紫草提取物對疲勞大鼠的肝組織保護作用

徐小仙，熊正英

（1.西安石油大學體育部，陜西 西安 710065；2.陜西師范大學運動生物學研究所，陜西 西安 710062）

紫草提取物對疲勞大鼠的肝組織保護作用

徐小仙1，熊正英2

（1.西安石油大學體育部，陜西 西安 710065；2.陜西師范大學運動生物學研究所，陜西 西安 710062）

目的：通過觀測耐力訓練大鼠力竭和恢復24 h后肝組織及線粒體生化指標的變化，探討紫草提取物在保肝護肝、提高運動能力、延緩運動疲勞、促進疲勞后恢復方面的生物學機理。方法：選取40 只Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠，隨機分為5 組，每組8只：訓練對照組（A組）、運動力竭組（B組）、力竭恢復組（C組）、加藥力竭組（D組）、加藥恢復組（E組）。5 組大鼠按照訓練模型進行為期6 周的跑臺耐力訓練，第6周的最后1 d，A組大鼠不進行訓練，在安靜狀態(tài)下處死并進行樣本處理和指標測定；B、C、D、E組大鼠進行一次性力竭運動后，處死B、D組大鼠并進行樣本處理和指標測定；24 h后，處死C、E組大鼠并進行樣本處理和指標測定。結果：大鼠在力竭運動后，肝組織抗氧化能力顯著下降（P＜0.05），一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）活性和NO含量極顯著降低（P＜0.01），線粒體Na+/K+-ATPase、Ca2+/Mg2+-ATPase活性顯著降低（P＜0.05），24 h后，各指標恢復不明顯。補充紫草提取物的大鼠在力竭運動后，與運動力竭組大鼠相比，肝組織抗氧化能力、NOS活性和NO含量、線粒體Na+/K+-ATPase、Ca2+/Mg2+-ATPase活性都顯著升高（P＜0.05）；24 h后，各指標基本恢復到基礎水平。結論：外源性補充紫草提取物可以有效調節(jié)NO的生成平衡，改善大鼠肝組織自由基清除和代謝水平，保護肝線粒體離子泵的活性和功能，能延緩運動疲勞的產生，促進運動后機體功能恢復。

紫草提取物；保護肝臟；抗疲勞

現(xiàn)代運動醫(yī)學研究表明，高強度運動后產生過多的自由基可破壞機體細胞和組織以及生物膜系統(tǒng)，引起生物膜發(fā)生脂質過氧化反應，導致蛋白質變性、線粒體功能障礙等，造成胞漿中Ca2+堆積、細胞代謝障礙、線粒體呼吸鏈受損，進而導致肌肉收縮能力下降而產生疲勞感[1-2]。運動疲勞如果不及時消除，將會導致人體機能下降，使運動能力下降，甚至會導致過度疲勞，嚴重影響身體健康[3-4]。現(xiàn)代中醫(yī)研究表明，運動疲勞和運動后恢復及五臟的調節(jié)密切相關，其根本在于肝臟調節(jié)功能的失常[5-6]。通過有針對性地補充外源性營養(yǎng)補劑或者藥物活性成分，調節(jié)和保護肝臟功能，是延緩運動疲勞和促進運動后恢復的有效途徑之一[7-9]。

紫草始載于《神農本草經》，其性寒，味甘、咸，具有涼血、活血、解毒透疹的功效，其富含的萘醌類化合物具有較好的保肝降酶等作用，是一種藥用價值很高的植物[10-12]。本實驗通過建立高強度跑臺動物運動模型，探討紫草提取物在保肝護肝、延緩運動疲勞、促進疲勞后恢復方面的生物學機理，為紫草作為運動補劑的開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠40 只，體質量180～220 g，由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。

新疆紫草（Arnebia euchroma（Royle）Johnston）購于新疆參茸藥業(yè)有限責任公司，經西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室李恒朝教授鑒定為新疆紫草的根。標本號為NO20130827009，保存在陜西師范大學生命科學學院。

實驗用標準品：紫草素、β-羥基異戊酰紫草素、異戊酰紫草素 上海純優(yōu)生物公司；乙酰紫草素、去氧紫草素、異丁酰紫草素、α-甲基-正丁酰紫草素 上?；菡\生物科技有限公司；β,β-二甲基丙烯酰紫草素 東京化成工業(yè)株式會社。以上所有對照品純度都在95%以上。

石油醚、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、蔗糖 西安化學試劑廠；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、巰基（mercapto group，—SH）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）試劑盒、一氧化氮（nitric oxide，NO）試劑盒、Na+/K+-ATPase試劑盒、Ca2+/Mg2+-ATPase試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；752B型分光光度計 上海第三分析儀器廠；Agilent 1200型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；DD5低溫高速離心機 湖南凱達科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紫草提取物的制備

參照文獻[13]的方法，取紫草用臼杵研磨成粗粉，95%乙醇30 倍量（V/m）超聲提取1 h，利用旋轉蒸發(fā)儀低溫回收溶劑，得浸膏并用水混懸后用30 倍量（V/m）的石油醚萃取3 次，回收溶劑得紫草提取物浸膏，出膏率為1.57%。臨用前以生理鹽水混懸，配成相應劑量。

1.3.2 紫草提取物有效成分測定[14]

采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）分析測定紫草提取物主要化學成分及含量，色譜條件：色譜柱為Scienhome Kromasil C18（4.6 mm×200 mm，5 μm）及預柱，流動相為乙腈（A）-0.3%磷酸（B），梯度洗脫，檢測波長為274 nm，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min。并取標準品制備對照溶液，經HPLC測定標準品溶液和紫草提取物懸混液，通過對比分析確定紫草提取物主要化學成分和含量。

1.3.3 動物分組

SD大鼠自由飲食、飼養(yǎng)溫度（23±5） ℃、相對濕度40%～70%，照明隨同自然變化。將大鼠隨機分為5 組，每組8 只：訓練對照組（A組）、運動力竭組（B組）、力竭恢復組（C組）、加藥力竭組（D組）、加藥恢復組（E組）。分籠適應性飼養(yǎng)7 d后進行實驗。

1.3.4 運動模型的建立

5 組大鼠同時進行6 周的跑臺訓練，訓練方案采用Bedford等[15]的跑臺訓練模型（表1），每周訓練6 d，每天訓練前以15 m/min的速率做5 min適應性運動后開始正式訓練。取適量紫草提取物混懸于生理鹽水中攪勻，每次運動訓練結束后按照800 mg/（kg·d）[16]對大鼠進行灌胃（以體質量計，下同），灌胃劑量為2 mL。D、E兩組灌胃紫草提取物，A、B、C 3 組灌胃等量生理鹽水。在第6周最后1 d，A組大鼠不進行訓練，在安靜狀態(tài)下處死，作為長時間訓練的對照組；B、D組大鼠按照第6周強度運動至力竭并立即處死，作為力竭對照組；C、E組大鼠按照第6周強度運動至力竭并恢復24 h后處死，作為恢復對照組。

1.3.5 取材及樣品制備

所有大鼠在處死前禁食12 h，處死后立即進行樣本采集、處理和指標測定。

肝組織線粒體及勻漿的制備[17]：大鼠斷頭處死后，迅速取出肝臟，用預冷的緩沖液（含250 mmol/L蔗糖、1 mmol/L EDTA、10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5））洗凈血液，剪去黏連的組織，用濾紙輕輕吸干表面水分，稱取0.3 g肝臟轉入小燒杯中，在冰浴中剪碎肝臟，制成10%的肝勻漿，4 ℃、2 000 r/min離心10 min，棄去沉淀部分，再將上清液10 000 r/min離心15 min，所得沉淀物即為肝臟線粒體。線粒體采用超聲波法裂解。裂解后線粒體均用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量。取肝左葉相同部位稱質量后用生理鹽水制備5%的勻漿，2 000 r/min離心10 min取上清液，備用。

1.3.6 指標測定方法

力竭時間測定：B、C、D、E組大鼠按照第6周強度運動至力竭，并記錄力竭時間。力竭判斷標準[18]：運動過程中大鼠跟不上預定速率，臀部壓在籠具后壁，后肢隨轉動皮帶后拖達30 s，毛刷刺激驅趕無效即為力竭。大鼠力竭行為特征表現(xiàn)為呼吸急促、精神疲倦，俯臥位垂頭，刺激后無反應。

—SH、MDA、NO含量及SOD、GSH-Px、NOS、Na+/K+-ATPase、Ca2+/Mg2+-ATPase活力等指標測定均嚴格按照試劑盒說明書方法進行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 12.0軟件包處理進行分析，組間比較采用t檢驗，實驗數(shù)據(jù)用±s表示。

2 結果與分析

2.1 紫草提取物中萘醌的含量

經HPLC測定標準品溶液和紫草提取物懸混液，通過對比分析確定紫草提取物主要化學成分為紫草素（1）、β-羥基異戊酰紫草素（2）、乙酰紫草素（3）、去氧紫草素（4）、異丁酰紫草素（5）、β,β-二甲基丙烯酰紫草素（6）、α-甲基-正丁酰紫草素（7）和異戊酰紫草素（8）。以上8 種萘醌類化合物在紫草提取物中含量為65.73 mg/100 mg，在紫草生藥中含量為0.368 mg/100 mg，具體數(shù)據(jù)見表2，由此可知紫草提取物中主要化學成分為萘醌類化合物。

表2 紫草提取物中8 種萘醌類成分的含量Table 2 Contents of eight naphthoquinone in gromwell root extract mg/100 mg

2.2 紫草提取物對大鼠力竭和恢復24 h后肝組織抗氧化能力的影響

表3 各組大鼠肝組織抗氧化能力的比較（x±s，n＝8）Table 3 Antioxidant capacity of hepatic tissue in the rats from each group (x±s,n= 8)

由表3可知，力竭運動后，B組大鼠肝組織SOD、GSH-Px活力和—SH含量顯著低于A組（P＜0.05），MDA含量顯著高于A組（P＜0.05）。C組大鼠肝組織SOD、GSH-Px活力和—SH含量顯著低于A組（P＜0.05），MDA含量顯著高于A組（P＜0.05）。D組大鼠肝組織SOD、GSH-Px活力和—SH含量顯著高于B組（P＜0.05），MDA含量顯著低于B組（P＜0.05）。E組大鼠肝組織SOD、GSH-Px活力和—SH含量顯著高于B組和C組（P＜0.05），MDA含量顯著低于B、C、D組（P＜0.05）。

2.3 紫草提取物對耐力訓練大鼠肝組織NO-NOS體系和肝線粒體ATPase活性的影響

表4 各組大鼠肝組織NO-NOS和肝線粒體ATPase活性的比較（x±s，n＝8）Table 4 NO-NOS in hepatic tissue and ATPase activity in hepatic mitochondria of rats (x±s,n= 8)

由表4可知，耐力訓練大鼠在力竭運動后（B組），肝組織NOS活力和NO含量、肝線粒體Na+/K+-ATPase、Ca2+/Mg2+-ATPase活力顯著或極顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；恢復24 h后（C組），肝組織NOS活力和NO含量、肝線粒體Na+/K+-ATPase、Ca2+/Mg2+-ATPase活力有所恢復，但仍顯著低于A組（P＜0.05）。補充紫草提取物的大鼠在力竭運動后（D組），肝組織NOS活力和NO含量、線粒體Na+/K+-ATPase、Ca2+/Mg2+-ATPase活力顯著低于A組（P＜0.05），線粒體Na+/K+-ATPase、Ca2+/Mg2+-ATPase活力顯著高于B組（P＜0.05）；恢復24 h后（E組），肝組織NOS活力、NO含量和線粒體Na+/K+-ATPase、Ca2+/Mg2+-ATPase活力都基本上恢復到訓練對照組水平，與B組比較極顯著升高（P＜0.01），與C、D組比較顯著升高（P＜0.05）。

2.4 紫草提取物對耐力訓練大鼠跑臺運動力竭時間的影響

表5 大鼠運動力竭時間比較（x±s，n＝16）Table 5 Exhaustive exercise time in rats (x±s,n=16)

由表5可知，加藥力竭組+加藥恢復組（D組+E組）16 只補充紫草提取物的大鼠力竭運動時間顯著高于運動力竭組+力竭恢復組（B組+C組）的16 只大鼠，平均力竭時間延長了19.45%，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討 論

3.1 紫草提取物對耐力訓練大鼠力竭和恢復24 h后肝組織抗氧化能力的影響

SOD及GSH-Px是機體內兩類重要的抗氧化酶，通過催化抗氧化反應清除自由基?！猄H是維持機體功能的活性基團，可以防止代謝過程中產生的氧自由基對組織細胞的損傷。MDA是自由基作用于脂質發(fā)生過氧化反應的終產物，其含量則是反映機體脂質過氧化水平和細胞損傷程度的重要指標[19]。本實驗結果顯示，高強度耐力訓練大鼠在力竭運動后，肝組織抗氧化酶（SOD、GSH-Px）活性和巰基（—SH）含量顯著下降，脂質過氧化產物（MDA）含量顯著升高，恢復24 h后，各項指標恢復不明顯，說明大鼠在高強度力竭運動中，肝臟的抗氧化能力下降，肝組織自由基過度堆積，且其氧化損傷在短時間內很難恢復。外源性補充紫草提取物的大鼠在力竭運動后，肝組織抗氧化酶的活性和巰基含量顯著高于運動力竭組（P＜0.05），MDA含量也顯著低于運動力竭組（P＜0.05），恢復24 h后，各抗氧化指標基本恢復到訓練對照組水平。說明紫草提取物可以延緩運動導致的氧化損傷，也可促進運動后氧化損傷的功能修復。其機制可能與紫草提取物中富含萘醌類化合物，具有5、8位酚羥基有關，且氫醌結構很不穩(wěn)定，極易向外傳遞電子和質子，可以終止生物膜中不飽和脂肪酸的自由基鏈式反應，具有較強的抗氧化能力[20-21]，能有效延緩高強度運動中自由基的過渡堆積，保護抗氧化酶活性和對運動強度的耐受適應能力，促進了高強度運動后機體功能的恢復。

3.2 紫草提取物對訓練大鼠力竭和恢復24 h后肝組織NOS活性和NO含量的影響

NO作為內源性抗通透因子，可以舒張血管、增加組織血液供給、改善微循環(huán)和組織代謝狀況。同時，運動提高了血流對血管壁產生的剪切應力，增加了NO的生成與釋放，有利于運動過程中營養(yǎng)物質的輸送和代謝產物的清除。NOS是NO生成的關鍵限速酶，運動訓練對NOS的影響隨運動強度和時間的變化而不同[22]。

本實驗結果表明，力竭運動即刻肝組織NOS活性和NO含量極顯著降低（P＜0.01），恢復24 h后，NOS活性和NO含量仍處于較低水平。其原因可能是機體的一種保護性抑制，抑制NOS活性，防止NO生成過度所引起的毒性作用，且在較短時間的恢復期內，肝臟仍處于較高的氧化應激水平，NOS活性受到抑制，NO合成不足。本實驗結果還顯示，外源性補充紫草提取物的大鼠在力竭運動后，肝組織NOS活性和NO含量顯著高于運動力竭組（P＜0.05），研究表明，紫草提取物可以通過調節(jié)肝臟的NO水平，保護酒精和四氯化碳對肝臟的誘導損傷[16,23-24]。本實驗結果也說明紫草提取物可以延緩高強度運動對大鼠NO-NOS系統(tǒng)的抑制作用，其機制可能是紫草富含抗氧化成分，保護了抗氧化酶的活性，減輕了自由基對內皮細胞的損傷，進而維護了NO-NOS系統(tǒng)的生理功能；但肝組織NOS活性和NO含量還低于訓練對照組，說明加藥組大鼠在力竭運動后，肝臟仍然處于氧化應激狀態(tài)，對NO-NOS系統(tǒng)也起到了一定的抑制作用。在恢復24 h后，補充紫草提取物組大鼠肝組織NOS活性和NO含量基本恢復到基礎水平，說明紫草提取物有利于促進高強度運動后大鼠NO-NOS系統(tǒng)的功能恢復。其機制可能是紫草中的萘醌類化合物的抗氧化性能降低了運動中肝臟氧化應激水平，保護肝組織細胞結構和功能的完整性，促進了NO-NOS系統(tǒng)的功能恢復和NO的生成平衡；外源性補充紫草提取物，有利于運動機體的肝臟NO-NOS系統(tǒng)產生對抗性適應，降低NOS各亞型的誘導表達和NO的毒性作用，促進了NO-NOS系統(tǒng)的生理性恢復。

3.3 紫草提取物對訓練大鼠力竭和恢復24 h后肝線粒體ATPase活性的影響

線粒體是維持細胞生命活動的生物能合成和供應的“能源供應中心”。肝細胞含有1 000～2 000 個線粒體，這些線粒體可占到肝細胞總體積的1/5。氧化應激環(huán)境下，自由基可攻擊線粒體膜，引起細胞能量代謝障礙甚至凋亡。Na+/K+-ATPase、Ca2+/Mg2+-ATPase鑲嵌于線粒體內膜，是維持線粒體膜流動性正常的關鍵酶，當這兩種酶的活性下降時，線粒體鈉泵功能發(fā)生障礙，導致線粒體內膜水腫，線粒體膜流動性下降，從而致使線粒體氧化磷酸化功能障礙，ATP合成不足，又直接降低了ATPase的活力，二者互為因果，構成惡性循環(huán)[25]。

大鼠力竭運動后，肝線粒體Na+/K+-ATPase、Ca2+/Mg2+-ATPase活性顯著下降（P＜0.05），說明肝組織在缺血缺氧狀態(tài)下，自由基攻擊細胞膜發(fā)生脂質過氧化反應，使存在于細胞膜上的Na+/K+-ATPase、Ca2+/Mg2+-ATPase活性下降?；謴?4 h后，大鼠肝線粒體ATPase活性仍然較低，說明肝組織細胞離子跨膜運轉障礙和能量代謝的紊亂，長時間高強度運動造成的線粒體損傷在短時間內很難修復。外源性補充紫草提取物的大鼠在力竭運動后，肝線粒體Na+/K+-ATPase、Ca2+/Mg2+-ATPase活性顯著高于運動力竭組（P＜0.05），且24 h后基本恢復基礎水平。這說明紫草提取物可以保護長時間高強度運動大鼠肝線粒體Na+/K+-ATPase、Ca2+/Mg2+-ATPase的活性和運動后的恢復，其機制可能與紫草中的萘醌類化合物降低了運動大鼠肝組織細胞的氧化應激水平，防止自由基對肝細胞線粒體膜的攻擊，維護細胞形態(tài)結構和功能，保護Na+/K+-ATPase、Ca2+/Mg2+-ATPase活性有關。

3.4 紫草提取物對耐力訓練大鼠力竭時間的影響及其機制

本實驗結果顯示，加藥組大鼠與訓練對照組大鼠相比較，力竭運動時間延長了19.45%，表明補充紫草提取物可以提高大鼠的運動能力，延緩運動疲勞的產生。其機制主要與紫草中富含萘醌類化合物，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、免疫調節(jié)等多重藥理作用有關。外源性補充紫草提取物可以提高運動過程中大鼠肝臟對氧化應激水平的適應能力，促進NO的生成平衡和生理功能發(fā)揮，防止自由基對細胞膜的攻擊，保護肝組織抗氧化酶和線粒體膜上離子泵的活性和功能，保證運動過程中大鼠肝組織細胞的離子代謝、能量代謝和物質代謝功能的正常運轉，從而保證運動過程中機體的“能源供應”，提高機體的運動能力，延長運動時間。

4 結 論

長期補充紫草提取物能夠有效保持高強度運動大鼠肝組織抗氧化酶的活性，調節(jié)運動過程中NO的生成平衡，改善肝組織自由基清除能力和代謝水平；保護肝線粒體Na+/K+-ATPase、Ca2+/Mg2+-ATPase活性，有助于調節(jié)運動過程中肝線粒體內外的離子平衡和維持細胞的正常生理功能；最終發(fā)揮抗氧化、抗自由基，保護肝細胞、抗肝損傷和延緩運動疲勞、提高運動能力的作用。其作用機理有待于進一步深入研究。

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Hepatoprotective Effect of Gromwell Extract in Fatigue Rats

XU Xiaoxian1, XIONG Zhengying2
(1. Department of Physical Education, Xi’an Shiyou University, Xi’an 710065, China; 2. Institute of Sports Biology, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China)

Purpose: To observe changes in hepatic and mitochondrial biochemical parameters in rats previously undergoing exhaustive exercise after 0 and 24 hours of recovery, and subsequently to explore the biological mechanisms of orally administered gromwell root extract (GRE) for protecting the liver, improving exercise performance, mitigating exercise fatigue and accelerating recovery from fatigue in rats. Methods: Totally 40 rats were divided into 5 groups including exercise control group (group A), exhaustive exercise group (group B), exhaustive exercise followed by 24 h recovery group (group C), exhaustive exercise with GRE treatment group (group D), exhaustive exercise followed by 24 h recovery group with GRE treatment (group E). The rats from each group were subjected to exercise training for 6 weeks. On the last day of the experimental period, the rats from group A (without exercise training), B and D (immediately after exercise training) were sacrificed, while those from group C and E were sacrificed at 24 h after exercise training, and samples were collected for the measurement of biochemical parameters. Results: After the exhaustive exercise, the antioxidant capacity of hepatic tissue (P ＜ 0.05), the activity of nitric oxide synthase (NOS) and the content of NO in hepatic tissue (P ＜ 0.01), and the activities of Na+/K+-ATPase and Ca2+/Mg2+-ATPase in hepatic mitochondria were significantly decreased (P ＜ 0.05), but these indicators were not significantly restored after subsequent recovery for 24 hours. Compared with group B, the antioxidant capacity of hepatic tissue in rats receiving oral administration of GRE was significantly improved (P ＜ 0.05), and NOS activity, NO content and the activities of Na+/K+-ATPase and Ca2+/Mg2+-ATPase in hepatic mitochondria were also enhanced significantly (P ＜ 0.05); after 24 hours of recovery, these indicators were restored to the basal levels. Conclusion: Oral supplementation of gromwell root extract can regulate the balance of NO generation, improve the balance of free radical metabolism, protect the activities and functions of ionic pumps, prolong the exhaustive time of endurance-trained rats, and enhance functional recovery from exercise fatigue.

gromwell extract; hepatoprotection; anti-fatigue

G804.7

A

1002-6630（2015）21-0238-05

10.7506/spkx1002-6630-201521044

2014-12-08

陜西師范大學創(chuàng)新基金項目（SD1307）

徐小仙（1979—），女，講師，碩士，研究方向為運動營養(yǎng)的中藥資源開發(fā)。E-mail：xuxiaoxian0108@163.com