低分子質(zhì)量大豆肽對(duì)斷奶仔豬胃酸分泌的影響及機(jī)制

權(quán)素玉，榮 超，王珊珊，張?jiān)词?/p>

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生理生化重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095）

低分子質(zhì)量大豆肽對(duì)斷奶仔豬胃酸分泌的影響及機(jī)制

權(quán)素玉，榮 超，王珊珊，張?jiān)词?

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生理生化重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095）

目的：本實(shí)驗(yàn)旨在探討大豆肽對(duì)斷奶仔豬胃酸分泌的影響及其作用機(jī)制。方法：選取剛出生的健康蘇姜豬仔豬30 頭，隨機(jī)分為對(duì)照組和大豆肽組，對(duì)照組仔豬在斷奶前常規(guī)補(bǔ)料，大豆肽組仔豬則補(bǔ)充基礎(chǔ)日糧+2%大豆肽，仔豬在21 d時(shí)一次性斷奶，分別在21 日齡與35 日齡時(shí)每組隨機(jī)取6 頭仔豬宰殺，取血液、胃黏膜及胃內(nèi)容物，對(duì)兩組所有仔豬的胃食糜pH值、血清中胃泌素含量以及胃底組織中H+-K+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶、胃蛋白酶的活性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：大豆肽組中，21 日齡仔豬胃內(nèi)pH值下降（由對(duì)照組的4.40±0.17降至3.94±0.38），35 日齡仔豬胃內(nèi)pH值顯著下降（由對(duì)照組的4.15±0.16降至2.89±0.06）；35 日齡仔豬血清中胃泌素含量顯著升高（P＜0.05），胃黏膜中H+-K+-ATP酶和Na+-K+-ATP酶以及胃蛋白酶的活力均升高，但與對(duì)照組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。結(jié)論：大豆肽可促進(jìn)仔豬胃酸分泌，但其作用途徑不是通過(guò)提高H+-K+-ATP/Na+-K+-ATP酶活力通路實(shí)現(xiàn)，可能是通過(guò)促進(jìn)胃泌素分泌直接作用于壁細(xì)胞引起的。

大豆肽；斷奶仔豬；胃酸分泌；胃泌素

近年來(lái)，蛋白水解物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與生物學(xué)功能已受到越來(lái)越多的重視。蛋白水解物是應(yīng)用不同種類的蛋白酶水解蛋白質(zhì)而得到的終產(chǎn)物，是由蛋白胨、多肽以及游離氨基酸所組成的混合物[1]。大豆肽是大豆蛋白質(zhì)經(jīng)酶水解作用后，再經(jīng)特殊處理而得到的低肽混合物。與大豆蛋白相比，大豆肽往往具有更好的物理性質(zhì)，可直接被機(jī)體吸收利用，并具有降低血壓、提高免疫力、抗氧化等作用[2-4]。

胃酸是由胃腺壁細(xì)胞分泌的鹽酸，具有激活胃蛋白酶原，為胃蛋白酶提供適宜的酸性環(huán)境，抑制和殺死隨食物進(jìn)入胃內(nèi)的細(xì)菌，促進(jìn)胰液、膽汁和小腸液的分泌等作用，因此，胃酸分泌對(duì)食物的消化吸收具有重要意義[5]。本實(shí)驗(yàn)室前期工作證明，伴大豆球蛋白胃蛋白酶水解肽對(duì)人和動(dòng)物胃腸道優(yōu)勢(shì)菌群——雙歧桿菌具有促生長(zhǎng)作用，并能抵抗外源大腸桿菌的感染[6-8]，但大豆肽是否能夠促進(jìn)機(jī)體胃酸分泌，目前仍不是很清楚。本研究擬以不同日齡斷奶仔豬為研究對(duì)象，探討大豆肽與機(jī)體內(nèi)源酸分泌的關(guān)系，闡明早期應(yīng)用大豆肽對(duì)胃酸分泌的促進(jìn)作用，為挖掘大豆肽的新功能及生產(chǎn)實(shí)踐提供理論依據(jù)，同時(shí)，本研究對(duì)功能性食品的開(kāi)發(fā)也具有一定價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

蘇姜豬仔豬，由泰州市姜曲海種豬場(chǎng)提供；基礎(chǔ)日糧，購(gòu)于泰州市正大飼料有限公司。

大豆肽（分子質(zhì)量300～700 u），按照王吉莊等[9]的方法進(jìn)行制備。

H+-K+-ATP酶測(cè)定試劑盒、Na+-K+-ATP酶測(cè)定試劑盒、胃蛋白酶測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所；胃泌素放射免疫測(cè)定試劑盒 北京北方生物技術(shù)研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

CT15RE高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司；FMJ-182型放射免疫γ-計(jì)數(shù)器 上海原子核研究所日環(huán)儀器一廠；pH計(jì) 新加坡Ecoscan公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取胎次相近、遺傳基礎(chǔ)一致的剛出生健康仔豬30 頭（雌雄各半），隨機(jī)分為2 組（對(duì)照組和大豆肽組），對(duì)照組仔豬斷奶前常規(guī)補(bǔ)料，大豆肽組仔豬則補(bǔ)充基礎(chǔ)日糧+2%大豆肽。參照美國(guó)國(guó)家研究委員會(huì)（National Research Council，NRC）（1998）豬營(yíng)養(yǎng)需要量配制基礎(chǔ)日糧，具體配方見(jiàn)表1。

實(shí)驗(yàn)前對(duì)豬舍進(jìn)行全面清洗、消毒。封閉式圈舍，分欄飼養(yǎng)，固定飼喂次數(shù)、不限量，自由飲水，進(jìn)行常規(guī)免疫。仔豬21 日齡時(shí)一次性斷奶。仔豬分別在21 日齡與35 日齡時(shí)分2 次屠宰，宰前禁食12 h，每組隨機(jī)取6 頭屠宰。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平Table 1 Basal diet composition and nutrient levels

1.4 樣品采集

血樣采集：血樣采自屠宰仔豬時(shí)的靜脈血，于室溫條件下放置，待血液凝固后，吸取上清液，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液分裝存于－20 ℃冰箱備測(cè)。

胃黏膜組織采集：取胃底組織，經(jīng)生理鹽水漂洗后，液氮速凍后轉(zhuǎn)到－80 ℃冰箱保存。刮取胃黏膜，用生理鹽水1∶10（V/V）稀釋后勻漿，6 000 r/min離心30 min后取上清液，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 胃食糜pH值的測(cè)定

參照付水廣等[10]方法，分別取21 日齡與35 日齡時(shí)分2 次屠宰仔豬的胃部，以無(wú)菌法于冰面上收集胃食糜并將適量胃食糜裝入離心管內(nèi)，4 ℃、7 200×g離心25 min，用pH計(jì)測(cè)定上清液pH值。

1.5.2 血清中胃泌素含量的測(cè)定

采用放射免疫法測(cè)定仔豬血清中胃泌素的含量，操作過(guò)程全部按試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行。

1.5.3 胃底組織中H+-K+-ATP酶和Na+-K+-ATP酶活性的測(cè)定

樣本前處理：準(zhǔn)確稱取仔豬胃黏膜組織100 mg放入1 mL裂解液中，冰上勻漿，12 000 r/min、4 ℃離心15 min，吸取上清液，棄去沉淀，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法[11]測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

采用定磷法[12]測(cè)定ATP酶的活力，一個(gè)酶活力單位（U）定義為反應(yīng)體系中1 h內(nèi)ATP酶磷酸化釋放磷的含量（mmol）。ATP酶活力的具體計(jì)算方法見(jiàn)下式。

式中：空白組是以生理鹽水替代胃黏膜組織；標(biāo)準(zhǔn)組是以ATP酶標(biāo)準(zhǔn)品替代胃黏膜組織；6、7.8均為計(jì)算系數(shù)。

1.5.4 胃蛋白酶總活性的測(cè)定

采用Folin-酚試劑法[6]，以110%牛血紅蛋白（分子質(zhì)量為64 500 u）作底物，F(xiàn)olin試劑顯色，用Backman分光光度計(jì)于680 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A680nm）。

胃蛋白酶活性大小以1 g新鮮胃黏膜組織在30 ℃、pH 2.15條件下，1 min內(nèi)牛血紅蛋白經(jīng)蛋白酶分解作用所產(chǎn)生的酪氨酸（μg/mL）的量來(lái)表示。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著性檢驗(yàn)采用單因子方差分析（one way analysis of variance，one way ANOVA），進(jìn)一步進(jìn)行最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）檢驗(yàn)。所有數(shù)值以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同日齡斷奶仔豬胃食糜pH值變化

圖1 不同日齡斷奶仔豬胃食糜的pH值變化（n＝6）Fig.1 Comparison of pH in stomach chyme of weaning piglets of different ages (n = 6)

由圖1可知，21 日齡剛斷奶仔豬胃食糜pH值為4.40±0.17，35 日齡仔豬胃食糜pH值則降為4.15±0.16，隨著仔豬日齡的增加，胃食糜pH值稍有降低，但均高于成年豬胃食糜pH值。在日糧中添加2%大豆肽后，21 日齡剛斷奶仔豬胃食糜pH值為3.94±0.38，較對(duì)照組略有下降，斷奶2 周后（35 日齡） 仔豬胃食糜pH值降為2.89±0.06，接近成年豬的胃食糜pH值，且顯著低于同日齡對(duì)照組（P＜0.05）。21、35 日齡斷奶仔豬胃食糜pH值均低于對(duì)照組，表明在日糧中添加大豆肽可以改善斷奶仔豬胃內(nèi)的酸性環(huán)境。

2.2 大豆肽對(duì)斷奶仔豬血清中胃泌素含量的影響

由圖2可知，隨著日齡的增加，仔豬血清中胃泌素含量均顯著升高。同日齡仔豬間比較發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加2%大豆肽后，仔豬血清中胃泌素含量均高于對(duì)照組，但在21 日齡時(shí)差異不顯著（對(duì)照組（19.56±1.46） pg/mL、大豆肽組（28.60±2.99） pg/mL）（P＞0.05），在35 日齡時(shí)則表現(xiàn)為顯著升高（對(duì)照組（50.02±1.43） pg/mL、大豆肽組（57.19±2.41） pg/mL）（P＜0.05）。

圖2 斷奶仔豬血清中胃泌素含量比較（n＝6）Fig.2 Comparison of serum gastrin contents in weaning piglets of different ages (n = 6)

2.3 大豆肽對(duì)斷奶仔豬胃底組織中ATP酶和胃蛋白酶活性的影響

表2 飼喂大豆肽對(duì)斷奶仔豬ATP酶和胃蛋白酶活力的影響（n＝6）Table 2 Effect of feeding soybean peptide on H+-K+-ATPase, Na+-K+-ATPase and pepsin activities in weaning piglets (n= 6)

如表2所示，隨著斷奶仔豬日齡的增加，對(duì)照組和大豆肽組斷奶仔豬胃底組織中H+-K+-ATP酶和胃蛋白酶的活性均有增加，同日齡仔豬間比較發(fā)現(xiàn)，飼喂2%大豆肽后，斷奶仔豬胃底組織中H+-K+-ATP酶和胃蛋白酶的活性較對(duì)照組均有所升高，但差異均不顯著（P＞0.05）。斷奶仔豬胃底組織中的Na+-K+-ATP酶的活性隨著仔豬日齡的增加有降低，飼喂大豆肽的35 日齡斷奶仔豬胃底組織中Na+-K+-ATP酶的活性較對(duì)照組有所升高，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

3 討 論

由于斷奶所產(chǎn)生一系列應(yīng)激問(wèn)題，使仔豬斷奶后胃酸分泌能力減弱；同時(shí)仔豬失去母乳這一乳糖源，消化道內(nèi)乳酸含量明顯下降，因此仔豬胃內(nèi)酸度在斷奶后降低，胃液pH值升高[5]。仔豬胃液pH值一般在3.5～5.5左右，而成年豬胃液的pH值為2.0左右，仔豬胃液pH值過(guò)高會(huì)導(dǎo)致胃中多種酶原（胃蛋白酶、凝乳酶及乳糖酶等）致活能力減弱，從而對(duì)飼料中各種養(yǎng)分的消化利用率降低；而且過(guò)高的胃腸pH值為病原菌（大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、葡萄球菌、梭菌等）的繁殖提供了適宜的環(huán)境；加之胃酸分泌不足引起胃排空加快，大量未經(jīng)消化的飼料涌入小腸，進(jìn)入后段消化道，致使大腸桿菌大量繁殖，引起仔豬腹瀉[8-9]。有效地促進(jìn)仔豬斷奶后胃酸分泌、提高其胃內(nèi)酸度是降低仔豬腹瀉、降低斷奶應(yīng)激發(fā)生的有效手段，也一直是畜牧業(yè)研究的熱點(diǎn)。

植物源蛋白是豬的主要日糧，但就仔豬而言，因?yàn)橹参锏鞍紫瘦^低以及含有抗原物質(zhì)，因此在使用前需經(jīng)過(guò)加工來(lái)提高其應(yīng)用價(jià)值[10]。在集約化養(yǎng)豬生產(chǎn)過(guò)程中，利用植物源蛋白質(zhì)生產(chǎn)具有生物活性的小肽制劑，可以降低植物蛋白中的抗原成分，從理論和實(shí)際應(yīng)用上都可能是解決仔豬優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)原料缺乏、減輕或消除斷奶仔豬應(yīng)激綜合征的有效途徑[13]。

先前對(duì)斷奶仔豬的實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)，在日糧中添加大豆蛋白酶解物能促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)，并能夠在一定程度上克服早期斷乳應(yīng)激反應(yīng)對(duì)仔豬消化道的不良影響[14]，朱曉萍等[15]的研究表明在日糧中添加酸化劑可降低仔豬胃內(nèi)容物的pH值、提高胃蛋白酶活性，進(jìn)而促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，減少仔豬腹瀉的發(fā)生。張?jiān)词绲萚16]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)給早期斷奶仔豬添喂乳蛋白活性肽，可促進(jìn)仔豬胃酸分泌。潘翠玲等[6]的研究發(fā)現(xiàn)大豆蛋白酶解物對(duì)21 日齡早期斷乳仔豬生長(zhǎng)性能及消化道發(fā)育均有一定的改善作用。在本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)添喂一定量的大豆肽對(duì)21 日齡和35 日齡仔豬胃酸分泌均有改善作用，仔豬胃蛋白酶活性增加，說(shuō)明在日糧中添加大豆蛋白酶解物能促進(jìn)仔豬胃酸分泌，并能夠在一定程度上克服早期斷乳應(yīng)激對(duì)仔豬消化道的不良影響。同時(shí)，35 日齡斷奶仔豬胃食糜的pH值降低幅度優(yōu)于21 日齡斷奶仔豬，提示長(zhǎng)期添喂大豆肽更能有效改善仔豬胃酸分泌和胃蛋白酶活性。本實(shí)驗(yàn)中，大豆肽組仔豬的胃酸分泌顯著性增加，但胃蛋白酶活性與對(duì)照組相比卻無(wú)顯著差異，這可能是大豆肽組和對(duì)照組飼料蛋白水平的差異所造成的[17]。

胃酸分泌主要受胃泌素及胃腸道中ATP酶的調(diào)節(jié)。H+-K+-ATP酶又名質(zhì)子泵，它專一性地存在于壁細(xì)胞中，是胃酸分泌的分子基礎(chǔ)，也是調(diào)控壁細(xì)胞分泌胃酸的最后通道[18]。H+- K+-ATPase通過(guò)自身的磷酸化和去磷酸化，將細(xì)胞外的K+轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)逆濃度梯度將細(xì)胞內(nèi)的H+泵出細(xì)胞外，完成H+/K+電中性跨膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)和胃酸分泌功能[19]。Na+-K+-ATPase又稱為鈉鉀泵，也是通過(guò)自身的磷酸化和去磷酸化在胃酸分泌過(guò)程中通過(guò)維持細(xì)胞中正常的滲透壓和穩(wěn)態(tài)[20]。胃泌素又稱為促胃液素，是由G細(xì)胞分泌的一種胃腸激素，主要刺激壁細(xì)胞分泌鹽酸，也有輕微地刺激主細(xì)胞分泌胃蛋白酶原等作用[21]。冷向軍等[22]的研究表明飼料中添加組胺可刺激仔豬胃酸分泌，顯著改善早期斷奶仔豬的生產(chǎn)性能；張?jiān)词鏪23-24]和高維東[25]等研究發(fā)現(xiàn)飼喂酪啡肽可以促進(jìn)斷奶仔豬的胃酸分泌，其機(jī)制是通過(guò)上調(diào)胃泌素mRNA的基因表達(dá)使胃泌素分泌增加。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在基礎(chǔ)日糧中添加大豆肽，發(fā)現(xiàn)斷奶仔豬胃液pH值降低；兩周后，35 日齡仔豬胃酸分泌能力增強(qiáng)，仔豬胃液pH值降為2.89±0.06，且與同齡對(duì)照組相比差異顯著。通過(guò)檢測(cè)參與胃酸分泌相關(guān)指標(biāo)胃泌素活力以及H+-K+-ATP酶和Na+-K+-ATP酶活力發(fā)現(xiàn)，大豆肽組仔豬胃底黏膜組織中H+-K+-ATP酶和Na+-K+-ATP酶活性與對(duì)照組無(wú)明顯差異，但血清中胃泌素水平顯著升高，提示大豆肽促進(jìn)胃酸分泌不是通過(guò)H+-K+-ATP/Na+-K+-ATP酶活力通路實(shí)現(xiàn)的，可能是通過(guò)促進(jìn)胃泌素分泌直接作用于壁細(xì)胞引起的，其詳細(xì)機(jī)理還有待深入研究。

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Effect of Low-Molecular-Weight Soybean Peptide on the Secretion of Gastric Acid in Weaning Piglets and Its Mechanism

QUAN Suyu, RONG Chao, WANG Shanshan, ZHANG Yuanshu*
(Key Laboratory of Animal Physiology and Biochemistry, Ministry of Agriculture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The purpose of this study is to investigate the effect of soybean peptide on the secretion of gastric acid in weaning piglets. Thirty newborn Sujiang pigs were randomly divided into control group and soy peptide group. In the soy peptide group, 2% soybean peptide was additionally added to the basal diet. All pigs were weaned at 21 days of age. At the age of 21 days and 35 days, 6 pigs were randomly selected in each group and slaughtered. Gastric chyme pH, serum gastrin level and the enzyme activities of H+-K+-ATPase, Na+-K+-ATPase and pepsin in the stomach fundus were measured. Results: In the soy peptide group, the intragastric pH of 21-day-old piglets decreased to 3.94 ± 0.38 from 4.40 ± 0.17; the intragastric pH of 35-day-old piglets was 2.89 ± 0.06, a significant decrease compared with 4.15 ± 0.16 for control group; the serum gastrin level of 35-day-old piglets increased significantly (P ＜ 0.05) and the enzyme activities of gastric mucosal H+-K+-ATPase, Na+-K+-ATPase and pepsin also increased but not significantly (P ＞ 0.05). These results suggest that soybean peptide can improve the secretion of gastric acid in piglets, likely by increasing gastrin secretion which may directly act on the parietal cells rather than by enhancing the activities of H+-K+-ATPase, Na+-K+-ATPase and pepsin.

soybean peptide; weaning piglets; gastric acid secretion; gastrin

TS214.2

A

1002-6630（2015）21-0249-04

10.7506/spkx1002-6630-201521046

2015-01-12

江蘇省普通高校研究生實(shí)踐創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（SJLX_0281）

權(quán)素玉（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)生物化學(xué)。E-mail：1203457176@qq.com

*通信作者：張?jiān)词纾?962—），女，教授，博士，研究方向?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)生物化學(xué)。E-mail：zhangyuanshu@njau.edu.cn