芫荽酸性磷酸酶的提取、純化及酶學(xué)性質(zhì)研究

王 丹，萬(wàn) 驥，傅 婷，唐云明

（西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

芫荽酸性磷酸酶的提取、純化及酶學(xué)性質(zhì)研究

王 丹，萬(wàn) 驥，傅 婷，唐云明*

（西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

采用硫酸銨分級(jí)沉淀、CM-Sepharose離子交換層析、Superdex-200凝膠過濾層析法，從新鮮芫荽中分離純化出電泳純的酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）。該酶的酶活回收率為14.20%、純化倍數(shù)為238.60、酶比活力為295.87 U/mg、亞基分子質(zhì)量約為53.8 kD；芫荽ACP酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明：該酶的最適反應(yīng)溫度為55 ℃，在50 ℃以下時(shí)較穩(wěn)定，因此該酶對(duì)溫度較敏感；該酶的最適反應(yīng)ph值為5.8，在ph 4.0～7.0之間較穩(wěn)定，表明該酶耐受于酸性環(huán)境；芫荽ACP的對(duì)硝基苯酚磷酸二鈉Km值為0.63 mmol/L，表明該酶與底物對(duì)硝基苯酚磷酸二鈉具有較高的親和力；甲醇、乙醇、異丙醇、抗壞血酸、草酸、Cu2+、Pb2+、Ag+對(duì)該酶具有強(qiáng)烈的抑制作用；Mg2+、Mn2+、Ba2+、K+對(duì)該酶具有一定的激活作用。

芫荽；酸性磷酸酶；分離純化；酶學(xué)性質(zhì)

芫荽（Coriandrum sativum L.），俗稱香菜，是傘形科一年生或二年生草本植物，常用作調(diào)味品，具有藥用價(jià)值和豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]。酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）是一類在酸性條件下催化磷酸單酯水解生成無(wú)機(jī)磷酸的巰基酶，廣泛存在于動(dòng)植物、微生物體內(nèi)以及人類的肝臟、前列腺等器官中[2]，是調(diào)控生物體中磷代謝的重要酶類[3]。ACP不僅參與了生物體的生長(zhǎng)與代謝調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，也可增強(qiáng)植物對(duì)缺磷、干旱、低溫、水分、鹽分等逆境的抗性；該酶可作為檢測(cè)土壤重金屬污染度的指標(biāo)，重金屬汞、銅、鋅引起酶分子色氨酸、酪氨酸殘基微環(huán)境產(chǎn)生變化，使酶活性中心的構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而對(duì)酶的催化活性產(chǎn)生影響[4-5]；該酶還可以作為食品及飲料的添加劑[6]；ACP也可以用來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)類食品中的微生物指標(biāo)，通過對(duì)食品中ACP活性的變化判斷其被細(xì)菌污染的程度，從而保障食品安全[7]。因此，該酶在多個(gè)領(lǐng)域中均具有應(yīng)用價(jià)值。目前，已有關(guān)于不同來(lái)源ACP的研究報(bào)道，江琰等[8]從意大利蜂工蜂體內(nèi)分離提純出ACP，并對(duì)其氨基酸組成成分進(jìn)行了分析；楊立紅等[9]從草魚肝臟中提取出ACP，并研究了多種金屬離子對(duì)其酶活性的影響；張國(guó)慶等[10]以樹狀多節(jié)孢為材料，研究了ACP的理化性質(zhì)及生物學(xué)特性。本實(shí)驗(yàn)選取芫荽為材料，從中分離純化出ACP，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，旨在為從植物中提取ACP提供理論參考，為進(jìn)一步對(duì)農(nóng)作物進(jìn)行遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮芫荽，購(gòu)于重慶北碚永輝超市。

Superdex-200、CM-Sepharose、蛋白質(zhì)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）標(biāo)準(zhǔn)品與凝膠過濾分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)GE Healthcare公司；甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺 瑞士Fluka公司；考馬斯亮藍(lán)R-250 美國(guó)Bio-Rad公司；牛血清白蛋白 美國(guó)Sigma公司；對(duì)硝基苯酚磷酸二鈉（p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate，PNPP） 美國(guó)Amresco公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 芫荽ACP粗酶液的制備

取新鮮芫荽嫩葉，用去離子水洗凈，用吸水紙擦干，稱取45 g并剪碎，按1∶3（m/V）的比例加入預(yù)冷的50 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液（ph 5.0，內(nèi)含2 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、10 mmol/L β-巰基乙醇、5 mmol/L MgSO4，下同），勻漿后，4 ℃冰箱中靜置抽提3 h，經(jīng)紗布過濾后濾液在4 ℃條件下10 000 r/min離心40 min，收集上清液，即為芫荽ACP粗酶液。

1.2.2 硫酸銨分級(jí)沉淀

向芫荽ACP粗酶液中加入硫酸銨至30%飽和度，4 ℃冰箱中靜置3 h，10 000 r/min離心40 min，收集上清液，再向其中加入硫酸銨至60%飽和度，4 ℃冰箱中靜置3 h，10 000 r/min離心40 min，棄上清液；沉淀用50 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液完全溶解，于4 ℃條件下透析24 h后3 000 r/min離心10 min，收集上清液即為初步純化的芫荽ACP酶液。

1.2.3 CM-Sepharose離子交換層析

CM-Sepharose離子交換層析柱經(jīng)50 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液（ph 5.0，內(nèi)含10 mmol/L β-巰基乙醇）平衡后，取10 mL初步純化后的芫荽ACP酶液上樣，用0～1 mol/L的NaCl溶液（由50 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液配制，ph 5.0，內(nèi)含10 mmol/L β-巰基乙醇）進(jìn)行線性梯度洗脫，流速為0.5 mL/min，每管收集5 mL，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。測(cè)定各管ACP的酶活力和蛋白質(zhì)含量，收集活性較高的酶液。

1.2.4 Superdex-200凝膠過濾層析

Superdex-200凝膠層析柱經(jīng)50 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液（ph 5.0，內(nèi)含10 mmol/L β-巰基乙醇）平衡后，取經(jīng)離子交換層析后所收集的活性較高的酶液上樣，每次5 mL，用50 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液（ph 5.0，內(nèi)含10 mmol/L β-巰基乙醇）進(jìn)行洗脫，流速為0.5 mL/min，每管收集3 mL。測(cè)定各管ACP的酶活力和蛋白質(zhì)含量，收集活性較高的酶液，4 ℃條件下透析24 h，冷凍干燥后，得到ACP純品，置于－20 ℃冰箱保存，用于電泳及酶學(xué)性質(zhì)研究。

1.2.5 芫荽ACP純度鑒定及分子質(zhì)量測(cè)定

通過SDS-PAGE對(duì)凝膠過濾層析后獲得的ACP進(jìn)行純度鑒定，分別制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的濃縮膠和12%的分離膠，上樣量為10 μL，經(jīng)SDS-PAGE和凝膠過濾層析分別測(cè)定芫荽ACP的亞基分子質(zhì)量和全酶分子質(zhì)量[11]。

1.2.6 芫荽ACP活力的測(cè)定

芫荽ACP活力測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[12]略有改進(jìn)：體系包含1 mL 5 mmol/L PNPP、1 mL 10 mmol/L MgSO4、3 mL 0.2 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液（ph 5.2，內(nèi)含5 mmol/L β-巰基乙醇）、100 μL酶液；混勻后，于35 ℃條件下反應(yīng)10 min后加入2.5 mL 0.2 mol/L NaOH終止反應(yīng)。以滅活的酶液代替原酶液做為對(duì)照調(diào)零，在420 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。根據(jù)對(duì)硝基苯酚（p-nitrophenol，PNP）標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]計(jì)算產(chǎn)物生成量。酶活力單位（U）定義為在以上反應(yīng)條件下，每10 min催化底物PNPP水解生成1 μmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

1.2.7 芫荽ACP蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用紫外分光光度法和考馬斯亮藍(lán)染色法（Bradford法）對(duì)芫荽ACP的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定[11]。

1.2.8 芫荽ACP酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.8.1 最適反應(yīng)ph值和ph值穩(wěn)定性

將反應(yīng)體系中的緩沖液替換為不同ph值（3.0、4.0、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、7.0、8.0）的緩沖液，其他條件均保持一致，測(cè)定芫荽ACP酶活力，以酶活力最高值為100%，計(jì)算其他各ph值條件下的相對(duì)酶活力，以確定芫荽ACP的最適反應(yīng)ph值。將純化后的芫荽ACP酶液分別置于不同ph值（3.0、4.0、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、7.0、8.0）的緩沖液中靜置4 h后，測(cè)定芫荽ACP的酶活力，以酶活力最高值為100%，計(jì)算其他各ph值條件下的相對(duì)酶活力，以研究該酶的ph值穩(wěn)定性。

1.2.8.2 最適反應(yīng)溫度與熱穩(wěn)定性

在不同反應(yīng)溫度 （20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85 ℃）條件下，其他條件均保持一致，測(cè)定芫荽ACP的酶活力，以酶活力最高值為100%，計(jì)算其他溫度條件下的相對(duì)酶活力，以確定芫荽ACP的最適反應(yīng)溫度。將純化后的芫荽ACP酶液分別置于不同溫度（20、30、40、50、60、70 ℃）條件下保溫不同時(shí)間后，測(cè)定芫荽ACP的酶活力，以酶液不保溫時(shí)的酶活力為100%，計(jì)算不同反應(yīng)溫度條件下的相對(duì)酶活力，以研究該酶的熱穩(wěn)定性。

1.2.8.3 米氏常數(shù)（Km）的測(cè)定

配制不同濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mmol/L）的PNPP，在55 ℃、ph 5.8的條件下測(cè)定芫荽ACP的酶活力，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法[13]計(jì)算出芫荽ACP的Km值。

1.2.8.4 不同有機(jī)溶劑對(duì)芫荽ACP活性的影響

將體積分?jǐn)?shù)為10%、20%、30%、40%、50%的甲醇、乙醇、異丙醇和純化后的芫荽ACP酶液等體積混合，于4 ℃冰箱中靜置1 h，測(cè)定酶活力，以酶液中不加有機(jī)溶劑時(shí)的活力為100%，計(jì)算在不同條件下，芫荽ACP的相對(duì)酶活力。

1.2.8.5 不同金屬離子對(duì)芫荽ACP活性的影響

將11 種不同濃度（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L）的金屬離子溶液和純化后的芫荽ACP酶液等體積混合后，于4 ℃冰箱中靜置1 h，測(cè)定酶活力，以酶液中不加金屬離子時(shí)的活力為100%，計(jì)算在不同條件下芫荽ACP的相對(duì)酶活力。

1.2.8.6 不同化合物對(duì)芫荽ACP活性的影響

將不同濃度（10、20、30、40、50 mmol/L）的EDTA、草酸、尿素、抗壞血酸和純化后的芫荽ACP酶液等體積混合，于4 ℃冰箱中靜置1 h，測(cè)定酶活力，以酶液中不加化合物時(shí)的活力為100%，計(jì)算在不同條件下，芫荽ACP的相對(duì)酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 芫荽ACP的分離純化結(jié)果

圖1 芫荽ACP的CM-Sepharose離子交換層析結(jié)果Fig.1 CM-Sepharose ion-exchange chromatography of ACP from cilantro

芫荽ACP粗酶液經(jīng)CM-Sepharose離子交換層析以及Superdex-200凝膠過濾層析后，結(jié)果如圖1、2所示，經(jīng)過CM-Sepharose離子交換層析后，酶活性較高的峰主要集中在第38～46管，其中第42管的酶活力最高；由圖2可知，經(jīng)過Superdex-200凝膠過濾層析后，酶活性較高的峰主要集中在第31～37管，其中第33管酶活力最高；收集酶活性較高的各管酶液；經(jīng)透析、冷凍干燥及濃縮后上樣SDS-PAGE檢測(cè)，顯示為單一條帶（圖3），表明芫荽ACP達(dá)到了電泳純；該酶的整個(gè)純化過程及其結(jié)果如表1所示，最終得到芫荽ACP純品的酶比活力為295.87 U/mg、酶活回收率為14.20%、純化倍數(shù)為238.60 倍。

圖2 芫荽ACP的Superdex-200凝膠過濾層析結(jié)果Fig.2 Superdex-200 chromatography of ACP from cilantro

圖3 芫荽ACP的SDS-PAGE圖Fig.3 SDS-PAGE of ACP from cilantro

表1 芫荽ACP的純化結(jié)果Table 1 Purification of ACP from cilantro

2.2 芫荽ACP的分子質(zhì)量

經(jīng)過SDS-PAGE測(cè)得芫荽ACP的亞基分子質(zhì)量約為53.8 kD，經(jīng)過Superdex-200凝膠層析測(cè)得其全酶分子質(zhì)量約為56.2 kD（圖4），由此可推測(cè)芫荽ACP為單亞基酶。

圖4 Superdex-200凝膠過濾層析測(cè)得芫荽ACP全酶分子質(zhì)量Fig.4 Molecular weight estimation of ACP by Superdex-200 gel filtration chromatography

2.3 芫荽ACP的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 芫荽ACP的最適反應(yīng)ph值和ph值穩(wěn)定性

圖5 芫荽ACP的最適pH值和pH值穩(wěn)定性Fig.5 Effect of pH on the activity of ACP from cilantro and its pH stability

如圖5A所示，在ph 5.0～6.0之間，芫荽ACP具有較高的活力，當(dāng)ph值為5.8時(shí)，芫荽ACP活力最高，因此，該酶的最適ph值為5.8；當(dāng)ph值小于3.0和大于8.0時(shí)，芫荽ACP幾乎完全失活。其原因可能是過高或過低的ph值會(huì)影響酶分子側(cè)鏈上極性基團(tuán)以及帶電狀態(tài)，從而導(dǎo)致該酶活性中心構(gòu)象發(fā)生改變；影響酶與底物的結(jié)合，因?yàn)楫?dāng)酶催化底物反應(yīng)時(shí)，底物分子上的某些基團(tuán)需處于一定的解離狀態(tài)，而ph值的改變抑制了這些基團(tuán)的解離，從而使酶的催化速率急劇降低[14]。如圖5B所示，芫荽ACP在ph 4.0～7.0范圍內(nèi)放置4 h后，依然保持了較高的活性，這表明芫荽ACP耐受酸性環(huán)境。

2.3.2 芫荽ACP的最適反應(yīng)溫度與熱穩(wěn)定性

如圖6A所示，芫荽ACP在20～55 ℃之間，酶活力隨著溫度的升高而增大，當(dāng)溫度為55 ℃時(shí)，芫荽ACP活力最高，當(dāng)溫度高于55 ℃后，酶活力逐漸降低，因此，該酶的最適反應(yīng)溫度為55 ℃，在50～70 ℃范圍內(nèi)，芫荽ACP活力均保持較高水平（90%左右）。如圖6B所示，將芫荽ACP在不同的溫度體系中保溫不同時(shí)間，隨著保溫時(shí)間的延長(zhǎng)，芫荽ACP均表現(xiàn)出活力減小的趨勢(shì)，在20～50 ℃范圍內(nèi)，保溫2 h后芫荽ACP活力均保持在50%以上；在60 ℃體系中保溫2 h后，芫荽ACP活力幾乎完全喪失；當(dāng)溫度超過60 ℃時(shí)，芫荽ACP活力急劇下降，1 h之內(nèi)活力完全喪失。原因是該酶在適當(dāng)?shù)臏囟葪l件下會(huì)降低反應(yīng)的活化能，從而提高反應(yīng)速率，然而酶的本質(zhì)是具有催化功能的蛋白質(zhì)，所以過高的溫度會(huì)使酶蛋白分子的天然構(gòu)象被破壞，導(dǎo)致酶分子變性，從而催化功能喪失[15]，由此可推斷，該酶對(duì)溫度較敏感，在50 ℃以下時(shí)較穩(wěn)定。

圖6 芫荽ACP的最適溫度和熱穩(wěn)定性Fig.6 Effect of temperature on activity of ACP from cilantro and its thermal stability

2.3.3 芫荽ACP的米氏常數(shù)

圖7 雙倒數(shù)法測(cè)得芫荽ACP的米氏常數(shù)Fig.7 Kmof ACP from cilantro estimated by Lineweaver-Burk plot

如圖7所示，芫荽ACP的Km值為0.63 mmol/L，表明該酶在反應(yīng)過程中，與底物PNPP具有較高的親和力。

2.3.4 不同有機(jī)溶劑對(duì)芫荽ACP活性的影響

圖8 不同有機(jī)溶劑對(duì)芫荽ACP活力的影響Fig.8 Effects of various organic solvents on the activity of ACP from cilantro

如圖8所示，隨著有機(jī)溶劑甲醇、乙醇、異丙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，芫荽ACP活力均出現(xiàn)下降趨勢(shì)，主要原因可能是芫荽ACP與底物的接觸受到擴(kuò)散限制的影響；酶分子的構(gòu)象主要由靜電作用力、范德華力、疏水作用以及氫鍵構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)來(lái)維持，有機(jī)溶劑缺乏提供多種氫鍵的能力，而且由于它們的低介電常數(shù)往往會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)帶電基團(tuán)之間更強(qiáng)的靜電作用，因而酶在有機(jī)溶劑中活性較低[16]。

2.3.5 不同金屬離子對(duì)芫荽ACP活性的影響

圖9 不同金屬離子對(duì)芫荽ACP活力的影響Fig.9 Effects of various metal ions on the activity of ACP from cilantro

如圖9所示，在不同濃度條件下，同一種金屬離子和不同金屬離子對(duì)芫荽ACP均表現(xiàn)出不同的作用結(jié)果。Mg2+、Mn2+、Ba2+、K+對(duì)該酶具有一定的激活作用，且隨著濃度的增加，激活作用越顯著，主要原因可能是這4 種金屬離子在酶與底物之間起到了橋梁的作用，形成了酶-金屬離子-底物的三元復(fù)合物，從而更有利于底物與酶活性中心的結(jié)合；Li+、Co2+、Ca2+、Cd2+隨著其濃度的增加，對(duì)該酶的抑制作用越顯著，主要原因可能是這些金屬離子影響了酶的空間結(jié)構(gòu)，從而使酶活性降低；Cu2+、Pb2+、Ag+對(duì)該酶具有強(qiáng)烈的抑制作用，原因可能是這3 種重金屬離子破壞了酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)或者與酶形成了絡(luò)合物，從而導(dǎo)致該酶變性失活。

2.3.6 不同化合物對(duì)芫荽ACP活性的影響

圖10 不同化合物對(duì)芫荽ACP活力的影響Fig.10 Effects of various compounds on the activity of ACP from cilantro

如圖10所示，低濃度的EDTA對(duì)芫荽ACP活性具有激活作用，但當(dāng)EDTA濃度超過10 mmol/L時(shí)，對(duì)該酶開始表現(xiàn)出抑制作用，原因可能是EDTA是一種金屬螯合劑，高濃度時(shí)會(huì)螯合對(duì)該酶的催化活性具有促進(jìn)作用的Mg2+，從而導(dǎo)致芫荽ACP活性的降低；尿素對(duì)該酶的抑制作用較弱；抗壞血酸對(duì)該酶具有較強(qiáng)的抑制作用；草酸對(duì)該酶具有強(qiáng)烈的抑制作用，當(dāng)濃度達(dá)到40 mmol/L時(shí)，該酶的活性已經(jīng)完全喪失。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)選取的材料為新鮮芫荽，經(jīng)過一系列的純化過程從中分離純化出了ACP。在純化過程中，由于經(jīng)過CM-Sepharose離子交換層析后所收集到的酶液活性較高，未經(jīng)冷凍干燥即可直接上Superdex-200凝膠過濾層析柱，實(shí)驗(yàn)步驟更為簡(jiǎn)便，同時(shí)減少了酶活力的損失，酶活回收率達(dá)到14.20%，高于綠豆（4%）[12]、韭菜（10.5%）[17]及甘薯葉（3.5%）[18]中的ACP酶活回收率；純化倍數(shù)達(dá)238.60，高于綠豆（156.3 倍）[12]，甘薯葉（169.07 倍）[18]中的ACP純化倍數(shù)。

芫荽ACP的亞基分子質(zhì)量為53.8 kD，與斑玉蕈（65 kD）[19]、韭菜（58.97 kD）[17]中的ACP亞基分子質(zhì)量相接近，但低于海參（147.9 kD）[20]、蚯蚓（113 kD）[21]和意大利蜂工蜂（135 kD）[8]中的ACP亞基分子質(zhì)量，這表明來(lái)源不同的ACP分子結(jié)構(gòu)具有物種特異性；芫荽ACP對(duì)PNPP的Km值為0.63 mmol/L，高于草魚（0.232 mmol/L）[9]與甘薯葉（0.258 mmol/L ）[18]中ACP的Km值，接近于韭菜（0.896 mmol/L）[17]和背角無(wú)齒蚌（0.73 mmol/L）[22]中ACP的Km值，這表明不同來(lái)源的ACP對(duì)底物的親和力具有一定的差異性，可能是因?yàn)樯矬w為了更好地適應(yīng)環(huán)境以及滿足生長(zhǎng)代謝的需求，從而產(chǎn)生出了多種ACP同工酶[17]。

芫荽ACP的最適反應(yīng)ph值為5.8，與綠豆和甘薯葉（ph 5.2）[12,18]、洋蔥（ph 5.7）[23]、韭菜（ph 5.4）[17]、麥芽（ph 5.0）[24]中的ACP最適反應(yīng)ph值相近，高于刺參（ph 4.4）[25]、背角無(wú)齒蚌（ph 4.8）[22]和樹狀多節(jié)孢（ph 3.0）[10]中的ACP最適反應(yīng)ph值，這表明不同來(lái)源的ACP對(duì)ph值的適應(yīng)性具有一定的差異，且通過對(duì)芫荽ACP的ph值穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)酸堿具有較廣的耐受范圍；該酶的最適反應(yīng)溫度為55 ℃，低于韭菜和甘薯葉（65 ℃）[17-18]中ACP的最適反應(yīng)溫度，高于綠豆（40 ℃）[12]、草魚和刺參（45 ℃）[9,25]、背角無(wú)齒蚌（50 ℃）[22]中的ACP最適反應(yīng)溫度，且通過對(duì)芫荽ACP的熱穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)溫度的敏感性較強(qiáng)。

本研究表明，不同的金屬離子對(duì)芫荽ACP的活性有不同的影響：Mg2+、Mn2+、Ba2+、K+對(duì)芫荽ACP具有一定的激活作用，與文獻(xiàn)報(bào)道中草魚ACP[9]、仿刺參ACP[26]以及甘薯葉ACP[18]一致；Li+、Co2+、 Ca2+、Cd2+對(duì)該酶的具有一定的抑制作用；Cu2+、Pb2+、Ag+對(duì)該酶具有強(qiáng)烈的抑制作用，且在低濃度時(shí)就已導(dǎo)致該酶完全失活，與斑玉蕈ACP[19]以及海參ACP[20]相符；而在關(guān)于洋蔥[23]和黑綠豆[27]ACP的報(bào)道中，Mg2+對(duì)其具有抑制作用，這表明同一種金屬離子對(duì)不同物種來(lái)源的ACP活性有著不同的影響。

通過對(duì)芫荽ACP與來(lái)源于不同動(dòng)植物組織中的ACP進(jìn)行比較后，發(fā)現(xiàn)ACP在酶學(xué)性質(zhì)上存在一定的差異性，可能是因?yàn)椴煌锓N中的ACP會(huì)隨著生物體組織器官代謝環(huán)境的變化而變化，以滿足不同的生長(zhǎng)代謝需求以及更好地參與動(dòng)植物體內(nèi)生理功能的調(diào)節(jié)過程，這是生物體在自然選擇過程中基因選擇性表達(dá)的結(jié)果。

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Isolation, Purification and Characterization of Acid Phosphatase from Cilantro

WANG Dan, WAN Ji, FU Ting, TANG Yunming*
(Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education, Key Laboratory of Freshwater Fish Reproduction and Development, Ministry of Education, School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Electrophoresis-purity acid phosphatase (ACP) from cilantro was obtained by homogenization, buffer solution extraction, ammonium sulfate fractional precipitation, CM-Sepharose ion exchange chromatography and Superdex-200 gel filtration. The results showed that after purification the recovery rate of ACP activity was 14.20% with a purification fold of 238.60, and the specific activity of ACP was 295.87 U/mg. The subunit molecular mass of the enzyme was approximately 53.8 kD. The characterization of ACP illustrated that the optimal reaction temperature was 55 ℃, and it was stable in the range of 20–50 ℃. Therefore, the enzyme was sensitive to temperature. The optimal reaction pH was 5.8, and it was relatively stable in the range of pH 4.0–7.0. The enzyme showed tolerance to acidic environment. Its Kmwas 0.63 mmol/L towards p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate, indicating high affinity between the enzyme and the substrate. The enzyme activity of ACP could be strongly inhibited by methanol, ethanol, isopropanol, ascorbic acid, oxalic acid and Cu2+, Pb2+and Ag+, while it could be enhanced to some extent by Mg2+, Mn2+, Ba2+and K+.

cilantro; acid phosphatase; isolation and purification; enzymatic properties

Q946.5

A

1002-6630（2015）21-0162-06

10.7506/spkx1002-6630-201521031

2014-12-23

重慶市科委重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（CSTC, 2011AB1027）

王丹（1991—），女，碩士研究生，主要從事蛋白質(zhì)與酶工程研究。E-mail：wdswu911@163.com

*通信作者：唐云明（1960—），男，教授，博士，主要從事蛋白質(zhì)與酶工程研究。E-mail：tbright@swu.edu.cn