèi)皮功能的影響

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(1.湘南學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部藥理教研室，湖南 郴州 423000；2.湘南學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部機(jī)能實(shí)驗(yàn)室；3.中南大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)系)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

瓜蔞皮提取物對大鼠血管內(nèi)皮功能的影響

譚斌1,3，劉思妤1，王桂霞2，曹喻靈1，彭軍3*

(1.湘南學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部藥理教研室，湖南 郴州 423000；2.湘南學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部機(jī)能實(shí)驗(yàn)室；3.中南大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)系)

目的研究瓜蔞皮提取物(EPT)對大鼠血管內(nèi)皮功能損傷的影響,為下一步探明瓜蔞皮保護(hù)血管內(nèi)皮的有效組份做準(zhǔn)備。方法用水煎醇沉法和萃取法提取瓜蔞皮的有效組份,用不同有效組份喂養(yǎng)低密度脂蛋白(LDL)損傷血管內(nèi)皮大鼠，并檢測血液內(nèi)源性相關(guān)物質(zhì)。結(jié)果單次靜注LDL(4 mg/kg)顯著誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，增加血漿中非對稱二甲基精氨酸(ADMA)水平，而降低一氧化氮(NO)水平。兩種提取(70%乙醇提取和氯仿萃取)的瓜蔞皮提取物均能顯著抑制LDL所致ADMA濃度升高和NO的降低。結(jié)論瓜蔞皮70%醇提取再氯仿萃取物能明顯減輕血管內(nèi)皮損傷,對血管有明顯的保護(hù)作用。

瓜蔞皮提取物; 血管內(nèi)皮; 功能

瓜蔞,原名栝樓實(shí),為胡蘆科植物栝樓(trichosanthis,fructus ) 或雙邊栝樓(Trichosanthes Rosthornii Harms) 的干燥成熟果實(shí)。 剖開果實(shí),除去果瓤及種子稱瓜蔞皮。 皮、籽合用稱瓜蔞。 瓜蔞是一種常用中藥[ 1-2 ]。 近年來的研究表明,瓜蔞有擴(kuò)張冠狀動脈、保護(hù)心肌缺血等功效[3]。 為了探明瓜蔞治療冠心病的有效成分,本研究團(tuán)隊用萃取法和水煎醇沉法[4]從瓜蔞皮中分離提取出9個組份,并用不同有效組份喂養(yǎng)LDL損傷血管內(nèi)皮大鼠，檢測血液內(nèi)源性相關(guān)物質(zhì)變化反映提取物對大鼠主動脈血管內(nèi)皮功能的影響。研究發(fā)現(xiàn)，瓜蔞皮提取物能明顯改善血管內(nèi)皮功能[5]。 血管內(nèi)皮功能不全是動脈粥樣硬化等心血管疾病的重要病理基礎(chǔ)。臨床研究證明，動脈粥樣硬化等心血管疾病患者血中內(nèi)源性二甲基精氨酸(ADMA)顯著升高，并伴血管內(nèi)皮舒張功能障礙[6]。 因此可推測在瓜蔞提取物中凡能保護(hù)血管內(nèi)皮功能的組分都將被認(rèn)為是治療冠心病的有效成分。因此，本文研究瓜蔞皮提取物對大鼠主動脈血管內(nèi)皮功能的影響,對篩選治療冠心病中藥的有效成分具有重要意義。

1 材料與方法

1.1材料及試劑非對稱性二甲基精氨酸(ADMA)標(biāo)準(zhǔn)品、苯腎上腺素和乙酰膽堿均購自Sigma公司；無水乙醇購自天津大茂化學(xué)試劑廠；一氧化氮(NO)試劑盒購自南京聚力生物公司。其它藥物均市售分析純。高效液相色譜(LC-6A,Japan)；PcLab生物信息采集系統(tǒng)(成都泰盟)；低溫離心機(jī) (JJ-6A，Beckman)； 722分光光度計(上海分析儀器廠)。

1.2瓜蔞皮分離提取方法

1.2.1 水煎醇沉法 將瓜蔞皮粉碎,水煎3次,合并濾液并蒸發(fā)成浸膏狀,用95% 乙醇沉淀,蒸干濾液,過大孔樹脂,再用水和40%、 70%、 95%乙醇梯度洗脫后,除盡溶劑,配制成3×10-4g/mL水溶液,備用。

1.2.2 萃取法 將瓜蔞皮粉碎,水煎3次,合并濾液并蒸發(fā)成浸膏狀,用95% 乙醇沉淀,蒸干濾液,過大孔樹脂,再70%乙醇梯度洗脫后,除盡溶劑,分成三等份，分別用正丁醇、氯仿、乙酸乙酯萃取藥液，并將有機(jī)溶劑蒸干除盡溶劑,配制成3×10-5g/mL 水溶液,備用。

1.3實(shí)驗(yàn)動物及分組SD大鼠體重200±20 g,雌雄各半,購自中南大學(xué)動物學(xué)部。

1.3.1 動物分組(水煎醇沉法) 將48只SD大鼠隨機(jī)分為6組，每組8只大鼠。

①空白對照組，用0.9%氯化鈉注射液(4 mL/kg)每天灌胃1次，連續(xù)5天；

②LDL損傷組，用0.9%氯化鈉注射液(4 mL/kg)每天灌胃1次，連續(xù)5天,于第4 天起，間隔24 h分別于尾緣靜脈注射LDL(4 mL/kg)以復(fù)制LDL大鼠模型;

③EPT(L)組:40%乙醇瓜蔞皮提取物+LDL組,以濃度為0.01 g/mL 40%乙醇瓜蔞皮提取物每天灌胃1次，每次4 mL/kg連續(xù)5天，藥物處理第4天起間隔24 h分別于尾緣靜脈注射LDL(4 mL/kg);

④EPT(M)組:70%乙醇瓜蔞皮提取物+LDL組,以濃度為0.01 g/mL 70%乙醇瓜蔞皮提取物每天灌胃1次，每次4 mL/kg連續(xù)5天，藥物處理第4天起間隔24 h分別于尾緣靜脈注射LDL(4 mL/kg);

⑤EPT(H)組:95%乙醇瓜蔞皮提取物+LDL組,以濃度為0.01 g/ mL95%乙醇瓜蔞皮提取物每天灌胃1次，每次4 mL/kg連續(xù)5天，藥物處理第4天起間隔24h分別于尾緣靜脈注射LDL(4 mL/kg);

⑥EPT(W)組:雙蒸水瓜蔞皮提取物+LDL組,以濃度為0.01 g/ mL雙蒸水瓜蔞皮提取物每天灌胃1次，每次4 mL/kg連續(xù)5天，藥物處理第4天起間隔24 h分別于尾緣靜脈注射LDL(4 mL/kg)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動物分組(萃取法) 將40只SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組8只大鼠。

①空白對照組，用0.9%氯化鈉注射液(4 mL/kg)每天灌胃1次，連續(xù)5天；

②LDL損傷組，用0.9%氯化鈉注射液(4 mL/kg)每天灌胃1次，連續(xù)5天,于第4 天起，間隔24 h分別于尾緣靜脈注射LDL(4 mL/kg)以復(fù)制LDL大鼠模型;

③EPT(X)組:正丁醇瓜蔞皮提取物+LDL組,以濃度為0.01 g/ mL正丁醇瓜蔞皮萃取物每天灌胃1次，每次4 mL/kg連續(xù)5天，藥物處理第4天起間隔24 h分別于尾緣靜脈注射LDL(4 mL/kg);

④EPT(Y)組:氯仿瓜蔞皮提取物+LDL組,以濃度為0.01g/ mL氯仿瓜蔞皮萃取物每天灌胃1次，每次4 mL/kg連續(xù)5天，藥物處理第4天起間隔24 h分別于尾緣靜脈注射LDL(4 mL/kg);

⑤EPT(Z)組:乙酸乙酯瓜蔞皮提取物+LDL組,以濃度為0.01 g/mL乙酸乙酯瓜蔞皮萃取物每天灌胃1次，每次4 mL/kg連續(xù)5天，藥物處理第4天起間隔24 h分別于尾緣靜脈注射LDL(4 mL/kg)。

1.4動物取血將處理好的動物用25%烏來糖腹腔注射麻醉，固定在鼠板上，切開大鼠頸部皮膚，用玻璃分針慢慢分離一側(cè)頸總動脈，用動脈夾夾住頸總動脈近心端，用線結(jié)扎近心端；用眼科剪小心的把動脈剪開一“V”型口，然后插入動脈導(dǎo)管，松開動脈夾，讓血流進(jìn)事先準(zhǔn)備好的試管內(nèi)，以3 000 r/min離心20 min，分離得血清，取上清液倒入EP管內(nèi)，置冰箱內(nèi)冷凍待測。

1.5血清內(nèi)源性物質(zhì)的檢測

1.5.1 血清ADMA含量測定 用高效液相色譜(HPLC)測定血清中ADMA的含量(HPLC系統(tǒng)：LC-10Advp；色譜柱：Nova-Pak C18)。取10 μL血清樣品或標(biāo)準(zhǔn)品加入100 μL衍生試劑(為硼酸緩沖液與鄰苯二甲醛及β-巰基乙醇等混合物)，混勻，室溫反應(yīng)3 min然后進(jìn)樣，用線性梯度洗脫的方式將樣品從色譜柱中洗脫[流動相A為0.05 mol/L乙酸鈉∶甲醇∶四氫呋喃=82∶17∶1(V/V/V)，流動相B為0.05mol/L乙酸鈉∶甲醇∶四氫呋喃=22∶77∶1(V/V/V)，流速為1 mL/min]，預(yù)柱處理后，用RF-10Axl型熒光檢測器對ADMA進(jìn)行檢測(激發(fā)波長：λ=338 nm；發(fā)射波長：λ=425 nm)。

1.5.2 血清NO含量測定 生物系統(tǒng)中NO釋放后很快轉(zhuǎn)變成代謝產(chǎn)物NO2-和NO3-，以鎘粉將NO3-還原成NO2-，NO2-通過Griess重氮化反應(yīng)生成有色化合物，用722分光光度計540 nm處測定，然后根據(jù)公式計算出NO2-含量以此來反應(yīng)血漿中NO濃度。

1.6血管舒張實(shí)驗(yàn)將處理好的動物模型用25%烏來糖腹腔麻醉開胸，頸動脈取血，迅速分離剪取胸主動脈段，置于充有95% O2和5% CO2混合氣體的克—亨氏液(NaCl 11.8,KCl 4.7,KH2PO41.2，MgSO41.2,CaCl22.5,NaHCO325,Glucose 11 mmol/L)中(37 ℃)。剪去血管周圍結(jié)締組織并清除血管內(nèi)血液，把血管剪成約3～4 mm的血管環(huán)，血管環(huán)一端固定于浴槽，另一端連接張力換能器，通過Pclab生物信息采集系統(tǒng)記錄血管張力變化。實(shí)驗(yàn)過程中需更換克-亨氏液，調(diào)節(jié)靜息張力為2 g，待穩(wěn)定后加入乙酰膽堿(10-6mol/L)誘導(dǎo)血管環(huán)依賴性舒張。

2 結(jié) 果

2.1水煎醇沉法瓜蔞皮提取物對大鼠血漿內(nèi)源性物質(zhì)的影響由表1可見，70%乙醇瓜蔞皮提取物對大鼠血漿ADMA、NO的影響均較好，其次是水洗脫部分,也能有較好的效果。70%乙醇提取物能對抗LDL對血管內(nèi)皮的損害，升高血液中NO含量，降低ADMA血漿含量，表明此兩部分提取物對血管內(nèi)皮有明顯的保護(hù)作用，說明對血管有保護(hù)作用的瓜蔞皮有效組份在70%乙醇提取物和水洗脫部分里。

2.2水煎醇沉法瓜蔞皮提取物對大鼠血管舒張功能的影響由圖1可見，3個不同濃度乙醇提取的瓜蔞皮中，70%乙醇提取物喂養(yǎng)的大鼠血管的舒張功能均較好，其次是水洗脫部分,也能有較好的效果。70%乙醇提取物能對抗LDL對血管內(nèi)皮的損害，其血管內(nèi)皮舒張功能比較接近正常對照組，表明此兩部分提取物對血管內(nèi)皮有明顯的保護(hù)作用，進(jìn)一步說明對血管有保護(hù)作用的瓜蔞皮有效組份在70%乙醇提取物和水洗脫部分里。

表1水煎醇沉法瓜蔞皮提取物對大鼠血漿ADMA、NO的影響(n=8)

組別ADMA(μmol/L)NO(μmol/L)Control組1.29±0.1948.86±3.00LDL損傷組1.63±0.13a33.89±6.02aEPT(L)組1.59±0.1634.06±8.1EPT(M)組1.32±0.14c55.29±5.54cEPT(H)組1.57±0.1734.07±8.17EPT(W)組1.38±0.11b40.38±5.95b

與空白對照組比較，a：P<0.01；與LDL損傷組比較，b：P<0.05，c ：P<0.01

圖1 水煎醇沉法瓜蔞皮提取物對大鼠血管舒張功能的影響 與空白對照組比較，**： P<0.01；與LDL損傷組比較，+： P<0.05，++：P<0.01

2.3萃取法瓜蔞皮提取物對大鼠血漿內(nèi)源性物質(zhì)的影響由表2可見，氯仿萃取物喂養(yǎng)的大鼠對其血漿ADMA、NO的影響最大。瓜蔞皮氯仿萃取物能對抗LDL對血管內(nèi)皮的損害，升高血液中NO的含量，降低ADMA的血漿含量，表明此部分提取物對血管內(nèi)皮舒張功能有明顯的保護(hù)作用，說明對血管有保護(hù)作用的瓜蔞皮有效組份在氯仿萃取物里。

表2萃取法瓜蔞皮提取物各組份對大鼠血漿ADMA、NO的影響(n=8)

組別ADMA(μmol/L)NO(μmol/L)Control組1.35±0.2149.36±2.06LDL損傷組1.71±0.23a34.53±3.43aEPT(X)組1.68±0.1734.74±6.62EPT(Y)組1.45±0.15b55.46±3.56cEPT(Z)組1.67±0.2334.47±4.53

與空白對照組比較，a：P<0.01；與LDL損傷組比較，b：P<0.05，c ：P<0.01

2.4萃取法瓜蔞皮提取物對大鼠血管舒張功能的影響由圖2可見，氯仿萃取物喂養(yǎng)的大鼠其血管的舒張功能最好。瓜蔞皮氯仿萃取物能對抗LDL對血管內(nèi)皮的損害而血管內(nèi)皮的舒張功能比較接近正常對照組，表明此部分提取物對血管內(nèi)皮舒張功能有明顯的保護(hù)作用，說明對血管有保護(hù)作用的瓜蔞皮有效組份在氯仿萃取物里。

圖2 萃取法瓜蔞皮提取物對大鼠血管舒張功能的影響 與空白對照組比較，**：P<0.01；與LDL損傷組比較，+：P<0.05，++：P<0.01

3 討 論

NO和ADMA是心血管的舒張和收縮密切相關(guān)的兩種內(nèi)源性活性物質(zhì)，在動脈粥樣硬化的發(fā)病過程中起著重要的作用。NO能夠舒張血管，而ADMA是血管內(nèi)皮損傷的表現(xiàn)。LDL過高可使血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，從而導(dǎo)致NO的釋放更為減少，進(jìn)而又加重內(nèi)皮功能的損傷，同時LDL可誘導(dǎo)大鼠ADMA水平升高，從而使血管發(fā)生動脈粥樣硬化；臨床研究表明，動脈粥樣硬化等心血管疾病患者血中內(nèi)源性ADMA顯著升高，并伴有血管內(nèi)皮依賴性舒張功能減弱[7]，這表明內(nèi)源性ADMA含量升高是動脈粥樣硬化等心血管疾病血管內(nèi)皮功能不全發(fā)生的關(guān)鍵原因[8]。本研究結(jié)果顯示，瓜蔞皮提取物能提高LDL誘導(dǎo)的大鼠血清NO水平，降低ADMA水平，具有保護(hù)血管內(nèi)皮的作用。其機(jī)制可能是EPT通過降低ADMA水平，提高內(nèi)皮細(xì)胞對NO的生成與釋放，亦可能與EPT中的礦物質(zhì)元素含量較高，它們作為生物體內(nèi)多種酶的輔酶，對于核酸、蛋白質(zhì)的合成有直接或間接的作用，促進(jìn)上皮細(xì)胞的修復(fù)有一定關(guān)系，這一推斷是否成立需要做進(jìn)一步的研究，并且已開始相關(guān)研究鑒定瓜蔞皮有效組份的化學(xué)成分。

綜上所述，瓜蔞皮用70%乙醇提取再用氯仿萃取的瓜蔞皮提取物具有明顯的保護(hù)血管內(nèi)皮作用。

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EffectofEPTAgainstDamagesoftheEndotheliumInducedbyLow-densityLipoproteininRats

TAN Bin,LIU Siyu,WANG Guixia,et al

(DepartmentofPharmacology,XiangnanUniversity,Chenzhou，Hunan423000，China)

ObjectiveTo study the effect of extractive of pericarpium trichosanthis(EPT) on damages of the endothelium induced by low-density lipoprotein (LDL),and find out the effective components of pericarpium trichosanthis in protecting endo-thelial cells.MethodsExtract the effective component of pericarpium trichosanthis with extraction method of water decoction alcohol and precipitation.Use different effective components to feed rats of the endothelium of damages induced by LDL,and detect endogenous related substance.ResultsA single injection of LDL (4 mg/kg) significantly increased the serum levels of asymmetric dimethylarginine (ADMA),reduced the serum levels of nitric oxide (NO).EPT with the different abstraction (70%alcohol and chloroform) markedly reduced the level of ADMA,,and increased the level of NO.ConclusionEPT with the different abstraction (70%alcohol and chloroform) protects the endothelium against damages induced by LDL.

extractive of pericarpium trichosanthis; blood vessel endothelium; function

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.05.006

2015-03-15；

2015-06-19

湖南省高校創(chuàng)新平臺開放基金 (12K133)；湖南省中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)項(xiàng)目(201227)；湖南省”十二五”重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科基金( 湘教發(fā)[2011]76號).

*通訊作者，E-mail:junpeng@csu.edu.cn.

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A

(此文編輯：朱雯霞)