灰霉病菌拮抗放線菌的篩選鑒定及對(duì)草莓的防腐保鮮效果

申光輝，張志清，秦 文，劉書亮，馮 孟

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

灰霉病菌拮抗放線菌的篩選鑒定及對(duì)草莓的防腐保鮮效果

申光輝，張志清，秦 文*，劉書亮，馮 孟

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

為豐富草莓采后病害拮抗菌資源，以草莓灰霉病菌（Botrytis cinerea）為指示菌，采用瓊脂塊法對(duì)草莓根際土壤分離的78 株放線菌進(jìn)行篩選，并測(cè)定拮抗效果最強(qiáng)的菌株T3-5的拮抗譜。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性及16S rDNA序列進(jìn)行鑒定，并初步研究其無菌發(fā)酵液對(duì)貯藏草莓腐爛發(fā)生及果實(shí)品質(zhì)的影響。結(jié)果表明：草莓根際土壤分離的菌株T3-5對(duì)草莓灰霉病菌具有較強(qiáng)拮抗作用，拮抗圈直徑為22.5 mm；對(duì)3 株常見細(xì)菌和6 株果蔬采后病原真菌均具有不同程度的抑制效果。該菌株經(jīng)鑒定為黃暗色鏈霉菌（Streptomyces xanthophaeus）。菌株無菌發(fā)酵液能夠顯著降低貯藏草莓腐爛率（P＜0.05），延緩果實(shí)硬度、可溶性固形物、可滴定酸及VC的降低。研究表明拮抗鏈霉菌T3-5對(duì)貯藏草莓具有良好的防腐保鮮作用，在草莓采后貯藏和生物保鮮中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

灰霉病菌；黃暗色鏈霉菌；拮抗菌；草莓；貯藏品質(zhì)

草莓（Fragaria×ananassa Duch.）是一種重要的漿果，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，被譽(yù)為“水果皇后”。但因含水量高，組織嬌嫩，果皮極薄，在采摘和采后貯運(yùn)過程中極易受到機(jī)械損傷和病原微生物侵染而快速腐爛變質(zhì)[1-2]。由灰霉病菌（Botrytis cinerea）引起的灰霉病害是制約草莓采后貯藏品質(zhì)的主要因素之一[3]。長(zhǎng)期以來草莓采后灰霉病的控制主要依賴于傳統(tǒng)的化學(xué)殺菌技術(shù)[4]，由于人們對(duì)食品安全性要求越來越高，迫切需要尋求高效、安全的新技術(shù)替代化學(xué)殺菌。近年來，氣調(diào)貯藏[5]、低溫冷藏[6]、熱激處理[7]、輻照[8]等草莓貯藏保鮮技術(shù)研究較多，但受到操作復(fù)雜繁瑣，成本較高等因素限制，仍難以替代化學(xué)殺菌在生產(chǎn)實(shí)踐中進(jìn)行大范圍的推廣應(yīng)用。

利用拮抗微生物控制果蔬采后病害的方法具有天然、安全、使用簡(jiǎn)便、成本低等優(yōu)點(diǎn)，有望成為傳統(tǒng)化學(xué)殺菌劑極具潛力的替代途徑[9-10]。拮抗放線菌代謝活性產(chǎn)物種類豐富，作用機(jī)制多樣，菌株抗逆性強(qiáng)，便于保存，利于菌劑生產(chǎn)和應(yīng)用，在植物病害生物防治研究中受到廣泛關(guān)注。目前國(guó)內(nèi)外已篩選獲得多株草莓采后病害拮抗微生物，包括細(xì)菌[11-12]、酵母菌[13-14]和霉菌[15]，而利用放線菌進(jìn)行草莓采后病害防治的研究鮮見報(bào)道。本研究從草莓根際土壤中分離篩選獲得1株對(duì)草莓灰霉病菌具有較強(qiáng)拮抗作用的放線菌菌株T3-5，結(jié)合菌株形態(tài)特征、生理生化特性和對(duì)16S rDNA序列的鑒定，并通過貯藏實(shí)驗(yàn)初步評(píng)價(jià)菌株無菌發(fā)酵液對(duì)草莓果實(shí)的防腐保鮮效果，為草莓采后病害的控制提供新的拮抗菌菌株資源。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)基

1.1.1 材料

豐香（Fragaria×ananassa Duch. “Toyonoga”）草莓，采自成都雙流縣草莓種植基地，挑選無病蟲害，色澤均勻，果面著色率80%左右，大小相近且無損傷的果實(shí)用于實(shí)驗(yàn)，采后立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室處理。

1.1.2 菌株

草莓灰霉病菌（Botrytis cinerea）17312由中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供；大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、番茄果腐病菌（Penicillium expansum）、冬棗黑腐病菌（Alternaria alternata）、番茄枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、枇杷褐斑?。≒estalotiopsis eriobotryfolia）、桃軟腐病菌（Rhizopus stolinifer）、蘋果輪紋病菌（Botryospuaeria berengeriana）均由四川省農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 培養(yǎng)基

高氏一號(hào)培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextroseagar agar，PDA）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（nutrient agar，NA）、國(guó)際鏈霉菌計(jì)劃（International Streptomyces Projects，ISP）系列形態(tài)特征培養(yǎng)基與生理生化鑒定培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 試劑與儀器

細(xì)菌基因組提取試劑盒、DL 2000 DNA Marker、溶菌酶 天根生化科技（北京）有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒、16S rDNA通用引物及其相關(guān)試劑 英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司。

Satorius CP225D型電子天平 德國(guó)賽多利斯公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SHP-160型智能生化培養(yǎng)箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；Sorvall離心機(jī) 美國(guó)科俊儀器有限公司；Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司；MyCycler PCR儀、PowerPac Basic電泳儀、水平電泳槽、凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；ZWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；HYC-260型醫(yī)用冷藏箱 青島海爾特種電器有限公司；GY-1型硬度計(jì) 浙江托普儀器有限公司；PX-B32T型水果糖度儀（ATC）廣州市普析通儀器有限公司；UV-3100PC型紫外分光光度計(jì) 上海美普達(dá)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 拮抗菌的分離純化

以種植基地獲取的12 份草莓根際土壤為分離源，采用平板稀釋分離法進(jìn)行放線菌分離。土樣梯度稀釋至10－3、10－4、10－5，每稀釋度吸取0.25 mL涂布于高氏一號(hào)平板培養(yǎng)基上（K2Cr2O7質(zhì)量濃度為80 mg/L），28 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d。挑取形態(tài)各異的放線菌單菌落進(jìn)行劃線分離純化，接種于高氏一號(hào)斜面培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5 d，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 拮抗菌的篩選及拮抗譜測(cè)定

拮抗放線菌菌株篩選采用瓊脂塊法。將待篩菌株涂布于高氏一號(hào)平板培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)7 d，用無菌打孔器打孔制備直徑7 mm的菌株瓊脂塊。草莓灰霉病菌孢子懸液涂布于PDA平板培養(yǎng)基，待篩放線菌瓊脂塊均勻置于平板培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)3 d，用十字交叉法測(cè)量并記錄拮抗圈大小，每株待篩放線菌重復(fù)3 次。拮抗譜測(cè)定同上述瓊脂塊法。

1.3.3 拮抗菌T3-5的鑒定

拮抗菌株的形態(tài)特征及生理生化特性的鑒定參照《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》[16]方法進(jìn)行，并與《放線菌的分類和鑒定》[17]中相關(guān)菌株特征進(jìn)行比較。

16S rDNA序列分析采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取T3-5菌株基因組DNA。采用通用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’進(jìn)行菌株16S rDNA PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)回收，交上海立菲生物技術(shù)有限公司純化并測(cè)序。利用美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中BLAST程序?qū)λ鶞y(cè)序列進(jìn)行比對(duì)分析，選擇GenBank中與之同源性較高菌種的模式菌株16S rDNA序列，利用Clustal X1.8軟件對(duì)其進(jìn)行多重比對(duì)，分析菌株T3-5與參比菌株之間的序列相似度，并通過Mega5.1軟件，選擇Kimura 2-parameter模型，構(gòu)建菌株Neighbor-Joining（N-J）系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行Bootstrap分析檢驗(yàn)，重復(fù)1 000 次。

1.3.4 T3-5無菌發(fā)酵液對(duì)草莓貯藏品質(zhì)的影響

將T3-5在高氏一號(hào)平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后，接種于高氏一號(hào)液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、140 r/min條件培養(yǎng)8 d。發(fā)酵液4 ℃，12 000 r/min離心，上清液經(jīng)0.22 μm細(xì)菌過濾器過濾獲得無菌發(fā)酵液，用無菌生理鹽水稀釋至體積分?jǐn)?shù)分別為5%、10%、20%無菌發(fā)酵稀釋液備用。

將供試草莓隨機(jī)分成4 組，其中3 組分別用體積分?jǐn)?shù)5%、10%、20%無菌發(fā)酵稀釋液浸果處理1 min，余下一組用生理鹽水浸果處理作為對(duì)照組。果實(shí)室溫晾干，裝入一次性包裝盒，每盒10 個(gè)果實(shí)，PE保鮮膜覆蓋好，貯藏于（4±1） ℃，相對(duì)濕度 90%～95%條件下。每處理組重復(fù)30 盒，其中15 盒用于統(tǒng)計(jì)果實(shí)腐爛指數(shù)，另外15 盒中每隔48 h隨機(jī)選取3 盒測(cè)定其他指標(biāo)。

1.3.5 果實(shí)腐爛指數(shù)測(cè)定

各處理組每隔48 h取3 盒草莓觀察腐爛情況，參照羅自生等[18]的方法，將草莓果實(shí)腐爛率按照腐爛面積占果面比例大小劃分為5 級(jí)：0 級(jí)，無腐爛；1 級(jí)，腐爛面積≤10%；2 級(jí)，腐爛面積10%～30%；3級(jí)，腐爛面積30%～50%；4 級(jí)，腐爛面積＞50%。

1.3.6 草莓果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

硬度采用果實(shí)硬度計(jì)測(cè)定；可溶性固形物用手持折光儀測(cè)定；可滴定酸采用NaOH溶液滴定法測(cè)定（以檸檬酸計(jì)）；VC含量采用分光光度法測(cè)定，以上指標(biāo)均參考曹建康等[19]方法進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行各處理組數(shù)據(jù)結(jié)果的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差及方差分析（analysis of variance，ANOVA），采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行不同處理組結(jié)果差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗放線菌菌株的分離篩選

圖1 T3-5菌株對(duì)草莓采后灰霉病菌（）的拮抗作用Fig.1 Antagonistic effect of strain T3-5 on Botrytis cinereaB. cinerea

從10 份土壤樣品中分離獲得78 株放線菌，通過篩選獲得5 株對(duì)草莓灰霉病菌具有拮抗作用的放線菌菌株，其中菌株T3-5對(duì)草莓灰霉病菌的拮抗圈直徑達(dá)22.5 mm（圖1）。該菌株具有較廣的拮抗譜，對(duì)常見細(xì)菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及番茄果腐病菌等6 種果蔬采后病原菌具有較強(qiáng)拮抗效果，結(jié)果見表1。

表1 菌株T3-5對(duì)草莓灰霉病菌及其他供試菌的拮抗作用Table 1 Inhibitory effect of strain T3-5 against the tested pathogens

2.2 拮抗菌株T3-5的鑒定

2.2.1 菌株培養(yǎng)特征、顯微形態(tài)及生理生化特性

菌株T3-5在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上氣生菌絲呈灰白色至紫灰色，基內(nèi)菌絲淺黃色至黃褐色，呈地衣狀，產(chǎn)少量淺黃色可溶性色素（圖2A）。在PDA、ISP2、ISP3、ISP4和ISP5培養(yǎng)基上氣生菌絲分別呈灰色、灰黃粉色、灰黃紅色、淺灰褐色和白色，基內(nèi)菌絲分別為灰色、淺灰黃色、灰黃色、暗褐色和淺黃色，除PDA培養(yǎng)基外均可產(chǎn)少量淺黃色可溶性色素。光學(xué)顯微鏡下觀察到菌株T3-5菌絲無橫隔，孢子絲直，柔曲，孢子直鏈排列，球形至卵圓形（圖2B）。菌珠T3-5的生理生化特征見表2。

圖2 T3-5菌株在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征（A）與光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)特征×400（B）Fig.2 Cultural characteristics (A) and morphological characteristics (B) of strain T3-5 on Gauze’s medium No. 1

表2 菌株T3-5生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain T3-5

2.2.2 菌株16S rDNA序列分析

以菌株T3-5基因組DNA為模板，采用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，結(jié)果見圖3，測(cè)序獲得菌株16S rDNA基因片段的長(zhǎng)度為1 424 bp。經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST工具比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，菌株T3-5的16S rDNA序列（GenBank登錄號(hào)：KP869098）與黃暗色鏈霉菌（Streptomyces xanthophaeus）XSD-129（GenBank登錄號(hào)：EU285474）序列相似度為100%，此外與GenBank中鏈霉菌屬內(nèi)多個(gè)種的菌株序列相似度大于99.5%。選取13 株相似度較高的鏈霉菌屬不同種模式菌株的16S rDNA序列與T3-5菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示菌株T3-5與黃暗色鏈霉菌（S. xanthophaeus），野尻鏈霉菌（S. nojiriensis）和孢淡灰鏈霉菌（S. spororaveus）3 種不同鏈霉菌的模式菌株聚在同一分支（圖4），且序列相似度均為99.86%。說明這3 種鏈霉菌在進(jìn)化過程中親緣關(guān)系密切，但利用16S rDNA序列分析不能將菌株T3-5鑒定到種。因此，結(jié)合在2.2.1節(jié)獲得的菌株培養(yǎng)特征、生理生化特性（表2）與《放線菌的分類和鑒定》[17]中這3 個(gè)種的特征描述進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)菌株T3-5孢子絲直形，與野尻鏈霉菌的緊密螺旋形孢子絲特征不符。此外孢淡灰鏈霉菌明膠不液化，纖維素生長(zhǎng)利用的生理特性與待鑒定菌株不符。然而，菌株T3-5的其他生理生化結(jié)果與黃暗色鏈霉菌相符合，因此初步將菌株T3-5鑒定為黃暗色鏈霉菌。

圖3 菌株T3-5的16S rDNA序列PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.3 PCR electrophoresis map based on 16S rDNA sequence of strain T3-5

圖4 基于16S rDNA序列構(gòu)建的菌株T3-5系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic neighbor-joining tree based on 16S rDNA sequences of strain T3-5 and related strains from GenBank database

2.3 拮抗菌株T3-5無菌發(fā)酵液對(duì)草莓貯藏品質(zhì)的影響

2.3.1 果實(shí)腐爛指數(shù)和硬度變化

圖5 T3-5無菌發(fā)酵液對(duì)4 ℃貯藏草莓腐爛指數(shù)（A）和硬度（B）的影響Fig.5 Effect of cell-free fermentation filtrate of strain T3-5 on decay rate (A) and firmness (B) of strawberry fruits stored at 4 ℃

如圖5A所示，4 ℃貯藏條件下各處理組草莓腐爛指數(shù)隨著貯藏時(shí)間呈逐漸上升趨勢(shì)，其中對(duì)照組果實(shí)腐爛指數(shù)上升最快，第10天時(shí)腐爛指數(shù)已達(dá)50.8%。貯藏第6～10天，菌株T3-5不同體積分?jǐn)?shù)無菌發(fā)酵液處理組草莓果實(shí)腐爛指數(shù)均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），且體積分?jǐn)?shù)越高，抑制效果越好；其中20%體積分?jǐn)?shù)無菌發(fā)酵液處理組草莓在貯藏第10天的腐爛指數(shù)為28.7%，較對(duì)照組降低了43.5%。果實(shí)硬度降低是草莓貯藏期品質(zhì)變劣的主要變現(xiàn)。由圖5B可知，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，各處理組草莓果實(shí)硬度均逐漸下降，對(duì)照組果實(shí)硬度下降最快。菌株T3-5不同體積分?jǐn)?shù)無菌發(fā)酵液處理組草莓果實(shí)硬度較對(duì)照組下降較慢；其中20%體積分?jǐn)?shù)發(fā)酵液處理組果實(shí)硬度下降最慢，至貯藏第10天，果實(shí)硬度為382 g/cm2，較對(duì)照組高13.1%。

2.3.2 果實(shí)可溶性固形物、可滴定酸、VC含量變化

由圖6A可見，在4 ℃貯藏條件下，各處理組草莓可溶性固形物含量呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。對(duì)照組果實(shí)可溶性固形物在貯藏第4天達(dá)到峰值，之后快速下降，至貯藏第10天果實(shí)可溶性固形物較貯藏初始降低了4.7%。菌株T3-5不同體積分?jǐn)?shù)無菌發(fā)酵液處理組果實(shí)可溶性固形物峰值出現(xiàn)時(shí)間均較對(duì)照組延遲，且之后降低較為緩慢，貯藏第6天之后果實(shí)可溶性固形物含量均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；其中20%體積分?jǐn)?shù)發(fā)酵液處理組果實(shí)在第8天才達(dá)到峰值，貯藏第10天可溶性固形物含量較貯藏初始增加了3.1%。

由圖6B可知，各處理組草莓果實(shí)在4 ℃條件貯藏下可滴定酸含量均呈逐漸下降趨勢(shì)。對(duì)照組果實(shí)可滴定酸下降速率最快，從第6天開始迅速降低，第10天果實(shí)可滴定酸含量較貯藏期初始下降了14.4%。菌株T3-5無菌發(fā)酵液處理可延緩貯藏期果實(shí)可滴定酸含量的下降，且隨著發(fā)酵液體積分?jǐn)?shù)的增加，延緩作用越強(qiáng)。貯藏期第6～10天，不同濃度發(fā)酵液處理組果實(shí)可滴定酸含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；其中20%體積分?jǐn)?shù)發(fā)酵液處理組果實(shí)貯藏第10天可滴定酸含量較對(duì)照組高5.4%。

由圖6C可知，各處理組草莓果實(shí)VC含量變化規(guī)律與可滴定酸類似。貯藏第10天，對(duì)照組果實(shí)VC損失率達(dá)52.9%。菌株T3-5無菌發(fā)酵液處理可延緩4 ℃貯藏果實(shí)VC的損失，其中20%體積分?jǐn)?shù)發(fā)酵液處理組果實(shí)VC在貯藏第10天損失率為33.1%，損失率較對(duì)照組減少了19.8%。

圖6 T3-5無菌發(fā)酵液對(duì)4 ℃貯藏草莓可溶性固形物（A）、可滴定酸（B）和VC含量（C）的影響Fig.6 Effect of cell-free fermentation filtrate of strain T3-5 on soluble solid (A), titratable acid (B) and vitamin C contents (C) of strawberry fruits stored at 4 ℃

3 討 論

近年來國(guó)內(nèi)外利用拮抗菌進(jìn)行草莓采后保鮮研究發(fā)展較快，獲得了多株對(duì)草莓采后病原菌具有較好拮抗作用及防腐保鮮效果的微生物菌株，主要以細(xì)菌和酵母菌為主[11-14]。放線菌種類繁多，代謝產(chǎn)物豐富多樣，是一類重要的微生物資源。在食品防腐保鮮領(lǐng)域成功廣泛應(yīng)用的抗菌多肽ε-多聚賴氨酸和納他霉素均由放線菌發(fā)酵生產(chǎn)[20]，并逐漸被應(yīng)用于果蔬采后保鮮研究[21]。為豐富用于果蔬采后病害控制的放線菌資源，近年來相關(guān)學(xué)者也開展了不少的篩選研究工作，并顯示出良好的開發(fā)利用潛力：如婁愷等[22]篩選獲得1 株鏈霉菌H2菌株，對(duì)哈密瓜采后優(yōu)勢(shì)腐敗菌交鏈孢霉具有較強(qiáng)拮抗作用；Li Qili等[23]發(fā)現(xiàn)球孢鏈霉菌（S. globisporus）揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)番茄灰霉病菌生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)均具有較強(qiáng)的抑制作用，活體實(shí)驗(yàn)表明對(duì)番茄灰霉病防效良好；鹿連明等[24]從29 份海洋生物中分離篩選獲得1 株米修鏈霉菌（S. misionensis），對(duì)柑橘青霉病菌、柑橘綠霉病菌和柑橘炭疽病菌具有較強(qiáng)拮抗作用和良好的防治效果。本研究獲得的鏈霉菌T3-5菌株對(duì)草莓采后灰霉病菌具有較強(qiáng)拮抗作用外，對(duì)番茄果腐病菌等指示菌也具有較強(qiáng)抑菌效果，表明該菌株具有較廣的拮抗譜，在果蔬采后病害防治上值得深入研究。同時(shí)也顯示出豐富的放線菌資源在果蔬采后病害防治方面的巨大潛力。

16S rDNA序列是微生物分類鑒定研究中快速、準(zhǔn)確的重要方法[25]。本研究通過16S rDNA測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，菌株T3-5與GenBank中3 個(gè)高度同源而又分屬不同種的模式菌株的序列相似度大于99.5%，同時(shí)也聚類在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹同一分支，無法準(zhǔn)確有效將T3-5鑒定到種。其他研究[26-28]也發(fā)現(xiàn)了16S rDNA序列在鑒定同源性很高的菌種過程中也存在類似的局限性，需要結(jié)合表觀、生理生化特征等其他多相分類方法[27-28]或其他分子生物學(xué)方法作為補(bǔ)充進(jìn)行鑒定[28]。本研究最終通過菌株形態(tài)、生理生化特性和16S rDNA序列將菌株T3-5初步鑒定為黃暗色鏈霉菌。因此，盡管16S rDNA序列分析技術(shù)已經(jīng)比較成熟和完善，但傳統(tǒng)的形態(tài)與生理生化特征仍是微生物菌種分類鑒定工作中必不可少的手段。

草莓果實(shí)4 ℃貯藏過程中可溶性固形物、可滴定酸、VC含量在貯藏第4天顯著降低，而果實(shí)腐爛指數(shù)與硬度在第6天發(fā)生較大幅度變化，這可能與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變化與果實(shí)軟化腐爛的生理生化過程差異有關(guān)。草莓采后可溶性固形物、可滴定酸的損失，主要與其作為果實(shí)呼吸代謝底物消耗有關(guān)[29]，此外腐敗菌侵染也會(huì)消耗果實(shí)部分糖類物質(zhì)；而草莓采后果實(shí)硬度下降主要與果膠降解相關(guān)酶活性升高，內(nèi)源激素水平變化，導(dǎo)致胞壁結(jié)構(gòu)瓦解有關(guān)[30]。草莓果實(shí)受到腐敗菌侵染，開始消耗果實(shí)糖類物質(zhì)到大量繁殖，并表現(xiàn)出腐爛癥狀也要經(jīng)歷一系列變化過程，因此表現(xiàn)出果實(shí)腐爛指數(shù)的急劇變化時(shí)間晚于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變化時(shí)間。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于黃暗色鏈霉菌的研究報(bào)道較少，其發(fā)酵產(chǎn)物成分主要在醫(yī)藥研究領(lǐng)域作為β-半乳糖苷酶和焦谷氨酰肽酶抑制劑等[31-32]。而關(guān)于黃暗色鏈霉菌在植物病害及果蔬采后病害防治方面鮮有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)菌株T3-5無菌發(fā)酵液對(duì)低溫貯藏草莓腐爛的發(fā)生具有良好的抑制效果，且對(duì)草莓果實(shí)品質(zhì)具有較好的維持作用，能夠延緩果實(shí)硬度降低，延緩可溶性固形物、可滴定酸消耗和VC成分的損失，進(jìn)一步表明該菌株在草莓采后保鮮實(shí)踐方面具有一定的開發(fā)價(jià)值。但本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)T3-5菌株應(yīng)用于草莓采后灰霉病控制及保鮮效果進(jìn)行了初步探究，要將其最終應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中，還需對(duì)其發(fā)酵液活性成分進(jìn)行分離鑒定，并對(duì)其抑菌作用機(jī)理，拮抗菌發(fā)酵液、病原菌與果實(shí)間互作效應(yīng)及菌株生產(chǎn)利用方式進(jìn)一步研究探索。

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Identification of Antagonistic Actinomyces Strain against Botrytis cinerea and Effect of Its Fermentation Filtrate on Preservation Quality of Strawberry

SHEN Guanghui, ZHANG Zhiqing, QIN Wen*, LIU Shuliang, FENG Meng
(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

In order to obtain more antagonists for controlling postharvest strawberry disease, Botrytis cinerea was used as an indicator strain to screen antagonistic actinomyces out of 78 strains isolated from strawberry rhizosphere. The inhibitory spectrum of antagonistic strain T3-5 was tested by agar block method, and the effect of its cell-free fermentation filtrate on postharvest decay and quality of fresh strawberry fruits was assessed. The results showed that strain T3-5 had the strongest inhibitory effect on B. cinerea and six other selected postharvest pathogens, and the diameter of inhibitory zone against B. cinerea was 22.5 mm. Based on its morphological characteristics and 16S rDNA sequence, the antagonistic strain T3-5 was primarily identified as Streptomyces xanthophaeus. Its cell-free fermentation filtrate significantly (P ＜ 0.05) decreased the incidence of strawberry fruit rot. In addition, assays demonstrated that T3-5 filtrate treatment could slow down the decline of postharvest strawberry fruit firmness, soluble solid content, titration acid content and vitamin C content during storage period. Conclusively, the antagonistic strain T3-5 has potential value in biological control against strawberry postharvest diseases.

Botrytis cinerea; Streptomyces xanthophaeus; antagonistic strain; strawberry; storage quality

S476；Q939.9

A

1002-6630（2015）21-0185-06

10.7506/spkx1002-6630-201521035

2015-02-04

四川省教育廳青年基金項(xiàng)目（13ZB0288）；國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303073）

申光輝（1985—），男，講師，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸镔Y源與利用。E-mail：shenghuishen@163.com

*通信作者：秦文（1967—），女，教授，博士，研究方向?yàn)楣卟珊笊砑百A藏技術(shù)。E-mail：qinwen1967@yahoo.com.cn